In het HC-FIA systeem versterken probe DNA-functionalized FNPs het signaal van de hybridisatie van viraal RNA en het DNA in de probe. Het ontwerpprincipe van de HC-FIA-biosensor wordt getoond in Fig. 1.
a, Het principe van HC-FIA. b, Representatieve resultaten op een laterale stroomstrook. c) Het fluorescentieanalyseapparaat. d) Een foto van het draagbare kofferalaboratorium, dat een lengte heeft van 55,5 cm, een breedte van 37 cm en een hoogte van 23 cm, met een gewicht van 8,5 kg. e) Het testproces van de HC-FIA-test. Stap 1: hybridisatie van het nucleïnezuur in een incubator bij constante temperatuur. Stap 2: bepaling van de intensiteit van de fluorescentiesignalen op de testkaart met behulp van het onder c afgebeelde apparaat. f, Verdeling van de sonde in het genoom van SARS-CoV-2.
Ontwerp en werking van de HC-FIA-test
De muriene S9.6 monoklonale antilichamen zijn vooraf aangebracht op de testlijn (T) van de laterale stroomstrip, en de controlelijn (C) is gecoat met geiten anti-rabbit IgG polyklonale antilichamen (fig. 1a). Met S9.6-antilichamen en konijn-IgG gelabelde FNP’s worden in het reageerbuisje gebracht. Aan het begin van het detectieproces wordt het SARS-CoV-2 in het keelswab of sputummonster gelyseerd en vrijgemaakt, en het vrijgemaakte RNA hybridiseert met de specifieke SARS-CoV-2 DNA-probe. De resulterende RNA-DNA-hybride wordt gevangen door de met FNP gelabelde S9.6-antilichamen, en het complex vloeit onder capillaire krachten langs het monsterkussen en het nitrocellulosemembraan naar het absorberende papier. Bij het passeren van het T-gebied wordt het complex gevangen door de S9.6-antilichamen, waarbij geleidelijk een fluorescerend signaal wordt opgewekt. In het C-gebied wordt met FNP-gelabeld konijnen-IgG gevangen door het anti-rabbijnen-IgG. De aan- of afwezigheid van het doel-RNA voor SARS-CoV-2 is gebaseerd op een afkapwaarde voor de intensiteit van de fluorescentie (fig. 1b,c). Figuur 1d toont een draagbaar kofferlaboratorium dat in staat is kwalitatieve resultaten te leveren in minder dan een uur na de volgende twee stappen: hybridisatie en immunofluorescentieanalyse (Fig. 1e).
Hierbij gebruikten we de verhouding van het testfluorescentiesignaal tot het controlefluorescentiesignaal (T/C) op de laterale flow strip, zodat de invloed van eventuele achtergrondfluorescentie van de testkaart geminimaliseerd werd. Door de T/C-verhouding van keelswabmonsters van 211 gezonde personen te meten, vonden we dat de gemiddelde achtergrond-T/C-verhouding 49,95 was, met een s.d. van 17,16 (supplementaire fig. 1a). De ROC-curve (receiver operating characteristic) en het gebied onder de curve (AUC) werden gebruikt om de afkapwaarde te bepalen en de diagnostische nauwkeurigheid van de HC-FIA-test te beoordelen op basis van sensitiviteit en specificiteit bij verschillende drempelwaarden. We bepaalden een ROC-curve met een AUC van 0,999 met een 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) van 0,997-1,000 (Supplementary Fig. 1b) met gebruikmaking van keelswabmonsters van 100 klinisch bevestigde en uitgesloten COVID-19-gevallen. De afkapwaarde die de hoogste sensitiviteit en specificiteit verkreeg, werd bepaald op 102,07, wat overeenkomt met een Youden-indexpunt van 0,980. Als alternatief wordt gewoonlijk een drempelwaarde van tweemaal de negatieve achtergrondwaarde (hier 49,95 × 2 = 99,90) gebruikt als afkapwaarde in immunoassays. Voor het gemak kozen we een T / C cut-off waarde van 100,00.
HC-FIA assay ontwikkeling
Optimalisatie van DNA-probes voor de doel-RNA-sequentie van SARS-CoV-2 is de sleutel tot het verbeteren van de assay-efficiëntie. Een lijst van alle DNA-probe-sequenties die we hebben ontworpen is te vinden in de aanvullende tabel 1. Het genoom van SARS-CoV-2 omvat ongeveer 30.000 basen, waaronder een variabel aantal (6-11) open leesramen (ORF’s). De eerste ORF beslaat ongeveer 67% van het gehele genoom en codeert 16 niet-structurele eiwitten, alsmede helper-eiwitten en structurele eiwitten. De vier belangrijkste structurele eiwitten zijn het spike-glycoproteïne (S), het kleine enveloppe-eiwit (E), het matrix-eiwit (M) en het nucleocapside-eiwit (N)15,16. De meeste nucleïnezuurdetectietests voor SARS-CoV-2 maken gebruik van de volgende drie geconserveerde regio’s in het viraal genoom: ORF1ab, waarin zich het RNA-afhankelijke polymerase gen (rdrp) bevindt15, en de regio’s die coderen voor N en E.
We begonnen met het ophalen van de RNA-genoomsequentie van SARS-CoV-2 uit de National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (toetredingsnummers, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 en NC_045512.1). Een gedetailleerde analyse van andere gepubliceerde sequenties voor het SARS-CoV-2-genoom bracht geen opmerkelijke variatie in deze regio’s aan het licht. Met behulp van de ontwerp-software Primer Premier 5.0 ontwierpen wij drie probes voor elk van de drie regio’s: CoV01 en CoV04, gelegen in de aanbevolen regio voor het opsporen van respectievelijk ORF1ab en N; en CoV08, in dezelfde regio als E17. De genoomposities van de probebindingsplaatsen in de referentiegenoomsequentie (NC_045512.2) zijn aangegeven in fig. 1f.
Sequentiealignering werd uitgevoerd tussen de ontworpen DNA-probes en sequenties uit het menselijk genoom en uit de genomen van virussen, bacteriën, mycoplasma, chlamydia en andere veelvoorkomende ziekteverwekkers. De probes kwamen alleen overeen met de genomische sequentie van SARS-CoV-2, en we vonden geen homologie met menselijk genomisch DNA. Pseudovirussen met verschillende regio’s van het doelgen, geconstrueerd met lentivirussen als vectoren, werden als positieve controles gebruikt. De sequenties van de doelgenen van de gebruikte pseudovirussen zijn weergegeven in de aanvullende tabel 2. P1 was positief voor de SARS-CoV-2 N-regio, P2 voor de SARS-CoV-2 Eregio en P3 voor de SARS-CoV-2 ORF1ab-regio. De concentratie van de drie positieve controles was 3.000 transductie-eenheden (TU) ml-1, wat aangeeft dat er 3.000 besmettelijke virusdeeltjes per ml waren. Fysiologische zoutoplossing, gezuiverd water en farynxswabmonsters die positief waren voor andere veel voorkomende pathogenen werden gebruikt als negatieve controles van N1-N17. Een lijst met informatie over de in het onderzoek gebruikte positieve en negatieve referenties wordt gegeven in aanvullende tabel 3. De testresultaten zijn weergegeven in de supplementaire tabellen 4-6. Voor de ORF1ab-regio werden de probes CoV01 en CoV03 geselecteerd; voor de E-regio werd de probe CoV08 geselecteerd; en voor de N-regio bonden de probes CoV04 en CoV06 zich bij voorkeur aan het doel-RNA. De geselecteerde DNA-probes werden verder geoptimaliseerd door combinatie (aanvullende tabel 7), waarbij elke groep probes zich tegelijk op alle drie de segmenten richtte. Uit de resultaten van de HC-FIA-test in aanvullende tabel 8 blijkt dat de combinatie van de Cov01-, Cov04- en Cov08-probes (groep 2) onderscheid maakte tussen alle positieve controlemonsters en de negatieve controles, en positieve monsters detecteerde met een lage virale titer (1000 TU ml-1; aanvullende tabel 3, L1-L3) met een positief percentage van meer dan 95%. Groep 2 werd daarom als de definitieve combinatie geselecteerd. Tot op heden zijn er 13.411 SARS-CoV-2 nucleotidesequenties gepubliceerd op NCBI. Alignment van de drie probes met het corresponderende doelgebied in de 13.411 geuploade sequenties toonde aan dat de doelgebieden van de probes voldoende geconserveerd waren om 100% overeenkomst op te leveren.
We hebben ook de testcondities van de assay geoptimaliseerd, in het bijzonder de incubatietijd voor hybridisatie en de uitleestijd van de teststrip. De assay prestaties voor incubatietijden van 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min en 60 min bij 56 ° C wordt weergegeven in aanvullende tabel 9. Merk op dat 20 min. voldoende was voor de DNA-sondes om zich met het doelgebied te hybridiseren, hetgeen werd weerspiegeld door het 100%-positief percentage bij het detecteren van positieve keelswab- en sputummonsters met een lage virale titer (1.000 TU ml-1; aanvullende tabel 3, L1-L3). Wanneer de incubatietijd werd verlengd tot 50 of 60 min, was de reactie niet zo stabiel, aangezien het positieve percentage van de L1-L3-referentiemonsters afnam. Rekening houdend met de detectie-efficiëntie en de eis voor virusinactivatie, kozen we 30 min als incubatietijd voor hybridisatie bij 56 °C. Wij hebben ook de afleestijd van de strook beoordeeld voor de waarden 10 min, 12 min, 15 min en 18 min (aanvullende tabel 10). De resultaten gaven aan dat 12 min of langer leidde tot de juiste detectie van de positieve en negatieve referentiemonsters. De variatiecoëfficiënt (CV) was echter alleen bij een uitleestijd van 15 min. lager dan 10% voor het detecteren van positieve monsters met een lage virustiter. Daarom werd gekozen voor een afleestijd van 15 min.
Guanidiniumthiocyanaat en guanidinechloride – de meest gebruikte eiwitdenaturerende middelen voor nucleïnezuurextractie – werden vergeleken als transportmedia voor het bewaren van monsters. Guanidiniumthiocyanaat leidde tot betere prestaties bij het onderscheiden van positieve en negatieve monsters, met een relatief lage CV voor monsters met een lage virale titer. In feite heeft guanidiniumthiocyanaat in een concentratie tot 6 mol l-1 uitstekende antivirale eigenschappen aangetoond18. Wij selecteerden guanidiniumthiocyanaat bij een concentratie van 5 mol l-1 als eiwitdenaturatiemiddel voor virale inactivatie in transportmedium.
Specificiteit van de HC-FIA-test
Na optimalisering van de sondesequenties en reactieomstandigheden onderzochten wij de specificiteit van de HC-FIA-test voor het detecteren van SARS-CoV-2. De positieve controles omvatten pseudovirussen (monsters P1-P3) met doelgenen, en vijf klinische keelswabmonsters (monsters P4-P8), bevestigd met een op RT-qPCR gebaseerde nucleïnezuurdetectiekit (Shanghai ZJ Bio-Tech). De negatieve controles, die bestonden uit keelswabmonsters, werden negatief bevonden voor SARS-CoV-2, en positief voor influenza A, influenza B, respiratoir syncytieel virus, chlamydia pneumoniae, adenovirus of andere pathogenen (monsters N5-N17), of pseudovirus-positief voor de N-regio van MERS (monster N18) of SARS (monster N19). Een lijst van alle monsters is te vinden in aanvullende tabel 3. Een lijst van de detectieresultaten van 8 positieve referentiemonsters en 15 negatieve referentiemonsters wordt gegeven in aanvullende tabel 11.
We onderzochten of er kruisreactiviteit was tussen SARS-CoV-2 en 55 veelvoorkomende pathogenen die ademhalingsziekten veroorzaken. De bron en kwantitatieve informatie van elk pathogeen micro-organisme wordt verstrekt in Supplementary Dataset 1. De oorspronkelijke virustiter werd bepaald op 106 plaque-vormende eenheden per ml met behulp van een plaque-assay. Voor interferentiemonsters van bacteriën, mycoplasma en chlamydia was het concentratieniveau 107 kolonievormende eenheden per ml. Bovendien werd menselijk genomisch DNA geëxtraheerd en gekwantificeerd op 90-105 µg ml-1 uit drie volbloedmonsters. De HC-FIA-test vertoonde een uitstekende specificiteit voor SARS-CoV-2, zonder duidelijke kruisreactiviteit met alle andere pathogeenmonsters en menselijk genomisch DNA (aanvullende dataset 1).
Aangezien het monoklonale antilichaam S9.6 zich ook bindt aan RNA-RNA-duplexen19, met name AU-rijke20, ontwierpen we dubbelstrengs RNA-sequenties met variërende fracties van AU. Gedetailleerde sequentie informatie wordt gegeven in supplementaire tabel 12. Zoals blijkt uit aanvullende tabel 13, ongeacht de AU-inhoud, de HC-FIA assay niet vertonen een detecteerbaar positief signaal naar dubbelstrengs RNA, wat aangeeft dat er een lage bindingsaffiniteit tussen de S9.6 antilichaam en dubbelstrengs RNA onder de testomstandigheden. We hebben ook onderzocht of de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA de prestaties van de test beïnvloedt bij de detectie van klinische keelswab- of sputummonsters. We gebruikten 2 positieve keelswabmonsters, 2 positieve sputummonsters, 10 negatieve keelswabmonsters en 5 negatieve sputummonsters. Wij maten de T/C-verhoudingen ten opzichte van de T/C-waarden van de interferentievrije test, en vonden dat de verhoudingen varieerden tussen 0,9 en 1,1 (supplementaire dataset 1). Dit wijst erop dat de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA, ongeacht het AU-gehalte, geen significante invloed heeft op de prestaties van de HC-FIA-test.
Gevoeligheid en precisie van de HC-FIA-test
We hebben de pseudovirusmonsters die drie delen van de doelgenen bevatten, serieel verdund tot titers van 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 en 100 TU ml-1, en de gemiddelde T/C-waarden berekend voor 20 parallelle tests. Uit figuur 2a blijkt dat de aantoonbaarheidsgrens (LOD) van pseudovirus dat positief was voor de N-, E- of ORF1ab-regio’s van SARS-CoV-2 zo laag was als 1.000 TU ml-1, met een positief percentage van meer dan 95%. Wanneer de titers van pseudovirusmonsters 108 TU ml-1 bereikten, werd geen noemenswaardig haakeffect waargenomen (supplementaire fig. 2). Het lineaire bereik van de test komt overeen met titers tussen 103 en 106 of 107 TU ml-1.
De verticale assen geven de fluorescentie-intensiteitsverhouding (T/C) weer van het testsignaal (T) en het controlesignaal (C). Voor elke concentratie werden 20 tests parallel uitgevoerd. De LOD werd bepaald als de concentratie waarbij het positieve percentage groter of gelijk was aan 95%. a, T/C-verhoudingen voor serieel verdunde pseudovirusmonsters positief voor de N-, E- en ORF1ab-regio’s van SARS-CoV-2. b, T/C-verhoudingen voor serieel verdunde keelswabmonsters van drie kritisch zieke patiënten. Gegevens zijn gemiddelde ± s.d.
Keeluitstrijkjes van drie ernstig zieke patiënten – die positief werden bevonden voor SARS-CoV-2 met behulp van RT-qPCR, en waarvan de virale belasting werd gekwantificeerd met behulp van digitale PCR – werden gemengd met negatieve keeluitstrijkjes om seriële verdunningen van 2.000, 1.000, 500, 400 en 250 kopieën per ml te bereiden. Zoals getoond in Fig. 2b, was de LOD 500 kopieën per ml met een positief percentage van meer dan 95%. Klinische keelswabmonsters met T/C-waarden dicht bij de kritische waarde (100) voor positiviteit (monsters met 512, 489 en 497 kopieën per ml van de ORF1ab-regio, volgens de digitale PCR) werden gebruikt om de LOD te verifiëren (tests 20 keer parallel uitgevoerd). De positieve percentages van deze monsters waren hoger dan 95% (aanvullende tabellen 14-16).
Om de precisie van de HC-FIA kit te evalueren, werden voor elk klinisch keelswabmonster gedurende vijf opeenvolgende dagen 20 parallelle tests uitgevoerd. De gekozen representatieve klinische monsters waren een positief monster (1.348 kopieën per ml van de ORF1ab-regio), een monster van een ernstig ziek individu (kritiek; 512 kopieën per ml) en een negatief monster (0 kopieën per ml). De gemiddelde T/C-waarden van de drie partijen bij het opsporen van het positieve monster waren als volgt: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) en 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), respectievelijk, vergeleken met 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) en 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) voor het kritische monster, en met 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) en 44,72 ± 2,98 (CV = 6,18%) respectievelijk 199,03 ± 7,43 (CV = 3,94%) en 199,73%.66%) voor het negatieve monster. De batch-tot-batch CV-waarden waren 3,89%, 4,66% en 6,74%. De assay vertoonde dus een goede precisie en reproduceerbaarheid voor de detectie van SARS-CoV-2.
Robuustheid van de HC-FIA assay
Om de robuustheid van HC-FIA te leren kennen, evalueerden we de effecten van endogene interferentiestoffen (zoals hemoglobine en mucine) en van exogene interferentiestoffen (in het bijzonder klinische geneesmiddelen die gewoonlijk worden gebruikt bij de behandeling van patiënten met luchtweginfecties, waaronder antivirale geneesmiddelen, antibiotica en hormonen). Voor dit experiment gebruikten we 18 klinische keelswabmonsters, waaronder zes kritische monsters (500-530 kopieën per ml voor de ORF1ab-regio, volgens digitale PCR), zes negatieve monsters en zes positieve monsters. De resultaten werden ook geregistreerd als de verhouding van T/C-waarden (interferentiemonsters versus controlemonsters). In de bereide interferentiemonsters waren de hemoglobineconcentraties 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 en 2,0 g l-1, en de concentraties voor mucine 5 g l-1, 10 g l-1 en 20 g l-1. De geneesmiddelconcentraties van exogene interferentiemonsters (aanvullende tabellen 17-19) waren veel hoger dan hun piekplasmaconcentraties in vivo. Zoals verwacht lagen alle T/C-verhoudingen in het bereik van 0,9-1,1 (aanvullende dataset 2), hetgeen erop wijst dat de HC-FIA-test bestand is tegen interferentie.
Klinische evaluatie van de HC-FIA-testkit
Om de prestaties van de HC-FIA-test verder te evalueren, werd een gerandomiseerde dubbelblinde klinische studie uitgevoerd door de test te vergelijken met RT-qPCR (SARS-CoV-2-detectiekit geproduceerd door Shanghai ZJ Bio-Tech, en goedgekeurd door de NMPA) of met klinische diagnoseresultaten in drie onafhankelijke medische instellingen. De HC-FIA-testkit die bij de klinische evaluatie werd gebruikt, bevatte testkaarten, lysisbuffer, monsterconserveringsoplossing, positieve en negatieve controles, en een reageerbuisje met DNA-sondes en gelabelde antilichamen. De klinische diagnoseresultaten van bevestigde of uitgesloten COVID-19 gevallen, die door de aangewezen ziekenhuizen werden verstrekt, waren gebaseerd op computertomografiebeelden en op de klinische manifestaties van de patiënten, zoals gespecificeerd door de richtlijnen van “Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” van China. In totaal werden 734 monsters (593 keelswabs en 141 sputum), afkomstig van 670 personen, parallel getest. De ruwe gegevens van de klinische proeven worden verstrekt als Supplementary Dataset 3. De RT-qPCR detectiekit die wij gebruikten was ontworpen als een drie-doel (ORF, N en E) systeem, en wij volgden het test-hertest principe om onderscheid te maken tussen positieve en negatieve monsters. Naast vier mislukte tests veroorzaakt door een ongeldige interne standaard, werden acht hertesten uitgevoerd: één omdat slechts één rdrp-doelgen positief was, en zeven omdat alleen de N- en E-genen positief waren. In deze gevallen werden de eerdere negatieve resultaten buiten beschouwing gelaten.
Van de 670 patiënten die aan het onderzoek deelnamen, waren er 313 man (46,72%) en 357 vrouw (53,28%). Zoals blijkt uit aanvullende fig. 3, is de leeftijdsverdeling van de ingeschreven populatie vergelijkbaar met de leeftijdsverdeling van SARS-CoV-2-infectie21. Het bezoekpercentage en het diagnosepercentage waren ook in evenwicht. De resultaten van de HC-FIA-testkits zijn te zien in Fig. 3, met foto’s van typische resultaten onder een fluorescerende lichtbron en de bijbehorende gradiëntkleurenmatrix na normalisatie van de aflezing. De gradiëntkleurenmatrix in aanvullende fig. 4 toont de genormaliseerde fluorescentie-uitlezingen van 734 klinische monsters (aanvullende dataset 3).
Foto’s van typische resultaten onder een fluorescerende lichtbron, en de bijbehorende fluorescentie-uitlezingen als een kleurgradiëntmatrix, genormaliseerd naar de maximale uitleeswaarde. Groep E bestaat alleen uit COVID-19-negatieve resultaten. De horizontale lijn op de kleurenbalk geeft de afkapwaarde aan. Een kleurverloopmatrix voor de fluorescentie-uitlezingen van 734 klinische monsters wordt gegeven in aanvullende fig. 4, en de corresponderende numerieke gegevens in aanvullende dataset 3.
Voor 621 gevallen waren de HC-FIA-resultaten en de klinische diagnoses consistent (210 bevestigde gevallen en 411 uitgesloten gevallen; tabel 1); 49 gevallen (27 bevestigd en 22 uitgesloten door klinische diagnose) waren inconsistent met de HC-FIA-resultaten. Voor 730 monsters waren de resultaten van de HC-FIA-test consistent met RT-qPCR (249 positief en 481 negatief; tabel 1). Vier monsters die negatief waren op basis van RT-qPCR waren positief met HC-FIA. Drie van deze monsters waren afkomstig van patiënten bij wie de klinische diagnose COVID-19-uitsluiting was gesteld, wat erop wijst dat de HC-FIA-test vals-positieve resultaten had opgeleverd. Het resterende monster kwam overeen met een bevestigd geval door klinische diagnose, in overeenstemming met de HC-FIA test.
Cohen’s Kappa (κ), een vaak gebruikte metriek voor de betrouwbaarheid van overeenstemming tussen categorische variabelen, is een robuustere maat vergeleken met eenvoudige procentuele overeenstemming tussen de variabelen, aangezien κ rekening houdt met overeenkomsten die door toeval ontstaan, vooral in onevenwichtige datasets. Wij beschouwden een κ-waarde van meer dan 0,75 als een indicatie van een hoge mate van overeenstemming (perfecte overeenstemming komt overeen met een κ = 1). Zoals blijkt uit tabel 2, waren de resultaten van de HC-FIA-test in hoge mate in overeenstemming met de klinische diagnose (κ = 0,8393) en met RT-qPCR (κ > 0,98, ongeacht het type monster).
Geef een antwoord