PLOS ONE

Results and Discussion

Constitutieve activatie van de transcriptiefactor NF-κB wordt als essentieel beschouwd voor B-cel transformatie door het API2-MALT1 fusie-eiwit van MALT lymfomen met een translocatie t(11;18) . Voorbijgaande overexpressie van API2-MALT1 in 293T cellen resulteert in de robuuste activering van een NF-κB luciferase reportergen, waardoor een nuttig modelsysteem om de mechanismen waarmee API2-MALT1 signalen naar NF-κB te bestuderen. Om te controleren op transfectie-efficiëntie, we co-geëxpresseerde pEGFP-N2 (Clontech) in een aantal experimenten. Tot onze verrassing zagen we dat EGFP remde NF-κB activering geïnduceerd door API2-MALT1 in een dosis afhankelijke wijze (Fig 1A). In tegenstelling, EGFP had geen invloed op de reporter activering geïnduceerd door expressie van de p50/p65 subeenheden van NF-κB (Fig 1B), wat suggereert dat er een interferentie is met de NF-κB signaal cascade geactiveerd door API2-MALT1 stroomopwaarts van NF-κB.

(A) Activering van een NF-κB luciferase reporter door een Flag-tagged API2-MALT1 fusie-eiwit wordt geremd door EGFP in een dosisafhankelijke wijze.

(B) EGFP blokkeert niet de NF-κB afhankelijke luciferase activiteit geïnduceerd door expressie van de p50/p65 subeenheden van NF-κB (C) Activering van een NF-κB luciferase reporter door Flag-API2-MALT1 wordt geremd door EGFP gemuteerd voor het TRAF6-bindingsmotief (D) EGFP maar niet pmaxGFP voorkomt TNF-α-geïnduceerde activering van de NF-κB luciferase-reporter en fosforylering van IκB-α en JUN in 293T-cellen.

EGFP verhoogt niet HSP70 niveaus of induceren HSP70B′ in 293T cellen.

Fluorescentie intensiteiten (Ex485/Em520nm) voor EGFP en pmaxGFP waren zowel ∼100 vouwen boven achtergrond. (E) N-en/of C-terminale EGFP fusie-eiwitten (voor API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actine, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) of β-Tubulin) en EGFP met een nucleaire lokalisatie signaal (NLS) of een farnysilatie site (pEGFP-F) verminderen TNF-α-geïnduceerde NF-κB luciferase reporter activiteit in 293T cellen. Bodem: Bij de mens komt HSP70 constitutief tot expressie onder normale omstandigheden, maar Hsp70B′ wordt alleen geïnduceerd in reactie op stress.

Er is geen basale expressie van Hsp70B′.

Als een positieve controle voor HSP70B′ expressie, 293T cellen (laan 2) werden heat shocked bij 44 ° C gedurende twee uur (laan 3) en toegestaan om te herstellen bij 37 ° C gedurende 5 (laan 4) of 18 (laan 5) uur vóór de oogst. NF-κB-afhankelijke luciferase-activiteit wordt voor elk experiment weergegeven als vouw inductie van vector-getransfecteerde cellen en wordt grafisch weergegeven als het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke experimenten.

Alle molecuulgewicht standaarden zijn in kDa.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001

MALT1 is een essentiële signaleringscomponent van de antigeen-receptor pathway naar NF-κB , . Aangenomen wordt dat BCL10 oligomerisatie van MALT1 bemiddelt, waardoor een complex met TRAF6 kan worden gevormd. Oligomerisatie van TRAF6 ontlokt de E3 ubiquitine ligase activiteit van zijn RING domein, wat resulteert in modificatie van IKKγ (NEMO) via Lys63-gekoppelde polyubiquitine ketens. Dit vergemakkelijkt vervolgens de interactie van IKKγ met TGFβ activating kinase 1 (TAK1), dat het IκB kinase complex (IKK) volledig activeert via fosforylering van IKKβ, hetgeen leidt tot NF-κB activatie. Evenzo activeert het API2-MALT1 fusie-eiwit NF-κB via TRAF6-gemedieerde polyubiquitinatie van IKKγ . De interactie van TRAF6 met de carboxy-terminus van MALT1 vindt plaats via twee potentiële TRAF6-bindingsmotieven (PxExxAr/Ac met Ar/Ac voor een aromatisch of zuur residu. Inspectie van de EGFP-sequentie bracht de aanwezigheid van een TRAF6-bindende consensus aan het licht (PNEKRD, AA 212-217). De kristalstructuur van EGFP toont dat het PNEKRD motief blootligt in een lus tussen twee beta-sheets, wat de toegankelijkheid ervan suggereert en een rol voor EGFP als negatieve regulator via sequestratie van TRAF6. Co-IP experimenten toonden echter geen interactie aan tussen EGFP en TRAF6 (gegevens niet weergegeven) en mutanten voor de TRAF6 bindende consensus blokkeerden NF-κB activering door API2-MALT1 even efficiënt als EGFP (Fig 1C).

Om te onderzoeken of het effect beperkt was tot API2-MALT1, analyseerden we TNF-α geïnduceerde NF-κB activering in 293T cellen die EGFP tot expressie brengen. Opnieuw verminderde EGFP de NF-κB signalering zoals aangetoond door lagere reporter activiteit en verminderde fosforylering van de inhibitor van NF-κB, IκB-α (Fig 1D). Vervolgens evalueerden we of EGFP fusie-eiwitten hetzelfde effect zouden kunnen hebben. Zowel N- als C-terminale EGFP fusies blokkeerden API2-MALT1- (data niet weergegeven) en TNFα-geïnduceerde NF-κB activatie (Fig 1E). Naast het activeren van de NF-κB pathway, triggert TNF-α behandeling ook JNK signalering. Fosforylering van JUN, indicatief voor geactiveerde JNK signalering, wordt ook verminderd door EGFP na TNF-α behandeling (Fig 1D).

Het is gemeld dat langdurige visualisatie van GFP expresserende cellen de productie van reactieve zuurstofspecies induceert, wat kan resulteren in fysiologische veranderingen en uiteindelijk celdood . Interessant is dat beide EGFP mutanten voor de TRAF6 bindende consensus hun groene fluorescentie hadden verloren, maar efficiënt de NF-κB signalering remden (Fig 1C). Bovendien had pmaxGFP (Amaxa Biosystems), een structureel verschillend fluorescerend eiwit, geen effect op NF-κB en JNK activering bij TNF-α behandeling (Fig 1D), wat suggereert dat de remming niet het gevolg was van vrije-radicalen-geassocieerde fototoxiciteit. Een andere studie wees uit dat hoge niveaus van EGFP heat shock protein 70 (HSP70) kunnen induceren, dat in staat is om NF-κB activering te remmen via zijn interactie met IKKγ en TRAF6 . Echter, inductie van HSP70 was beperkt tot endotheelcellen en we hebben geen verhoogde HSP70 niveaus of inductie van HSP70B′ waargenomen in EGFP expressie 293T cellen (Fig 1D-E).

NF-κB activering door API2-MALT1 expressie of na TNF-α behandeling is geassocieerd met modificatie van IKKγ met Lys63-gekoppeld polyubiquitine door TRAF6 of TRAF2 respectievelijk. Verder vereist TNFα-geïnduceerde JNK signalering TRAF2 auto-ubiquitinatie. Om een mogelijk effect van EGFP op de RING E3 ubiquitine ligase activiteit van TRAF6 of TRAF2 te beoordelen, controleerden we de ubiquitinering via een HA-getagde ubiquitine-mutant met alleen Lys63 beschikbaar voor polymerisatie (HA-Ub-K63). Expressie van API2-MALT1 of TNF-α stimulatie verhoogde het niveau van gepolyubiquitineerde eiwitten in 293T cellen en was geassocieerd met verhoogde IKKγ polyubiquitinatie in immunoprecipitaten, en beide processen werden geblokkeerd door EGFP (Fig 2A, lanes 1,2,5,6). Bovendien verminderde EGFP het basale niveau van K63-gekoppelde polyubiquitinatie in 293T cellen (Fig 2A, lanen 3 en 4). Evenzo stimuleert expressie van API2-MALT1 of TNFα behandeling K48-gekoppelde ubiquitineketen assemblage, die weer wordt geblokkeerd door EGFP en zijn structurele homoloog dsRed (Clontech), maar niet door pmaxGFP (Fig 2B).

Download:

• PowerPoint slide
• grotere afbeelding
• originele afbeelding

Figuur 2. EGFP blokkeert Lys63- en Lys48-gekoppelde polyubiquitinatie.

(A) 293T-cellen getransfecteerd met de aangegeven constructen en behandeld gedurende 4 uur met 20 ng/ml TNF-α (lane 5 en 6) werden immunoblotted met anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) en anti-EGFP antilichamen (linker paneel) of anti-IKKγ immunoprecipitaten werden immunoblotted met anti-Flag (IKKγ) of anti-HA (ubiquitine) (rechter paneel).

(B) EGFP beïnvloedt K48-gekoppelde polyubiquitinatie.

293T-cellen werden getransfecteerd met een Ubiquitin-construct met alleen Lys48 beschikbaar voor polymerisatie (HA-Ub-K48), behandeld gedurende 4 uur met 20 ng/ml TNF-α of onbehandeld gelaten en cellysaten werden immunoblotted met anti-HA (Ub-K48) en anti-EGFP antilichamen.

Fluorescentie intensiteiten (excitatie 485 / transmissie 520 nm) voor EGFP en pmaxGFP waren vergelijkbaar (∼100 maal hoger dan achtergrondwaarden), expressie van pDs-Red werd bevestigd door fluorescentiemicroscopie.

(C) EGFP stabiliseert exogeen API2-Myc in 293T cellen via vermindering van zijn Lys48-gekoppelde auto-ubiquitinatie en proteasomale degradatie.

(D) Stabiele expressie van EGFP in de merkelcelcarcinoom cellijn MCC14.2 vermindert polyubiquitinatie en verhoogt endogene p53 expressieniveaus.

De gemiddelde verhouding en standaardafwijking van p53 tot actinesignalen worden gegeven (drie onafhankelijke experimenten), (Ub)n : gepolyubiquitineerde eiwitten.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002

Om te onderzoeken of EGFP uitsluitend ubiquitinatie door TRAF-eiwitten beïnvloedt, evalueerden we API2, een RING E3 ubiquitin-ligase dat zichzelf destabiliseert via Lys48-gekoppelde auto-ubiquitinatie . Co-expressie van EGFP remde polyubiquitinatie geïnduceerd door API2 in 293T cellen wat resulteerde in een toename van API2 expressie niveaus (Fig 2C). Verminderde steady-state niveaus van ubiquitinatie werden ook waargenomen in MCC14.2 cellen met stabiele expressie van EGFP. Als gevolg hiervan zijn basale niveaus van endogeen p53, die strak worden gereguleerd door Lys48-gekoppelde ubiquitinatie door MDM2, licht verhoogd in EGFP-expressiecellen (Fig 2D).

Naar aanleiding hiervan hebben we onderzocht of EGFP de ubiquitinatie in vivo beïnvloedt. De basale niveaus van polyubiquitinatie waren verminderd in splenische lymfocyten van EGFP transgene muizen , wat geassocieerd was met verminderde fosforylering van IκB-α na antigeenstimulatie in vergelijking met controlemuizen, wat erop wijst dat EGFP de door de B-celreceptor geïnduceerde NF-κB activatie vermindert (Fig 3A-B). API2-MALT1 transgene muizen hebben een tekort aan B220 + / CD40 + B-cellen in hun beenmerg als API2-MALT1-gemedieerde NF-κB activering versnelt hun maturatie tot naïeve B-cellen . Wanneer deze API2-MALT1 transgene muizen werden gekruist met EGFP muizen, werd het tekort aan B220 + / CD40 + B-cellen in het beenmerg van EGFP / API2-MALT1 dubbele transgene muizen (Fig 3C) hersteld, verdere ondersteuning van een impact op ubiquitinatie en NF-κB signalering in vivo. Op dezelfde manier werd polyubiquitinatie verminderd in levercellen van EGFP muizen en werd geassocieerd met p53 stabilisatie zoals aangetoond door de toename van zijn expressieniveau (Fig 3A, D). Het belangrijkste doelwitgen van p53 bij γ-bestraling-geïnduceerde DNA-schade in de lever is p21, dat nodig is voor celcyclusstilstand en DNA-herstel. Dienovereenkomstig veroorzaakte γ-bestraling geïnduceerde DNA schade niet alleen een hogere p53 respons in EGFP muizen, maar ook de inductie van p21 werd licht verhoogd (Fig 3D). Tenslotte werden in vitro experimenten uitgevoerd om te evalueren of EGFP rechtstreeks invloed heeft op de assemblage van ubiquitineketens; recombinant EGFP had echter geen invloed op de polyubiquitinatie van een controlesubstraat (Fig 3E), wat een celcontext-afhankelijk effect van EGFP op ubiquitinatie suggereert.

(A) Western blots van milt en lever extracten van FVB wild-type (wt) en EGFP transgene muizen gedetecteerd met antilichamen tegen Ubiquitine, EGFP en actine (loading controle).

(B) EGFP vermindert de fosforylering van IκB-α in anti-IgM/anti-CD40 gestimuleerde B-lymfocyten gezuiverd van EGFP-muizen.

Experimenten uitgevoerd in drievoud, een representatief beeld van één experiment wordt getoond.

Het gemiddelde en de standaardafwijkingen van de verhoudingen van IκB-α-P tot actine ten opzichte van niet-gestimuleerde cellen worden gegeven.

(C) Het tekort aan B220+/CD40+ B-cellen in het beenmerg van API2-MALT1 muizen is hersteld in EGFP/API2-MALT1 dubbel transgene muizen.

Experimenten uitgevoerd in drievoud, het gemiddelde en de standaardafwijkingen worden weergegeven. eMalt1: endogeen Malt1, *a-specifieke band (D) EGFP-muizen vertonen verhoogde p53-niveaus in de lever en hebben versterkte p53/p21-responsen op door γ-straling veroorzaakte DNA-beschadiging.

De gemiddelde en standaardafwijkingen van de verhoudingen van p53/p21 tot actinesignalen ten opzichte van die van monster 1 zijn gegeven.

(E) Recombinant EGFP (rEGFP) verhindert polyubiquitinatie van een biotine-lysozym substraat niet in vitro. (Ub)n: gepolyubiquitineerde eiwitten.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003

In conclusie, onze gegevens geven aan dat EGFP en EGFP fusie-eiwitten invloed hebben op RING E3 ubiquitin ligase-afhankelijke processen zoals NF-κB en JNK signalering of p53 homeostase in cellijnen en in muizen. NF-κB speelt een centrale rol in de regulatie van diverse biologische processen, waaronder aangeboren en adaptieve immuniteit, ontwikkeling, celgroei en overleving. De pro-overlevingssignalen vloeien voort uit de verhoogde expressie van remmers van apoptose, zoals B-cel leukemie/lymfoom-XL. Daarom zou de door EGFP geïnduceerde toename van apoptose in cellen of in de motorische cortex en het striatum van de hersenen van muizen verband kunnen houden met een verminderde NF-κB-activiteit ten gevolge van defecte polyubiquitinatie en activering/degradatie van zijn stroomopwaartse regulatoren. Defecte ubiquitinatie wordt ook verondersteld om limb gordel spierdystrofie, die wordt geassocieerd met mutaties in Trim32, een ubiquitine ligase voor actine veroorzaken. Omdat werd aangetoond dat EGFP de actine-myosine interacties in spiercellen belemmert en een gedilateerde cardiomyopathie induceert in EGFP muizen, is het verleidelijk te speculeren dat actine ubiquitinatie een essentiële rol zou kunnen spelen in het normaal functioneren van spieren en dat de ontregeling ervan door EGFP de bovenvermelde fenotypes veroorzaakt. Daarom, in het licht van de opkomende rol van ubiquitinatie in tal van cellulaire processen, moet het gebruik van EGFP als een live cell reporter zorgvuldig worden overwogen.