Nucleolus

De nucleolus bevindt zich binnen de celkern.

De nucleolus (meervoud nucleoli) is een groot, afzonderlijk, sferoïdaal subcompartiment van de kern van eukaryote cellen dat de plaats is van de synthese van ribosomaal RNA (rRNA) en de assemblage van ribosomale subeenheden. Een nucleoli wordt soms een “niet-membraneus organel” of “kernmembraanloos organel” genoemd in de ruimere zin van de term organel; nucleoli hebben echter geen membraan en zijn dus geen organellen in de meer technische zin van structuren die afzonderlijk ingesloten zijn binnen hun eigen lipidemembraan. De meeste planten- en dierlijke cellen hebben één of meer nucleoli, maar sommige celtypen hebben er geen.

De nucleolus is een zeer dynamische structuur waarvan de componenten bij het begin van de mitose worden verspreid en aan het einde van de celdeling weer worden samengevoegd. Dit ingewikkelde lichaam werkt samen met andere nucleaire componenten om een waardevolle functie voor de cel te vervullen. Wanneer deze complexe coördinatie in menselijke cellen echter wordt verstoord, zoals door een virusinfectie, aangeboren mutaties of verhoogde activiteit, kunnen verschillende menselijke ziekten het gevolg zijn.

Overzicht

Schematische weergave van een typische dierlijke cel, met subcellulaire componenten. Organellen:
(1) nucleolus
(2) kern
(3) ribosomen (kleine stippen)
(4) blaasje
(5) ruw endoplasmatisch reticulum (ER)
(6) Golgi-apparaat
(7) cytoskelet
(8) glad endoplasmatisch reticulum (ER)
(9) mitochondriën
(10) vacuole
(11) cytoplasma
(12) lysosoom
(13) centriolen binnen centrosoom

De nucleolus is een grote en afzonderlijke kernstructuur die sterk georganiseerd is en een membraan ontbeert. De belangrijkste functie van de nucleolus is de biogenese en assemblage van ribosoomcomponenten (rRNA, ribosomale eiwitten). Deze plaats van ribosomaal DNA (rDNA) transcriptie wordt wel een “ribosoom-producerende machine” genoemd (Alberts et al. 1989). De nucleolus kan worden gevisualiseerd met behulp van elektronenmicroscopie, terwijl de organisatie en dynamiek kunnen worden bestudeerd met behulp van Fluorescent Protein Tagging en Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP).

In een niet-mitotische cel, waargenomen onder een lichtmicroscoop, is de nucleolus de meest duidelijke structuur in de celkern (Alberts et al. 1989). Tijdens de eerste stadia van de celdeling zijn de nucleoli echter gefragmenteerd (zij zijn niet meer te zien in de metafase). Bij de overgang tussen telofase en interfase verzamelen zij zich weer rond de chromatinegebieden waar de rDNA-transcriptie opnieuw wordt gestart. De rDNA-sequenties coderen voor de rRNA (ribosomaal RNA)-moleculen van de ribosomen.

In plaats van door een membraan te zijn gebonden, lijkt de nucleolus te zijn opgebouwd uit de specifieke binding van onvoltooide ribosoomprecursors, die een groot netwerk vormen (Alberts et al. 2004). Drie regio’s van een nucleolus kunnen worden onderscheiden: een fibrillair centrum (dat DNA bevat dat niet actief wordt getranscribeerd), een dichte fibrillaire component (bevat RNA moleculen die worden getranscribeerd), en een korrelige component (bevat rijpende ribosomale precursor deeltjes) (Alberts et al. 1989). Dit laatste gebied helpt om de grens met het omringende nucleoplasma duidelijk te maken, ondanks het ontbreken van een membraan.

Omdat nucleoli de productie en rijping van ribosomen uitvoeren, worden grote aantallen ribosomen binnen hen gevonden. Naast ribosoom biogenese, worden nucleoli verondersteld om andere rollen in cellulaire activiteit te hebben. Bovendien is, volgens recent onderzoek, de nucleolus ook verantwoordelijk voor het transport van verschillende prominente kleine RNA-soorten. De nucleolus helpt hen tijdens hun rijpingsproces en op weg naar hun uiteindelijke cellulaire bestemming. Hoewel nucleoli onzichtbaar worden tijdens de celdeling, hebben recente studies bovendien aangetoond dat zij betrokken zijn bij de regulering van de celcyclus. Verscheidene van zijn niet-traditionele rollen omvatten interactie met virale componenten, de regulatie van tumor suppressor en oncogen activiteiten, signaalherkenning deeltjes assemblage, de modificatie van kleine RNA strengen, de controle van veroudering, en het moduleren van telomerase functie.

Eerdere cytologen waren zo geïnteresseerd in de gemakkelijk zichtbare nucleoli dat een overzicht uit 1898 ongeveer 700 referenties opsomde (Alberts et al. 1989). Cytologen toonden tegen de jaren 1940 aan dat nucleoli hoge concentraties RNA en proteïnen bevatten (Alberts et al. 1989). In 1964 ontdekten John Gurdon en Donald Brown celkernollen bij de Afrikaanse klauwkikker Xenopus laevis. Zij ontdekten dat 25 procent van de kikkereieren geen nucleolus had en dat dergelijke eieren niet tot leven in staat waren. De helft van de eieren had één nucleolus en 25 procent had er twee. Zij concludeerden dat de nucleolus een functie had die noodzakelijk was voor het leven. In 1966 toonden Max L. Birnstiel en Hugh Wallace via hybridisatie-experimenten aan dat nucleoli coderen voor ribosomaal DNA.

Morfologie van de nucleolus

Nucleoli zijn typisch samengesteld uit drie morfologisch verschillende regio’s, die kunnen worden gevisualiseerd met elektronenmicroscopie (EM) (Hernandez-Verdun 2006a; 2006b; Olson en Dundr 2005; Raška et al. 2006; Thiry en Lafontaine 2005):

1. Fibrillar Center (FC):

• licht gekleurd wanneer geobserveerd door EM
• bestaande uit “fibrillen” (± 50Ǻ in Ø)
• aanwezigheid van pol I en UBF
• meerdere FC in één nucleolus
• beslaat slechts 1-2 procent van het totale volume van de nucleolus

2. Dense Fibrillar Center of Dense Fibrillar Component (DFC):

• omgeeft de FC’s
• bestaat uit “dicht opeengepakte fibrillen” (30-50 Ǻ in Ø)
• bezet een grote fractie van de nucleolus, ± 17 procent en weerspiegelt ruwweg de nucleolaire betrokkenheid bij de ribosomen-biogenese

3. Granulaire regio of Granulaire Component (GR):

• regio die zowel de FC als de DFC omvat
• bestaande uit granules 150-200 Ǻ in Ø
• granule rijke regio als gevolg van de aanwezigheid van RNP-deeltjes
• met een fractie van ongeveer 75 procent, het neemt de grootste fractie van het totale nucleolusvolume in
• althans is de nucleolus niet membraangebonden, door de aanwezigheid van GC is de grens met het omliggende chromatine en nucleoplasma gewoonlijk duidelijk.

Een substantieel (extra) bestanddeel van de nucleolus is chromatine, dat vanuit het omringende nucleoplasma het organel binnendringt.

Een continue verbinding tussen het nucleoplasma en de binnenste delen van de nucleolus bestaat via een netwerk van nucleolaire kanalen. Op deze wijze kunnen macromoleculen met een molecuulgewicht tot 2000 kDa gemakkelijk door de nucleolus worden verdeeld.

Een laatste structuur is geïdentificeerd binnen de nucleolus en wordt een nucleolaire vacuole genoemd. Er zijn meerdere nucleolaire vacuolen in de nucleolus, maar het blijft onduidelijk of zij al dan niet een functioneel of structureel doel dienen.

Hoewel de “tripartiete” organisatie (FC, DFC, GC) van de nucleolus algemeen wordt aanvaard, is voorgesteld dat deze specifieke organisatie alleen wordt waargenomen bij hogere eukaryoten en dat zij evolueerde van een bipartiete organisatie bij de overgang van anamniotes naar amniotes. Als gevolg van de aanzienlijke toename van de rDNA intergenische regio, zou een oorspronkelijke fibrillaire component zich hebben gescheiden in de FC en de DFC (Thiry en Lafontaine 2005).

De nucleolus en rDNA transcriptie/rRNA verwerking/ribosoom assemblage

Nucleolus assemblage vindt niet willekeurig plaats. Nucleoli worden gevormd rond specifieke genetische loci die nucleolaire organiserende regio’s (NOR’s) worden genoemd. Eerder door McClintock beschreven als het “nucleolar organizing element”, bestaat een NOR uit tandem herhalingen van rRNA-genen die in meervoudige kopieën in het genoom aanwezig zijn. Het menselijk genoom bijvoorbeeld bevat meer dan 200 kopieën van het rRNA-gen en deze zijn op vijf verschillende chromosomen geclusterd. In een typische eukaryoot bestaat een rRNA-gen uit een promotor, interne en externe getranscribeerde spacers (ITS/ETS), rRNA-coderende sequenties (18S, 5.8S, 28S), en een externe “niet” getranscribeerde spacer (Alberts et al. 2002).

In de biogenese van ribosomen zijn drie eukaryotische RNA-polymerasen (pol I, II, III) nodig, die op een gecoördineerde manier functioneren. In een eerste fase worden de rRNA-genen als een enkele eenheid getranscribeerd binnen de nucleolus door RNA pol I. Om deze transcriptie te laten plaatsvinden, zijn verschillende pol I-geassocieerde factoren en rDNA-specifieke transactiefactoren nodig. Bij gist zijn de belangrijkste UAF (upstream activating factor), TBP (tata-box binding protein), en CF (core factor), die promotorelementen binden en het pre-initiation complex (PIC) vormen, dat op zijn beurt door pol I wordt herkend.

Bij de mens wordt een soortgelijk PIC geassembleerd met SLI, de promotorselectiviteitsfactor, die bestaat uit TBP en TBP-geassocieerde factoren (TAF), IF, de transcriptie-initiatiefactor, en UBF, upstream-bindingsfactor.

Transcriptie van het ribosomale gen levert een lang precursormolecuul (45S pre-rRNA) op, dat nog de intern getranscribeerde sapcer (ITS) en extern getranscribeerde spaced (ETS) bevat. Verdere bewerking, die methylering en endo/exonuclease activiteit inhoudt, is derhalve nodig om de 18S rRNA, 5.8S, en 28S rRNA moleculen te genereren. De RNA-modificerende enzymen worden naar hun respectieve herkenningsplaatsen gebracht door interactie met gids-RNA’s, die zich aan deze specifieke sequenties binden. De gids-RNA’s behoren tot de klasse van kleine nucleolaire RNA’s (snoRNA’s), die een complex vormen met eiwitten en bestaan als kleine-nucleolaire-ribonucleoproteïne (RNP) deeltjes (snoRNP’s).

Zodra het rRNA is verwerkt, zijn de rRNA-moleculen klaar om te worden geassembleerd tot ribosomen. Voor deze biogenese is echter een extra RNA-molecuul, het 5S rRNA, nodig. In gist is de 5S rDNA-sequentie gelokaliseerd in de externe “niet” getranscribeerde spacer en wordt getranscribeerd in de nucleolus door RNA pol III. Bij hogere eukaryoten en planten is de situatie complexer, want de 5S rDNA-sequentie ligt buiten de NOR en wordt getranscribeerd in het nucleoplasma, waarna zij wordt geïmporteerd in de nucleolus om deel te nemen aan de ribosoomassemblage. Bij deze assemblage zijn niet alleen het rRNA, maar ook ribosomale eiwitten betrokken. De genen die coderen voor deze r-eiwitten worden getranscribeerd door pol II in het nucleoplasma via een “conventionele” route van eiwitsynthese (transcriptie, pre-mRNA verwerking, nucleaire export van rijp mRNA en translatie op cytoplasmatische ribosomen). De rijpe r-eiwitten worden vervolgens weer in de nucleolus geïmporteerd. Associatie en rijping van rRNA’s en r-eiwitten resulteren in de vorming van de 40S en 60S subeenheden van het ribosoom. Deze worden via de nucleaire poriecomplexen geëxporteerd naar het cytoplasma waar zij vrij blijven of geassocieerd worden met het endoplasmatisch reticulum (Alberts et al. 2002; Cooper and Hausman 2007).

Nucleaire organisatie en dynamiek

Meerdere nucleolaire eiwitten en kleine nucleolaire RNA’s (snoRNA’s) worden geassocieerd om de verwerkingsmachines te vormen die nodig zijn in de ribosoom biogenese. Zij zijn betrokken bij de modificatie van de rRNA-transcripten door methylering (2′-O-methylering/pseudouridylering) en endonucleolytische splitsing van de pre-RNA’s. Deze verwerkingsfasen zijn hoofdzakelijk beperkt in de DFC (dichte fibrillaire component), zoals blijkt uit de aanwezigheid van deze snoRNP (small-nuclear-ribonucleoprotein particles) die eiwitten vormen, bijvoorbeeld fibrillarine, nucleoline en U3 snoRNA. Eiwit B23 en NOP52, betrokken bij latere stadia van de verwerking. zijn gelokaliseerd in de GC (granulaire component).

Dit toont aan dat de organisatie van de nucleoli sterk gereguleerd is en afhankelijk is van de stadia in de rRNA-verwerking. Deze waarnemingen hebben ook geleid tot de hypothese dat rDNA-transcriptie moet plaatsvinden in de FC (fibrillair centrum) of op de overgang tussen de FC en de DFC vanwege de vectoriale uitgaande beweging van de pre-RNA-transcripten terwijl zij worden verwerkt tot rijpe rRNA’s.

Als men het geheel van eiwitten en RNA’s beschouwt die nodig zijn bij de ribosoom biogenese, kan men aannemen dat een nucleolus eenvoudig wordt gevormd doordat bepaalde eiwitten, betrokken bij de transcriptie van de rDNA genen, zich binden aan hun doelgebieden, en dat rondom hen een spontane assemblage plaatsvindt van alle elementen die betrokken zijn bij de modificatie van de nascente rRNA’s. De organisatie vindt dus plaats als gevolg van ribosoom biogenese.

Er zijn verschillende experimentele benaderingen gebruikt om een gedetailleerd beeld te krijgen van dit specifieke assemblageproces. De belangrijkste zijn Fluorescent Protein Tagging, waarbij een interessant eiwit wordt versmolten met een fluorescerend eiwit zoals “green fluorescent protein” (GFP) en Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP), waarbij een eiwit wordt versmolten met een fusie-eiwit waarna de fluorescente moleculen in het bestudeerde gebied worden gebleekt met een laser. De fluorescentie-intensiteit van het bestudeerde gebied zal zich herstellen door uitgaande diffusie van gebleekte moleculen en inwaartse diffusie van niet-gebleekte moleculen. Met de eerste benadering kan men de beweging van het fluorescerende complex bijhouden (3D+tijd) en met de laatste kan men de verblijftijd (tijd doorgebracht in een bepaald gebied) van het fluorescerende eiwit meten (met andere woorden de intracellulaire mobiliteit meten).

Beide experimentele methoden berusten op de mogelijkheid om een hele reeks nucleolus-geassocieerde eiwitten te taggen, zoals nucleolaire eiwitten, histonen, DNA-bindende eiwitten, transcriptiefactoren en spliceosomen. Het volgen en meten van de verblijftijd van de gemerkte eiwitten maakte het mogelijk de snelle associatie-/dissociatiesnelheden van nucleolaire eiwitten met andere nucleolaire componenten aan te tonen, de voortdurende uitwisseling van eiwitten tussen de nucleolus en het nucleoplasma tijdens de interfase, en de betrokkenheid van deze nucleolaire eiwitten met andere nucleaire domeinen. Zo is bijvoorbeeld gebleken dat Cajal-bodies (CB) verrijkt zijn met kleine nucleaire en nucleolaire ribonucleoproteïnen en dat zij verschillende nucleolair geassocieerde verwerkingseiwitten bevatten, zoals fibrillarine. Daarom is voorgesteld dat er een functionele relatie zou bestaan tussen nucleoli en Cajal lichaampjes (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Verschillende experimentele waarnemingen wijzen erop dat de rekrutering van de nucleolus constituerende elementen niet willekeurig gebeurt en dat ze gereguleerd wordt door het verloop van de celcyclus. Tijdens mitose blijft de transcriptiemachine nauw verbonden met het rDNA. De transcriptie wordt echter onderdrukt door het cycline B/Cdk1 proteïnekinasecomplex (PMF). Dit complex wordt geactiveerd bij het begin van de mitose en onderdrukt de nucleaire activiteiten door fosforylering van een aantal eiwitkinasen of structurele eiwitten die betrokken zijn bij de cellulaire herschikkingen die nodig zijn voor een goede celdeling. Het is aan het einde van de mitose, wanneer de PMF door proteolytische splitsing van cycline B wordt afgebroken, dat de nucleoli zich weer rond de rDNA plaatsen verzamelen als reactie op het opnieuw in gang zetten van de rDNA-transcriptie. De nucleolaire eiwitten zijn, in tegenstelling tot de eiwitten die betrokken zijn bij de transcriptie, gelokaliseerd aan de periferie van de chromosomen tijdens de M-fase van de celcyclus. Dit kan worden gevisualiseerd met Fluorescent Protein Tagging. Bij de overgang van telofase naar G1 is het merendeel gegroepeerd in Prenucleolaire Bodies (PNB). Het zijn deze PNB’s die de translocatie uitvoeren van de chromosomen naar de plaatsen waar de rDNA-transcriptie is begonnen. Aangenomen wordt dat de PNB’s fungeren als een assemblageplatform en als een reservoir voor eiwitcomplexen, die de verwerkingseiwitten op de plaatsen van rDNA-transcriptie vrijgeven. Vroege verwerkingseiwitten, zoals fibrillarine, worden gerekruteerd als reactie op een afname van de activiteit van cycline B/Cdk1, terwijl late verwerkingseiwitten, zoals B23 en Nop52, worden gerekruteerd als reactie op de activiteit van cycline-afhankelijke kinase (cdk). Op deze wijze kunnen de verschillende verwerkingseiwitten worden vrijgemaakt precies op het moment dat zij nodig zijn tijdens de rRNA-synthese (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Menselijke ziekten geassocieerd met de nucleolus

Menselijke ziekten geassocieerd met een slechte werking van de nucleolus kunnen worden veroorzaakt door virale infecties, verhoogde nucleolaire activiteit, of eenvoudigweg door aangeboren mutaties die de nucleolaire eiwitten aantasten.

Als een virus een nucleolair targeting signaal (NOS) in zijn genoom bevat, zullen sommige virale deeltjes naar de nucleolus worden geleid. Dit is het geval bij het humane immunodeficiëntievirus (HIV), dat het HIV-1 Rev-eiwit naar de nucleolus dirigeert. Door interactie met het nucleolaire eiwit B23 dient het zijn doel door het splicingpatroon van het HIV-1 mRNA te reguleren, want het bevordert de export van niet-gesplitst mRNA naar het cytoplasma. Er is voorgesteld dat het Rev-eiwit in de nucleolus gelokaliseerd is om een alternatieve translocatieroute te bieden voor viraal (niet-gesplitst/gedeeltelijk gesplitst) mRNA van de nucleoplasma naar het cytoplasma. Op deze wijze wordt het virale mRNA beschermd tegen degradatie (die normaal zou plaatsvinden om de cel te beschermen tegen de translatie van pre(onverwerkt)-mRNA).

Een verhoogde nucleolaire activiteit zal een effect hebben op de overproduktie van ribosomen, hetgeen uiteindelijk zal leiden tot tumorgenese en kanker. Een sleutelfactor in deze disfunctionele nucleoli is het eiwit c-myc, product van het c-myc-proto-oncogen. Het stimuleert de ribosoom biogenese door directe regulatie van pol I, beïnvloeding van de transcriptie van pol II, III en door associatie met de SL1 component van het pre-initiation complex, waardoor de efficiëntie van de rekrutering van pol I aan het pre-initiation complex toeneemt.

Bovendien zijn er verschillende aangeboren mutaties beschreven die de nucleolaire eiwitten beïnvloeden: Weine-syndroom, Treacher Collins-syndroom, en dyskeratosis congenital syndrome (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b; Raška et al. 2006).

Nucleolaire dominantie

Nucleolaire dominantie is ook aangetoond voor rRNA-genen. Bij sommige organismen, met name planten, kan het zich ontwikkelende organisme, wanneer twee kernen tijdens hybridisatie tot één cel worden samengevoegd, één set rRNA-genen “kiezen” voor transcriptie. De rRNA-genen van de andere ouder worden onderdrukt en in het algemeen niet getranscribeerd, hoewel reactivatie van de onderdrukte of “inferieure” rRNA-genen af en toe kan voorkomen. Deze selectieve voorkeur voor transcriptie van rRNA-genen wordt nucleolaire dominantie genoemd.

• Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J. D. Watson. Molecular Biology of the Cell, 2e editie. New York: Garland Publishing, 1989. ISBN 0824036956.

• Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and P. Walter. 2002. Molecular Biology of the Cell, 4e editie. New York: Garland Science. ISBN 0815332181.

• Cooper, G. M., and R. E. Hausman. 2007. De cel: een moleculaire benadering. Washington, DC: ASM Press. ISBN 9780878932191.

• Hernandez-Verdun, D. 2006a. [http://www.springerlink.com/content/75n545v0g3186830 Nucleolus: Van structuur tot dynamiek. Histochem Cell Biol 125: 127-137. Op 8 juli 2008 ontleend.

• Hernandez-Verdun, D. 2006b. De nucleolus: Een model voor de organisatie van nucleaire functies. Histochem Cell Biol 126: 135-148. Op 8 juli 2008 ontleend.

• Khadzhiolov, A. A. 1985. De Nucleolus en Ribosoom Biogenese. Wien: Springer-Verlag. ISBN 3211817905.

• Olson, M. O. J. 2004. The Nucleolus. Georgetown, TX: Landes Bioscience/ Eurekah.Com. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. ISBN 0306478730.

• Olson, M. O. J., and M. Dundr. 2005. The moving parts of the nucleolus. Histochem Cell Biol 123: 203-216. Op 8 juli 2008 ontleend.

• Raška, I., P. J. Shaw, and D. Cmarko. 2006. New insights into nucleolar architecture and activity. International Review of Cytology 255: 177-235. Op 23 juli 2008 ontleend.

• Thiry, M., and L. J. Lafontaine. 2005. Geboorte van een nucleolus: De evolutie van nucleolaire compartimenten. Trends in Celbiologie 15 (4). Op 8 juli 2008 ontleend.

• Thiry, M., and G. Goessens. 1996. The Nucleolus During the Cell Cycle. New York: Springer; Austin, TX: R.G. Landes. ISBN 3540613528.

Alle links opgehaald 14 december 2018.

• Nucleolus onder elektronenmicroscoop II.

Acrosoom | Chloroplast | Cilium/Flagellum | Centriole | Endoplasmatisch reticulum | Golgi-apparaat | Lysosoom | Melanosoom | Mitochondrion | Myofibril | Nucleus | Parenthesoom | Peroxisoom | Plastid | Ribosoom | Vacuole | Vesicle