Trp53 null en R270H mutante allelen hebben vergelijkbare effecten in het reguleren van invasie, metastase, en genexpressie in muis dikke darm tumorigenese

Missense en null Trp53 mutaties bevorderen muis dikke darm tumorprogressie in CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) muizen

Om een muismodel voor dikke darmtumoren te ontwikkelen dat wordt geïnitieerd door gendefecten zoals die vaak voorkomen in menselijke dikke darmtumoren, genereerden we samengestelde mutantmuizen die één floxed Apc allel (Apcflox, 580S, afgekort als A) dat geïnactiveerd kan worden door Cre recombinase functie en een floxed, latent oncogeen allel van Kras (KrasLSL-G12D, afgekort als K) dat geactiveerd kan worden door Cre recombinatie. Met behulp van het CDX2P-CreERT2 transgen en TAM behandeling om Cre functie in colon epitheelcellen te activeren, richtten we de Apc en Kras allelen in epitheel van het distale ileum, cecum en colon. Terwijl CDX2P-CreERT2 K muizen gekarteld en hyperplasisch colon epitheel vertonen, hadden de CDX2P-CreERT2AK (AK) muizen gekarteld en hyperplastisch colon epitheel en ontwikkelden ook een gemiddelde van 13 adenomen variërend in grootte van 0,5 mm tot 2 mm tegen de tijd dat humane eindpunten werden bereikt voor de muizen op 10-15 maanden na TAM behandeling (Fig. 1a). In zes van de 10 AK muizen vonden we één of twee adenocarcinomen die in de blindedarm ontstonden. Van de in totaal acht adenocarcinomen die in de 10 onderzochte AK muizen werden gevonden, vielen zeven tumoren in de muscularis propria (MP) of dieper binnen en vijf bereikten de sub-serosa of serosa (Fig. 1b, Tabel 1 en Aanvullende Tabel 1). Echter, omdat slechts 8 van de 131 waargenomen tumoren in de AK muizen invasief waren, impliceren de bevindingen dat bijkomende somatische defecten naast Apc en Kras mutaties nodig waren voor de ontwikkeling van invasieve dikke darm tumoren in de AK muizen.

Missense en null Trp53-mutaties bevorderen de progressie van tumoren in de dikke darm bij muizen met CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Kaplan-Meier overlevingscurves van CDX2P-CreERT2AK (AK) muizen (n = 10, mediane overleving = 336 dagen), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) muizen (n = 16, mediane overleving = 166 dagen), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl)-muizen (n = 16, mediane overleving = 97 dagen) en CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl)-muizen (n = 20, mediane overleving = 88 dagen). TAM werd dagelijks toegediend gedurende twee dagen en tijdstip nul vertegenwoordigt de tweede van deze dagen. P-waarden werden verkregen door log-rank test in de volgende vergelijkingen: P = 1,4E-6 voor AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 voor AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 voor AKP270/fl vs. AKP270/+. b Percentage darmtumoren met verschillende invasiedieptes van AK-muizen, AKP270/+ muizen, AKPfl/fl muizen en AKP270/fl muizen. Gegevens zijn van meerdere laesies per muis (n = 10-14 muizen per groep). P-waarden op basis van Fisher Exact tests en Exact Poisson tests zijn weergegeven in tabel 1 en aanvullende tabel 1, respectievelijk. Foutbalkjes zijn standaardfout van het gemiddelde. A adenoom, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van representatieve invasieve tumoren van proximale colon (rechts) en cecum (links) weefsel worden getoond voor AKP270/fl muizen (c) en AKPfl/fl muizen (d). Tumoren in (c) en (d) werden verzameld 3 maanden na TAM injectie. Beelden met een hoge vergroting worden getoond in de onderste panelen en zijn ingekaderd in de lagere vergrote gebieden in de overeenkomstige bovenste panelen. De stippellijnen geven de grens aan tussen de spierlaag en de subserosa. Schaalbalken: 500 pm voor lage vergroting beeld (bovenste panelen); 100 urn voor hoge vergrotingsbeelden (onderste panelen)

Zoals hierboven vermeld, worden TP53-mutaties aangetroffen in ongeveer 60% van de humane CRC’s en lijken ze te worden geselecteerd tijdens de progressie van adenoom-carcinoom. Wij trachtten de samenwerking van Trp53 inactivatie met Apc en Kras mutaties in dikke darm tumor progressie in vivo te beoordelen, alsmede om te bepalen of potentiële GOF effecten van een Trp53 missense mutant allel in het model konden worden gezien. We introduceerden een constitutief Trp53R270H mutant allel (het muizen equivalent van de menselijke R273H, aangeduid als P270) en / of een voorwaardelijke null allel Trp53flox (aangeduid als Pfl) in het AK model. Muizen met samengestelde genotypen werden gegenereerd en hun afkortingen zijn als volgt: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+ muizen), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl muizen), en CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl muizen). Cohorten van volwassen AKP270/+, AKP270/fl, en AKPfl/fl muizen werden geïnduceerd voor darmtumoren via TAM behandeling en hun gezondheidsstatus werd gemonitord. Vergeleken met AK muizen (mediane overleving = 336 dagen), hadden de AKP270/+, AKP270/fl, AKPfl/fl muizen allemaal een significant kortere levensduur. De AKP270/fl en AKPfl/fl muizen hadden een mediane overleving van respectievelijk 88 en 97 dagen, en AKP270/+ muizen hadden een mediane overleving van 166 dagen (Fig. 1a). De AKP270/+ muizen hadden een significant langere overleving dan AKP270/fl en AKPfl/fl muizen (P < 0,0001 voor elk vergeleken met AKP270/+ muizen), maar geen statistisch significant verschil in overleving werd gezien bij het vergelijken van AKP270/fl en AKPfl/fl muizen (Fig. 1a). De toevoeging van de Trp53 mutatie(s) (R270H of null) verhoogde de totale tumorincidentie aanzienlijk ten opzichte van die gezien in AK muizen (P < 0,0001 voor zowel AKPfl/fl en AKP270/fl, in vergelijking met AK muizen, Aanvullende Tabel 1 linksonder). AKP muizen hadden ook meerdere dikke darm en blindedarm tumoren die invasieve kenmerken vertoonden (7,3 en 8,9 invasieve tumoren per muis voor AKPfl/fl muizen en AKP270/fl muizen, respectievelijk) in vergelijking met AK muizen (0,8 invasieve tumoren per muis; Fig. 1b en Supplementary Table 1 rechtsboven, P < 0,0001 voor zowel AKPfl/fl vs. AK en AKP270/fl muizen, P < 0,0001 voor zowel AKPfl/fl vs. AK en AKP270/fl muizen. AK en AKP270/fl vs. AK vergelijkingen).

Diepgaande analyse van cecum- en colonweefsel van de muis, verkregen bij necropsie, definieerde de uitgebreide tumorlast in de AKP270/+, AKPfl/fl, en AKP270/fl muizen, met laesies variërend van adenomen tot laat-stadium adenocarcinomen (Fig. 1b-d en Tabel 1). Alle onderzochte AKP270/+, AKPfl/fl, en AKP270/fl muizen hadden tenminste één adenocarcinoom (tumoren met submucosa of diepere invasie). Bewijzen van invasie in gladde spieren en, in sommige gevallen, in de serosa werden gevonden in zowel cecum als proximale colon regio’s van de AKP270/fl en AKPfl/fl muizen (Fig. 1c, d, respectievelijk). De AKP270/+ muizen, waar Cre-gerichte epitheelcellen aanvankelijk één functioneel wild-type Trp53 allel behouden, hadden een langere latentieperiode voor tumorontwikkeling en de totale tumorlast (18,5 per muis) en de percentages tumoren met diepere invasie (11.9%) waren significant lager in vergelijking met AKP270/fl of AKPfl/fl muizen (Supplementary Table 1 en Tabel 1, P < 0,01 in vergelijking met AKP270/fl of AKPfl/fl muizen voor tumorlast per muis en de percentages van adenocarcinomas). Deze bevindingen ondersteunen het idee dat wild-type p53 een tumoronderdrukkende functie heeft in dikke darm tumorigenese, zelfs in de context van een Trp53 missense mutant allel. Toen alle waargenomen tumoren werden vergeleken tussen AKP270/fl en AKPfl/fl muizen, vonden we dat het aandeel adenocarcinomen met submucosa of diepere invasie hoger was in AKP270/fl muizen dan in AKPfl/fl muizen (36,9% en 26,1% voor AKP270/fl en AKPfl/fl muizen, respectievelijk; Tabel 1, P = 0,0026), wat een mogelijk bescheiden GOF effect suggereert voor het R270H Trp53 allel in het verbeteren van weefsel invasie. De bescheiden toename in invasief potentieel in AKP270/fl muizen kan echter gecompenseerd worden, omdat de gemiddelde tumorlast per muis trendmatig hoger was in AKPfl/fl muizen dan in AKP270/fl muizen (28,0 vs 24,2 per muis, P = 0.054; supplementaire tabel 1), en de AKPfl/fl en AKP270/fl muizen vertoonden geen significante verschillen in de incidentie van adenocarcinomen (7,3 vs 8,9 adenocarcinomen per muis, supplementaire tabel 1 rechtsboven, P = 0,16). Verder werd invasie van sommige tumoren in muscularis propria, subserosa, of serosa gezien in zowel AKP270/fl als AKPfl/fl muizen (Fig. 1b en Tabel 1). Omdat slechts ongeveer 30% van de tumoren van AKP270/fl of AKPfl/fl muizen tot adenocarcinomen evolueerden gedurende de studie periode, zijn bijkomende somatische veranderingen naast Apc, Kras, en Trp53 defecten waarschijnlijk cruciaal in het genereren van carcinomen in de AKP muizen.

Tumorhistologie en metastase in AKP270/fl of AKPfl/fl muizen

Elk van de AKP270/fl en AKPfl/fl muizen ontwikkelde een of meer adenocarcinomen tegen de tijd dat de humane eindpunten werden bereikt. In AKP270/fl muizen vertoonden meer dan 80% van de adenocarcinomen goed tot matig gedifferentieerde kenmerken, met tumorknoppen/uitlopers aan de invasiefront en incidentele mucine secretie (Fig. 2a, boven). Ongeveer 15-20% van de AKP270/fl adenocarcinomen waren slecht gedifferentieerd, met trabeculaire type vaste morfologie (Fig. 2a, midden). Zeldzame signet-ring cel carcinomen werden gezien in AKP270/fl muizen (Fig. 2a, onder). In AKPfl/fl muizen waren ongeveer 50% van de adenocarcinomen goed tot matig gedifferentieerd met mucine secretie (Fig. 2b, boven); de rest was slecht gedifferentieerd (Fig. 2b, onder). Sterke nucleaire en cytoplasmatische kleuring van β-catenine werd gezien in invasieve AKP270/fl en AKPfl/fl tumoren (Fig. 2, midden), consistent met defecte Wnt signalering als gevolg van Apc inactivatie. Sterke nucleaire kleuring voor p53 werd waargenomen in AKP270/fl tumorcellen. Zoals verwacht werd geen p53 kleuring waargenomen in AKPfl/fl tumorcellen (Fig. 2, rechts).

Histologische types van colon adenocarcinoma’s van p53 mutante muizen. H&E vlekken (linker panelen) en immunohistochemische vlekken voor β-catenine (midden panelen) en p53 (rechter panelen) worden getoond voor onafhankelijke colontumoren van representatieve histologische types van de AKP270/fl muizen (a) en AKPfl/fl muizen (b). Tumoren werden verzameld 3 maanden na TAM inductie. Schaalstaven: 50 μm

Bij de necropsie werden lymfekliermetastasen gevonden in 3 van de 13 AKPfl/fl muizen en 5 van de 14 AKP270/fl muizen (Tabel 2). Onder de drie AKPfl/fl muizen die elk een metastase naar een abdominale lymfeklier hadden, had één muis ook meerdere metastasen naar de long en een andere muis had meerdere metastasen naar de lever (Tabel 2). Van de vijf AKP270/fl muizen met elk een metastase naar een abdominale lymfeklier, had één muis meerdere metastasen naar de long en een andere muis had metastatische laesies in zowel de long als de lever (Tabel 2). Er werden geen metastatische laesies gevonden in AK of AKP270/+ muizen (Tabel 2). Onze gegevens wijzen erop dat muis CRCs met missense of null mutaties in Trp53 aanleiding kunnen geven tot spontane lymfeklier en verre metastasen met vergelijkbare frequenties, hetgeen pleit tegen een GOF effect voor missense Trp53 mutaties in het verbeteren van metastasering in ons muis CRC model.

Epitheliale-mesenchymale transitie in metastatische CRC’s met missense of null Trp53

In de afzonderlijke lymfekliermetastase-afzettingen die in elk van vijf verschillende AKP270/fl muizen werden aangetroffen, vier laesies vertoonden matig gedifferentieerd adenocarcinoom en één laesie was slecht gedifferentieerd (Fig. 3a, b, bovenste panelen). Alle matig gedifferentieerde lymfeklier metastatische laesies hadden sterke nucleaire β-catenine kleuring evenals sterke membraan kleuring voor E-cadherine en afwezige vimentine kleuring (Fig. 3a), wat wijst op behoud van epitheliale eigenschappen in AKP270/fl metastatische cellen die matig gedifferentieerde kenmerken behielden. In de AKP270/fl muis waar de lymfeklier metastase slecht gedifferentieerde kenmerken vertoonde, werden ook adenocarcinoom laesies met slecht gedifferentieerde morfologie gevonden in de long, lever, en blindedarm (Fig. 3b en Supplementary Fig. 1). De slecht gedifferentieerde cecum laesie en de metastatische laesies vertoonden sterke nucleaire β-catenine kleuring en verlies van E-cadherine expressie en sterke vimentine expressie, consistent met epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) kenmerken (Fig. 3b en supplementaire Fig. 1). Alle metastatische laesies in AKP270/fl muizen kleurden positief voor CDX2 (Supplementary Fig. 2), consistent met hun colon epitheliale oorsprong.

Colon-afgeleide metastatische tumoren met missense Trp53-mutaties kunnen een epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) ondergaan. Fotomicrofoto’s van H&E-bekleurde secties tonen de lymfeklier en longmetastasen gevonden in twee representatieve AKP270/fl muizen (a, b, bovenste panelen). Immunohistochemische kleuringen tonen sterke nucleaire expressie van β-catenine, sterke membraanexpressie van E-cadherine en afwezigheid van vimentine-expressie voor de matig gedifferentieerde laesies aangetroffen in één representatieve muis (a, onderste drie panelen). In tegenstelling, de slecht gedifferentieerde laesies gevonden in een andere muis (b) tonen sterke nucleaire expressie van β-catenine, verlies van E-cadherine expressie en sterke expressie van vimentine, wat aangeeft dat de metastatische laesies gevonden in deze muis EMT hebben ondergaan (b, onderste drie panelen). De representatieve fotomicrofoto’s van H&E-bekleurde secties werden getoond met een lage vergroting ter oriëntatie; de seriële secties werden onderworpen aan immunohistochemische kleuring en het omkaderde gebied met vlekken voor β-catenine, E-cadherine en vimentine werden getoond als een hoge vergroting. Schaalstaven: 20 μm voor alle beelden

Twee van de drie lymfekliermetastasen van tumordragende AKPfl/fl muizen waren matig gedifferentieerd en één was slecht gedifferentieerd (Fig. 4a, b, bovenste panelen). De AKPfl/fl muis met levermetastase had een matig gedifferentieerde lymfekliermetastase. In deze muis met levermetastase vertoonden zowel het vermoedelijke primaire adenocarcinoom van het colon als de lymfeklier- en levermetastaselaesies allemaal sterke nucleaire expressie van β-catenine en sterke membraanexpressie van E-cadherine (Supplementary Fig. 3). In de AKPfl/fl muis met een slecht gedifferentieerde lymfeklier metastase, werden ook meerdere laesies met een gelijkaardige morfologie gevonden in de longen (Fig. 4b). Immunohistochemische studies toonden aan dat de longmetastatische laesies en het vermoedelijke index primaire adenocarcinoom in de blindedarm allen sterke nucleaire expressie van β-catenine en verminderde E-cadherine expressie en sterke vimentine expressie hadden, consistent met EMT in de primaire kanker en metastatische cellen (Fig. 4b). De metastatische laesies in AKPfl/fl muizen waren allemaal CDX2-positief (Supplementary Fig. 4). Alles bij elkaar wijzen onze gegevens erop dat er geen significant verschil is in de histologische kenmerken van metastatische laesies die ontstaan in AKP270/fl muizen of AKPfl/fl muizen, en dat de slecht gedifferentieerde subset van de primaire tumoren en metastatische laesies met missense of null Trp53-mutaties EMT-kenmerken kunnen vertonen.

Colon-afgeleide metastatische tumoren met null Trp53 mutaties kunnen epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) ondergaan. a Fotomicrografiek van een H&E-gekleurde sectie die een matig gedifferentieerde tumorlaesie toont die werd aangetroffen in de lymfeklier van een representatieve AKPfl/fl muis 2,5 maand na TAM injectie (bovenste paneel). Immunohistochemische kleuringen voor deze laesie tonen sterke nucleaire expressie van β-catenine, sterke membraanexpressie van E-cadherine en afwezigheid van vimentine-expressie (onderste drie panelen). b Fotomicrofoto’s van H&E-gekleurde coupes tonen de slecht gedifferentieerde laesies gevonden in de blindedarm, lymfeklier, en long van een andere AKPfl/fl muis 4 maanden na TAM-injectie (bovenste paneel). Al deze laesies vertonen sterke nucleaire expressie van β-catenine, verlies van E-cadherine expressie en sterke expressie van vimentine, wat erop wijst dat de primaire en metastatische laesies gevonden in deze muis EMT hebben ondergaan (onderste drie panelen). De representatieve fotomicrofoto’s van H&E-bekleurde secties werden getoond met een laag vermogen vergroting voor oriëntatie; de seriële secties werden onderworpen aan immunohistochemische kleuring en het omkaderde gebied met vlekken voor β-catenine, E-cadherine en vimentine werden getoond als hoog vermogen vergroting. Schaalstaven: 20 μm voor alle beelden

Stabilisatie van missense mutant p53 eiwit is geassocieerd met verlies van wild-type p53 en ziekteprogressie

De meerderheid van menselijke tumoren met missense TP53 mutaties is gemeld dat TP53 verlies van heterozygositeit (LOH) vertonen, en een studie gaf aan dat TP53 LOH een voorwaarde is voor missense mutant p53 stabilisatie in zowel muis sarcomen en borstcarcinomen. Wij evalueerden p53 kleuringpatronen in verschillende stadia van tumorontwikkeling in AKP270/+ muizen na inductie van tumorigenese door TAM injectie, omdat het Cre-gerichte colonepitheel in AKP270/+ muizen aanvankelijk één functioneel Trp53 allel heeft. In hyperplastische poliepen in AKP270/ + muizen, waar Kras wordt geactiveerd en Apc LOH nog niet was opgetreden, p53 kleuring is niet-detecteerbaar (Fig. 5b, paneel HP), verwant aan de negatieve kleuring voor p53 gezien in het epitheel van wild-type muizen (Fig. 5a), ook al is de p53 R270H missense mutant eiwit constitutioneel tot expressie komt in de dikke darm weefsels van de AKP270/ + muizen. Enige p53 immunoreactiviteit werd duidelijk gezien in adenomen (Fig. 5b, panel adenoma en Tabel 3, n = 185) en carcinomen (Fig. 5c en Tabel 3, n = 28) ontstaan in AKP270/+ muizen. Onder deze tumoren vertoonden 94% van de adenomen en 43% van de carcinomen een zwakke p53 kleuring (Fig. 5 en Tabel 3, 5-10% positiviteit), terwijl 6% van de adenomen en 57% van de carcinomen een sterke p53 kleuring hadden (Fig. 5 en Tabel 3, >10% positiviteit, P < 0.0001). De meerderheid van de tumoren met sterke p53 kleuring vertoonden p53 LOH, terwijl de tumoren met zwakke p53 kleuring nog steeds het Trp53 wild-type allel behielden (Fig. 6). Onze resultaten zijn vergelijkbaar met die van recent onderzoek naar p53 missense protein expressie in sarcomen van muizen en borstcarcinomen. Onze gegevens tonen aan dat verwant aan de situatie in menselijke dikke darm tumorigenese , expressie van een gestabiliseerde missense mutant p53 eiwit is nauw gecorreleerd met verlies van wild-type p53 functie en progressie naar invasie.

De stabilisatie van p53R270H mutant eiwit tijdens tumorprogressie van hyperplasie tot carcinoom in AKP270/+ muizen. Immunohistochemische kleuring van p53 in een representatieve hyperplastische poliep (HP, b, linker paneel), een adenoom (b, rechter paneel) en drie carcinomen (c) ontstaan in de blindedarm van AKP270/+ muizen. Een sectie van de blindedarm van een wild-type muis werd gebruikt als controle (a). De p53-kleuring varieert van niet-detecteerbare kleuring in de normale (a) en HP (b) coupes, tot zwakke kleuring (<10% positiviteit) in het adenoom (b) en carcinoom 1 (c, linker paneel), en tot sterke kleuring in carcinoma 2 en 3 (>10% positiviteit). De stippellijnen geven de muscularis mucosae aan. Zwarte pijlen geven de invasieve klieren met zwakke p53 kleuring aan; rode pijlen geven de invasieve klier met sterke p53 kleuring aan. Schaalstaven: 50 μm

De stabilisatie van p53R270H missense mutant is gecorreleerd met p53 loss-of-heterozygosity (LOH). a Genotypering van dikke darmtumoren (T2-T6) ontstaan in AKP270/+ muizen 5 maanden na TAM inductie. Een tumor die in een AKP270/fl muis (T1) en colon weefsel van een wild-type muis (N) worden gebruikt als een positieve en negatieve controle, respectievelijk. De aanwezigheid van de Trp53 wild-type allel en gerecombineerd Trp53 mutant allel (flox out) werden gedetecteerd door PCR. b-e Immunohistochemische kleuring van p53 in colon weefsels beschreven in (a) tonen een sterke correlatie tussen mutant p53 stabilisatie (d, T2 en T3) en p53 verlies-van-heterozygotie, in vergelijking met de zwakke p53 kleuring en de aanwezigheid van Trp53 wild-type allel in tumoren 4-6 (e). De stippellijnen geven de muscularis mucosae aan. Schaalstaven: 100 pm

Globale genexpressie profilering onthult weinig verschillen tussen muis of mens colon tumorcellen harboring R270H/R273H missense mutant en null Trp53/TP53 allelen

We geprofileerd genexpressie in colon adenocarcinoom weefsels van AKP270/fl muizen (n = 6) of AKPfl/fl (n = 6) muizen, met behulp van Affymetrix Mouse ST 2.1 arrays met 24.562 probe-sets. We isoleerden RNA na laser capture microdissection (LCM) van kankercellen uit een invasieve primaire tumor van elke muis. Als controles werden gemicrodissecteerde normale colon epitheelcellen van wild-type muizen (n = 3) opgenomen. Wij pasten ANOVA modellen op deze 15 monsters met termen voor 3 middelen. Vergelijking van de tumorweefsels met normale weefsels gaf meer dan 2400 probe-sets met P < 0,001 voor zowel AKP270/fl als AKPfl/fl tumoren, maar vergelijking van de twee tumortypes met elkaar gaf slechts 30 probe-sets, waar we 24,6 probe-sets (24.562*0,001) alleen door toeval verwachten. Dit laatste resultaat geeft aan dat de meeste van de 30 gevonden probe-sets vals-positieven zijn (Tabel 4, bovenste gedeelte), en dat er weinig of geen significante waarneembare verschillen in genexpressie waren tussen colontumoren met Trp53 missense mutaties en die met Trp53 null mutaties. In overeenstemming met dit idee vonden we de AKP270/fl en AKPfl/fl adenocarcinomen niet te onderscheiden in principale component (PC) analyses van genexpressie, hoewel beide groepen tumoren genexpressiepatronen hebben die duidelijk onderscheiden zijn van wild-type colonepitheel (Supplementary Fig. 5).

We voerden ook Affymetrix genexpressieanalyse uit op organoïden afkomstig van darmtumoren die waren ontstaan in AKP270/fl muizen (n = 3) of AKPfl/fl muizen (n = 2). Organoïden afkomstig van adenomen in Apcfl/fl muizen (Cont 1, n = 3) of van wild-type colon epitheel (Cont 2, n = 4) werden gebruikt als controles. We pasten een ANOVA-model op de vier groepen van organoïden. We vonden 435 probe-sets met P < 0,001 voor AKPfl/fl organoïden en 609 probe-sets voor AKP270/fl organoïden, in vergelijking met Apc-null organoïden (Cont 1, Tabel 4). Bovendien werden meer differentieel tot expressie komende probe-sets geïdentificeerd (960 voor AKPfl/fl en 1332 voor AKP270/fl, P < 0,001) wanneer AKPfl/fl of AKP270/fl organoïden werden vergeleken met normale colon organoïden (Cont2, Tabel 4). We voerden een pathway enrichment test uit op genen die differentieel tot expressie kwamen in zowel AKPfl/fl als AKP270/fl tumoren en organoïden in vergelijking met normaal colon epitheel. We vonden dat een verscheidenheid van paden significant werden gewijzigd in zowel p53 null en missense mutant tumor-afgeleide cellen, met genen die betrokken zijn bij G2M-checkpoint, celgroei, stressrespons en celmetabolisme als de meest significant veranderde gen sets (Supplementary Table 2). We verkregen echter slechts 35 probe-sets met P < 0,001 voor AKPfl/fl vs. AKP270/fl vergelijking (Tabel 4), waar opnieuw 24,6 werden verwacht door toeval, waaruit blijkt dat het moeilijk was om genexpressie verschillen te vinden tussen de organoïden met null en missense Trp53 mutaties. PC-plots toonden aan dat AKPfl/fl en AKP270/fl monsters altijd samen geclusterd waren, en gescheiden van organoïden afkomstig van Apc-mutant adenomen (Cont1, supplementaire fig. 6) of normaal colon epitheel (Cont2, supplementaire fig. 6).

Om te testen of er aantoonbare verschillen in genexpressiepatronen waren tussen menselijke CRC’s met missense en null TP53-mutaties, analyseerden we log2-getransformeerde genormaliseerde tellingen van RNA-seq-gegevens voor CRC’s in The Cancer Genome Atlas (TCGA) , 9 tumoren met TP53 codon 273 missense mutaties vergeleken met 36 tumoren met null mutaties (veroorzaakt door frame shift, splice site, en nonsense mutaties, zie supplementaire tabel 3 voor details) met een twee-sample T-test voor 20531 genen. We vonden slechts 244 genen met P < 0.01 en 30 genen met P < 0.001, wat slechts iets meer was dan het aantal dat door toeval werd verwacht (205 en 20.5, respectievelijk, Tabel 4). TP53 zelf gaf het meest significante verschil in genexpressie, gemiddeld bijna 5-voudig lager in tumoren met null mutaties vs. TP53 codon 273 mutaties (supplementaire tabel 4, P = 2 × 10-10). Opnieuw vonden we weinig scheiding tussen de twee sets van tumoren in PC analyse (Supplementary Fig. 7). In overeenstemming met de vergelijkbare transcriptionele signatuur pasten wij Cox proportional hazards modellen op 43 patiënten met overlevingsgegevens, waarbij wij leeftijd, stadium en TP53 status in het model gebruikten, en vonden geen significante associatie tussen het resultaat van de patiënt en TP53 mutatiestatus (R273 missense mutatie vs. null mutatie, supplementaire tabel 5, P = 0,67 met Wald test). Het is vermeldenswaard dat met slechts 7 sterfgevallen onder deze patiënten, de power om verschillen te detecteren vrij laag was. Tenslotte keken we naar de intersectie van genen die P < 0.05 gaven in een van de drie hierboven beschreven datasets (d.w.z. menselijke en muis dikke darm tumoren, muis dikke darm organoïden) die in dezelfde richting veranderden voor Trp53/TP53 missense vs. null vergelijking. In supplementaire tabel 4 tonen we genen die P < 0,05 en vouw-veranderingen van ten minste 1,3 in een van de drie data sets gaf. We vonden alleen Trp53/TP53 dat in alle drie de studies in dezelfde richting veranderde (aanvullende tabel 4; de gedetailleerde statistieken voor elk gen in alle drie de datasets is beschikbaar in onze openbare GEO-reeks). Alles bij elkaar genomen, geven onze genexpressie-analyses voor menselijke en muis CRC’s aan dat colontumoren met R270/R273 missense of null Trp53/TP53-mutaties zeer vergelijkbare genexpressieprofielen hebben, wat consistent is met de afwezigheid van grote verschillen in biologische kenmerken in de colontumoren en fenotypen die in vivo ontstaan in AKP270/fl en AKPfl/fl muizen.