Eenheid Definitie
Een eenheid restrictie-endonuclease-activiteit wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om een volledige digestie van 1 µg substraat-DNA (of fragmenten) te produceren in een totaal reactievolume van 50 µl in 60 minuten onder optimale testomstandigheden zoals vermeld voor elke restrictie-endonuclease.
Bepaling van de volumeactiviteit van restrictie-endonucleasen
Restrictie-endonuclease-activiteitstests worden uitgevoerd door verschillende enzymverdunningen toe te voegen aan de geschikte assaybuffer met 1 µg substraat-DNA. Na een incubatie van 60 minuten bij de juiste temperatuur wordt de ontsluiting gestopt en worden de DNA-monsters gevisualiseerd met agarosegel/ethidiumbromide-elektroforese. De meest verdunde enzymoplossing die een volledige ontsluiting geeft, wordt gebruikt om de activiteit in eenheden/µl te berekenen.
Merk op dat de activiteit afhankelijk is van het substraat en dat, wanneer met een nieuw substraat wordt gewerkt, het enzym moet worden getitreerd om de werkelijke of verwachte activiteit te bepalen.
Kwaliteitscontroles
De resultaten van alle kwaliteitscontroles worden vermeld op het technisch informatieblad dat bij elk enzym wordt geleverd.
Overdigestion Assay
Een overdigestion assay werd gebruikt als kwalitatieve bepaling van de zuiverheid van het enzym en van een gebrek aan niet-specifieke DNases. Bij de overdigestion assay worden toenemende hoeveelheden van elk restrictie-endonuclease (gewoonlijk 10, 20, 30, 40, 50 eenheden) toegevoegd aan een reeks buisjes die 1 µg substraat-DNA bevatten. Na een incubatie van 20 uur onder de aanbevolen testomstandigheden wordt met agarosegel/ethidiumbromide-elektroforese het maximumaantal eenheden bepaald dat een duidelijk, scherp, normaal banderingspatroon oplevert.
Om voor de test te slagen moet het enzym een onveranderd banderingspatroon opleveren onder omstandigheden van een tot 600-voudige overdigestie (eenheden x uren) in vergelijking met een 2-voudige digestie. Als het enzym “ster”-activiteit vertoont bij een functionele overmaat van minder dan 600 maal, bevat de beschrijving van het product informatie over de functionele overmaat waarbij de “ster”-activiteit niet optreedt.
Assay for Nonspecific Endonucleases
Om te testen op niet-specifieke endonucleasecontaminatie wordt elk restrictie-endonuclease geïncubeerd met een supercoiled plasmidesubstraat waarin de herkenningssequentie van het restrictie-endonuclease ontbreekt. Een enkele nonspecifieke inkeping in het RF I-DNA zet het om in de RF II-vorm (inkepingscirkel). Toenemende hoeveelheden enzym (gewoonlijk 10, 20, 30, 40, 50 eenheden) worden toegevoegd aan een reeks buisjes die 1 µg RF I (supercoiled vorm) DNA bevatten. Na een incubatie van 20 uur onder de aanbevolen testomstandigheden worden de twee vormen op agarosegels onderscheiden en wordt de procentuele omzetting van RF I in RF II bepaald.
Ligatie- en recutatietest
Een ligatietest werd gebruikt om de functionele zuiverheid van het DNA na restrictie-enzymatische digestie te bepalen. Substraat-DNA wordt volledig gedigesteerd met een 10- en 50-voudige overmaat van het restrictie-endonuclease in de geschikte assay-buffer, geligeerd met T4-DNA-ligase en opnieuw geknipt met hetzelfde restrictie-enzym. Verknipt, geligeerd en opnieuw geknipt DNA wordt geanalyseerd met agarosegel/ethidiumbromide-elektroforese. Een normaal banderingspatroon duidt op intacte 5- en 3-termini en de afwezigheid van verontreinigende nucleasen of fosfatasen.
Stabiliteit
Alle Jena Bioscience restrictie-endonucleasen worden elke 4-6 maanden opnieuw getest. Dit proces stelt ons in staat te zorgen voor volledige enzymactiviteit en optimale prestaties in elk enzym dat wij verzenden. Vanwege de uitstekende resultaten van deze tests hebben wij de houdbaarheidsdata van de meeste van onze enzymen verlengd tot 18 maanden.