De oxidatief-fermentatieve (OF) test werd in 1953 ontwikkeld door Hugh en Leifson. Zij ontwikkelden OF-media om onderscheid te maken tussen oxidatieve bacteriën (die alleen onder aërobe omstandigheden zuur produceren uit koolhydraten) en fermentatieve bacteriën (die zowel onder aërobe als anaërobe omstandigheden zuur produceren).
Saccharolytische micro-organismen breken glucose ofwel fermentatief ofwel oxidatief af. De eindproducten van fermentatie zijn relatief sterke gemengde zuren die in een conventioneel fermentatie-testmedium kunnen worden gedetecteerd. De zuren die gevormd worden bij de oxidatieve afbraak van glucose zijn echter uiterst zwak en minder sterk, en het gevoeliger oxidatief gistingsmedium van Hugh en Leifson’s OF medium is vereist voor de detectie. Het medium werd gemaakt door de hoeveelheid glucose te verhogen boven die welke wordt aangetroffen in het medium dat wordt gebruikt voor de detectie van gisting en door de hoeveelheid pepton te verlagen.
Het OF-medium van Hugh en Leifson verschilt als volgt van koolhydraatfermentatiemedia:
- De concentratie agar is verlaagd van 3% naar 2%, waardoor het halfvast van consistentie wordt (dit helpt bij de bepaling van de beweeglijkheid van het organisme).
- De concentratie pepton is verlaagd van 11% naar 2%. (Vermindering van de hoeveelheid alkalisch produkt dat door het metabolisme van pepton wordt geproduceerd; daardoor vermindert de neutraliserende werking van deze produkten).
- De concentratie koolhydraten wordt verhoogd met 0,5% tot 1.0% (De verhoogde concentratie glucose in het medium verhoogt de productie van deze zwakke zuren tot een niveau dat kan worden gedetecteerd door broomthymolblauw indicator.)
Principe:
De oxidatieve-fermentatieve test bepaalt of bepaalde gramnegatieve staven glucose metaboliseren door fermentatie of aërobe respiratie (oxidatief). Tijdens het anaerobe fermentatieproces wordt pyruvaat omgezet in een verscheidenheid van gemengde zuren, afhankelijk van het type fermentatie. De hoge concentratie zuur geproduceerd tijdens fermentatie zal de broomthymol blauwe indicator in OF media van groen naar geel doen veranderen in de aanwezigheid of afwezigheid van zuurstof.
Zekere niet-gistende gram-negatieve bacteriën metaboliseren glucose met behulp van aërobe ademhaling en produceren daarom slechts een kleine hoeveelheid zwakke zuren tijdens glycolyse en Krebs cyclus. De vermindering van de hoeveelheid pepton en de toename van de hoeveelheid glucose vergemakkelijkt de opsporing van de aldus geproduceerde zwakke zuren. Dipotassium fosfaat buffer wordt toegevoegd om de detectie van zuren verder te bevorderen.
Toepassingen:
OF test wordt gebruikt om te bepalen of gramnegatieve bacteriën koolhydraten oxidatief metaboliseren, door fermentatie, of nietacchrolytisch zijn (geen mogelijkheid hebben om de koolhydraten in de media te gebruiken).
Media:
Hugh and Leifson’s OF basaal medium; de bestanddelen zijn als volgt:
- Natriumchloride : 5,0 g
- Di-kaliumfosfaat : 0,3 g
- Pepton : 2.0 g
- Broomthymolblauw : 0,03 g
- Aarde : 3,0 g
- Glucose : 10 g
- Water : 1000 ml
De pH moet vóór het autoclaveren op 7,1 worden gebracht. Nadat het medium gedurende 15 minuten bij 121°C is geautoclaveerd, wordt een door een filter gesteriliseerde oplossing van 10% koolhydraatoplossing aseptisch aan het medium toegevoegd tot een eindconcentratie van 1%.
Procedure
- Inoculeer twee buisjes OF testmedium met het testorganisme met behulp van een rechte draad door “halverwege de bodem” van het buisje te steken.
- Bedek een buis van elk paar met een laag steriele minerale olie of vloeibare paraffine van 1 cm (dit creëert een anaërobe toestand in de buis door diffusie van zuurstof te voorkomen), waarbij de andere buis open blijft voor de lucht.
- Incubeer beide buizen bij 35°C gedurende 48 uur (traag groeiende bacteriën kunnen 3 tot 4 dagen nodig hebben voordat resultaten kunnen worden waargenomen)
Interpretatie
Zuurproductie wordt in het medium gedetecteerd door het verschijnen van een gele kleur. In het geval van oxidatieve organismen kan de kleurproductie het eerst aan het oppervlak van het medium worden waargenomen.
Volgend zijn de reactiepatronen:
- Fermentatief resultaat: Zuurproductie op beide (open en afgedekte) buisjes. Het geproduceerde zuur verandert de pH-indicator, broomthymolblauw, van groen in geel. b.v. Escherichia coli
- Oxidatief resultaat: Zuurproductie in de open buis (aëroob) en niet in de met olie bedekte buis (anaëroob) wijst op een oxidatief resultaat. Niet-gistende bacteriën die glucose via een oxidatieve stofwisseling metaboliseren, geven een oxidatief resultaat, bv. Pseudomonas aeruginosa
- Niet-saccharolytisch (Negatief OF-resultaat): Niet-sachrolytische bacteriën geven een negatief OF-resultaat. Het negatieve resultaat wordt aangegeven door geen kleurverandering in het met olie bedekte buisje en in sommige gevallen een verhoging van de pH (pH 7,6) waardoor het broomthymolblauw van groen naar blauw verandert in de top van het open buisje. De pH-verhoging is te wijten aan de amineproduktie door bacteriën die het pepton (eiwit) in het medium afbreken.
b.v. Alcaligenes faecalis.
Quality Control
- Glucose Fermenter: Escherichia coli
- Glucose oxidator: Pseudomonas aeruginosa
- Niet-saccharolytisch: Moraxella species
Geef een antwoord