Radiometric Ligand-Binding Assays | Application Support Knowledgebase | Lab Products & Services | PerkinElmer

top

Overview

Radioactieve liganden worden vaak gebruikt om de binding van liganden aan receptoren te meten. In deze test meet u de binding van een radioactief ligand aan cellen of celmembranen die een receptor van belang bevatten. Zowel hele cellen als celmembranen kunnen voor deze bepaling worden gebruikt. Radioliganden kunnen worden gebruikt om verzadigingscurven, competitie en kinetische experimenten uit te voeren.

Ligand-receptor binding

Bij het selecteren van een radioligand zijn er een paar factoren die je in gedachten moet houden:

• Hoge specifieke activiteit: Radioliganden met een hoge specifieke activiteit zijn zeer geschikt voor ligandbindingstests. De specifieke activiteit geeft aan hoeveel radioactiviteit er is per molecuul ligand, en wordt gewoonlijk gegeven in eenheden van Curies per millimol ligand. Verscheidene van onze met 125I gelabelde liganden worden bij maximale specifieke activiteit aangeboden (2200 Ci/mmol als één 125I-labellplaats beschikbaar is, 4400 Ci/mmol als twee 125I-labellplaatsen beschikbaar zijn, etc.). Dit betekent dat vrijwel elke molecule ligand in de voorraadflacon radioactief gelabeld is. Voor getritityleerde liganden (3H-liganden) kiest u idealiter een ligand met een specifieke activiteit van meer dan 20 Ci/mmol. De maximale theoretische specifieke activiteit per tritium is 29 Ci/mmol (Curies per millimol tritium). Specifieke activiteiten boven deze waarde geven aan dat gemiddeld elk molecuul ligand ten minste één tritium heeft.
• Lage niet-specifieke binding: Hydrofobe liganden zullen in het algemeen een hogere niet-specifieke binding vertonen. Dit kan soms worden gecompenseerd door filters te coaten met BSA om de niet-specifieke binding te verminderen. Het toevoegen van BSA, zouten of detergenten in de was- of bindingsbuffer kan ook helpen de niet-specifieke binding te verminderen. Als de voorraad radiochemicaliën in een gesilaniseerde flacon is verpakt (zie het technische gegevensblad), kan dit erop wijzen dat het ligand enigszins waterafstotend is
• Hoge zuiverheid: Idealiter zou het ligand een radiochemische zuiverheid van meer dan 90% moeten hebben. De radiochemische zuiverheid neemt in de loop van de tijd af, en de feitelijke snelheid van deze afbraak versnelt met de tijd. Radiochemische zuiverheid en afbraaksnelheid voor onze verschillende radiochemicaliën zijn te vinden op de partijspecifieke technische informatiebladen.
• Hoge selectiviteit: Hoe selectiever het ligand is voor uw receptor, hoe beter uw gegevens zullen zijn. Hoge selectiviteit geeft aan dat het ligand meestal door slechts één receptor van belang zal worden herkend, boven andere receptoren die in een celmembraan aanwezig kunnen zijn. Ook het gebruik van membranen die de receptor van belang overexpresseren, kan helpen een mogelijke bijdrage van receptoren die endogeen tot expressie komen in het membraan, te verminderen.
• Stabiliteit: Als u uw radioligand gedurende een langere periode moet gebruiken, kan stabiliteit voor u een factor zijn. Liganden met 125I-markering moeten over het algemeen binnen één tot twee maanden na de productiedatum worden gebruikt. Gechriteerde liganden moeten gewoonlijk binnen 3-6 maanden na de productiedatum worden gebruikt; er zijn echter uitzonderingen op deze regel. Afbraaksnelheden en productiedata zijn te vinden op onze partijspecifieke technische informatiebladen. U kunt ook contact opnemen met de technische ondersteuning om de aanbevolen gebruikstijd voor elke PerkinElmer radiochemische stof te bespreken – onze contactinformatie staat rechtsboven op deze pagina.
• Energie: 3H geeft bèta-energie af, die kan worden gemeten op een scintillatieteller na toevoeging van scintillant (in de vorm van een scintillatiecocktail, Meltilex® solid scintillant, een SPA-korrel, enz.) De bèta-energie reageert met het scintillant en produceert fotonen, die door de detector worden gemeten. Bij 125I komt zowel bèta-energie als gamma-energie vrij. Als u alleen toegang hebt tot een gammateller, moet u een met 125I gelabeld radioligand gebruiken. Een bijkomende factor is het testformaat. 125I geeft meer bèta-energie af dan 3H. Voor SPA-tests kunnen zowel 3H- als 125I-gelabelde liganden doeltreffend worden gebruikt.

Radioactieve ligandbindingstests kunnen in verschillende formaten worden uitgevoerd. Typisch, wij voeren deze assay in filtratie-formaat, maar de assay kan ook worden uitgevoerd in SPA-formaat. Het SPA-formaat is een homogeen formaat, wat betekent dat er geen wasstappen nodig zijn. In de filtratie assay, zult u weg wassen ongebonden ligand met behulp van een vacuüm spruitstuk of cel oogster.

Top

Assay Formats

Filtration Ligand Binding Assays

Bekijk meer informatie over welke materialen u nodig hebt, welke optimalisaties u mogelijk moet uitvoeren, en referenties voor radioactieve ligandbinding filterplaat-assays. In filtratieformaat wordt de bindingsassay eerst uitgevoerd in één assayplaat en dan gefilterd door een filtermat of UniFilter®-plaat met behulp van een celoogstmachine (vacuümspruitstuk). De filters worden gewassen om eventueel ongebonden radioligand te verwijderen. De filtermat of UniFilter-plaat wordt vervolgens gedroogd en scintillatiecocktail (of Meltilex®) wordt toegevoegd voordat met een geschikte detector wordt gelezen.

SPA ligand binding assays

Bekijk meer informatie over welke materialen u nodig hebt, welke optimalisaties u eventueel moet uitvoeren, en referenties voor SPA radioligand bindingsassays. In het SPA-formaat worden celmembranen gevangen op SPA-korrels. Wanneer het radioligand aan de receptor/membraan bindt, komt de radiochemische stof in de buurt van de SPA-korrel. De bèta-energie van het radioligand kan een wisselwerking aangaan met het scintillant in de korrel, waardoor een signaal ontstaat dat kan worden gemeten. Radioligand dat niet aan het celmembraan is gebonden, zal niet dicht genoeg bij de SPA-kraal zijn om een sterke interactie met het scintillant aan te gaan.

Overzicht van ligandbinding

Definities

• Affiniteit (potentie): de strakheid waarmee het ligand zich aan de receptor bindt. Dit wordt gewoonlijk uitgedrukt als een evenwichtsconstante, Kd. Hoe lager de Kd-waarde, hoe hoger de affiniteit.
• Specificiteit: beschrijft hoe selectief een ligand is voor één receptor vs. andere soortgelijke receptoren
• Kd: De concentratie waarbij 50% van de receptoren bezet is door het radioligand

Pharmacologische Classificaties voor Liganden

Liganden

• Volledige agonist: een ligand dat aan een receptor bindt en deze activeert en een maximale respons teweegbrengt
• Gedeeltelijke agonist: een ligand dat aan een receptor bindt en een submaximale respons teweegbrengt
• Antagonist: een ligand dat aan een receptor bindt maar de receptor niet activeert. Antagonisten veroorzaken geen reactie wanneer zij op zichzelf worden toegepast. Zij zullen de effecten van een concurrerend agonistisch ligand blokkeren.
• Inverse agonist: een ligand dat zich aan een receptor bindt en de respons verlaagt tot onder het basale niveau

Assays

I. Verzadigingsexperiment: Meet bindingsevenwicht door een titratie van radioligand uit te voeren, waarbij de hoeveelheid receptor constant wordt gehouden.

Je kunt verzadigingscurven gebruiken om Bmax (expressieniveau van de receptor) en Kd (bindingsaffiniteit van ligand) te bepalen.

verzadigingsexperiment

• Totale binding: Toenemende concentratie radioligand in afwezigheid van koud ligand. Meet zowel de specifieke binding aan de receptor, als de niet-specifieke binding.
• Niet-specifieke binding: Toenemende concentratie van radioligand in aanwezigheid van koud ligand. Meet binding van het radioligand aan niet-receptorcomponenten.
• Specifieke binding: Totale minus niet-specifieke binding. Meet de binding aan de receptor, specifiek.

II. Competitie-experiment: Meet de evenwichtsbinding van een enkele concentratie radioligand in aanwezigheid van verschillende concentraties ongelabelde concurrent.

U kunt competitiecurven gebruiken om de affiniteit van een groot aantal ongelabelde verbindingen voor een receptor in screening te bepalen. IC50 en Ki kunnen uit competitiegegevens worden afgeleid.

Competitiecurve

• IC50: Concentratie van een concurrerend ligand dat de helft van het radioactieve ligand verdringt
• Ki: affiniteit van een koud ligand voor de receptor

Noot: Wanneer de concentratie van het radioligand wordt gewijzigd, kan een verschuiving in IC50 van een referentieverbinding worden waargenomen; de Ki blijft echter gelijk.

III. Kinetische experimenten: Meet het niveau van binding op verschillende tijdstippen om de snelheidsconstanten voor radioligand associatie en dissociatie te bepalen.

Kinetiek

• Verzadigende concentratie ligand toegevoegd een hoeveelheid gebonden in de tijd om de Kon
• Hoge concentratie ongelabelde concurrent toegevoegd en afname van binding in de tijd gemeten om de Koff te bepalen

Top

Tips en FAQs

Eindelijk, zult u een radioligand willen selecteren dat de volgende eigenschappen heeft:

• Hoge specifieke activiteit (> 20 Ci/mmol voor een getritityleerd ligand)
• Lage niet-specifieke binding (hydrofobe liganden zullen over het algemeen een hogere niet-specifieke binding vertonen)
• Hoge zuiverheid (gewoonlijk > 90% zuiver)
• Hoge selectiviteit
• Stabiliteit (als u uw radioligand gedurende een langere periode moet gebruiken, kan stabiliteit een factor zijn. Liganden met 125I-markering moeten over het algemeen binnen één tot twee maanden na de productiedatum worden gebruikt. Getritiseerde liganden moeten gewoonlijk binnen 3-6 maanden na de fabricagedatum worden gebruikt (er zijn echter uitzonderingen).

Bij het plotten van uw gegevens raden wij u aan de experimenteel bepaalde concentratie van uw radioligand-werkoplossingen te gebruiken, in plaats van een berekende concentratie. Sommige radioliganden blijven aan de wanden van de verdunningsbuisjes kleven. Het is belangrijk dat u de werkelijke concentratie van uw gepipetteerde radioligand bepaalt. Om de concentratie van een radioligand verdunning experimenteel te bepalen, pipetteer enkele microliters uit uw verdunningsbuisje en spot op een filtermat. Eventueel kunt u ook een 1/10 verdunning van dit monster aanbrengen, zodat u uw resultaten kunt controleren. Bepaal de dpms (desintegraties per minuut). Reken van dpms naar Curies met de volgende vergelijking:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Gebruik dan de specifieke activiteit van je partij radioligand om van Curies naar mol om te rekenen. Om de radioactieve concentratie op dit punt te bepalen, deelt u het aantal mol door het volume dat u op het filtermatje hebt gespot.

FAQs

Q. Welke concentratie radioligand moet ik gebruiken voor mijn saturatiecurve?
A. In het algemeen raden wij aan 3-5 concentraties onder de Kd en 3-5 concentraties boven de Kd te kiezen. De hoogste concentratie moet tien keer de Kd zijn.

Q.Welke concentratie radioligand moet worden gekozen voor competitieve binding?
A. Het radioligand wordt gebruikt in een lage concentratie, gewoonlijk op of onder zijn Kd-waarde. Als de specifieke activiteit laag is, kan een concentratie boven de Kd-waarde worden gebruikt, maar deze mag nooit hoger dan of gelijk aan de verzadigingsconcentratie zijn.

Q. Welk type ligand moet ik gebruiken om niet-specifieke binding in mijn verzadigingscurven te bepalen?
A. Meestal wilt u een ligand kiezen dat anders is dan uw radioligand. U wilt alleen de specifieke binding van het radioligand aan de receptor verplaatsen. Je moet een ligand kiezen dat een hoge affiniteit heeft voor de receptorbindingsplaats en een lage affiniteit voor niet-specifieke bindingsplaatsen.

Top

Andere PerkinElmer receptor-ligandbindingstechnologieën

• DELFIA fluorescente receptor-ligandbindingstests

Top

Op maat gemaakte radiochemische producten, cellijnen, Membranen, ingevroren cellen en receptoren

PerkinElmer biedt aangepaste radiochemicaliën, aangepaste cellijnen en membranen, aangepaste microtiterplaten, SPA-korrels en FlashPlates, alsmede de ontwikkeling van aangepaste assays. Als u geïnteresseerd bent in aangepaste diensten, neem dan contact op met onze aangepaste teams:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top