Choosing proper restriction enzymen based on defined criteria
Om te beginnen met een beknopt voorbeeld, werd tdTomato fluorescent protein gekloond in een alfaretrovirale vector. Vervolgens werd een muriene leukemie cellijn gegenereerd die tdTomato tot expressie brengt. Deze cellijn zal worden gebruikt om tumorcellen te volgen na injectie in muizen in preklinische immunotherapie-studies. Deze kloneringsmethode is echter toepasbaar op elk ander gen. Om het kloneringsproject te beginnen, moet het gen van belang (GOI) worden geanalyseerd. Eerst controleren we of onze geannoteerde sequentie een startcodon (ATG, het meest voorkomende startcodon) en één van de drie stopcodons (TAA, TAG, TGA) heeft. Indien het gen voordien gemanipuleerd werd of gefuseerd werd met een ander gen (bv. via een 2A sequentie), kan het gebeuren dat een gen van belang geen stopcodon heeft. In dergelijke gevallen moet een stopcodon toegevoegd worden aan het einde van uw geannoteerde sequentie. Het is ook nuttig te onderzoeken of je GOI een open leesframe (ORF) bevat. Dit is belangrijk omdat veelvuldige manipulatie van sequenties door software of via klonen per vergissing nucleotiden kan toevoegen of verwijderen. Wij gebruiken Clone Manager-software (SciEd) om ORF’s in onze plasmide-sequenties te vinden; er zijn echter verschillende gratis websites die u kunt gebruiken om ORF’s te vinden, waaronder de NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Het tdTomato-gen bevat ATG-startcodon en TAA-stopcodon (figuur 1). De grootte van het tdTomato-gen is 716 bp.
Overzicht van het begin en het einde van het gen van belang. (A) De nucleotidesequenties aan het begin en het einde van het tdTomato-gen zijn weergegeven. De coderende strengnucleotiden zijn vetgedrukt. (B) De nucleotidesequenties van de voor- en achterwaartse primers met de juiste restrictie-enzymplaatsen en de Kozak-sequentie zijn weergegeven.
In een volgende stap moeten PCR-primers met de juiste restrictie-enzymplaatsen worden ontworpen voor de amplificatie van het GOI. Voor de keuze van de optimale restrictie-enzymen moeten verschillende criteria in aanmerking worden genomen. Ten eerste moeten de bindingsplaatsen voor restrictie-enzymen idealiter beschikbaar zijn op een meervoudige kloneringsplaats binnen de vector. Als alternatief kunnen zij zich stroomafwaarts van de promotor in uw vectorreeks bevinden. Restrictie-enzymen moeten single cutters zijn (single cutters richten zich slechts op één restrictieplaats binnen een DNA-sequentie) (figuur 2A). Indien het dubbele of meervoudige cutters zijn, moeten zij een sequentie doorsnijden die niet noodzakelijk is voor de goede werking van het vectorplasmide en uiteindelijk worden verwijderd (figuur 2B). Het is ook mogelijk te kiezen voor een double cutter of multiple cutter enzymen die de vector stroomafwaarts van de promotor snijden en ook niet binnen een vitale sequentie van het plasmide (figuur 2C). Dubbele cutter- of meervoudige cutter-enzymen hebben respectievelijk twee of meer restrictieplaatsen op een DNA-sequentie. Het snijden van de vector met dubbele of meervoudige snijders zou aanleiding geven tot twee identieke uiteinden. In een dergelijk geval zou de insertiecassette ook dezelfde restrictie-enzymplaatsen aan beide uiteinden moeten bevatten. Wanneer de insert- en vectorfragmenten in een ligatie-experiment worden gemengd, kan de insert dus aan de vector versmelten in de juiste oriëntatie (van startcodon naar stopcodon) of omgekeerd (van stopcodon naar startcodon). Een derde scenario kan zich voordoen, als het vectorfragment een zelf-ligerende cirkel vormt waarin het insert helemaal niet aanwezig is. Nadat het DNA met restrictie-enzymen is geïncubeerd, zal de defosforylering van de 5′- en 3′-uiteinden van het vectorplasmide met behulp van een alkalische-fosfatase-enzym het risico van zelf-ligatie sterk verminderen. Daarom is het belangrijk een kloneringsproduct na fragmentligatie op deze drie producten (juiste oriëntatie, omgekeerde oriëntatie, zelfligatie) te screenen.
Keuze van de juiste restrictie-enzymen op basis van vastgestelde criteria voor PCR-klonering. (A) Twee single-cutter restrictie-enzymen (E1 en E2) bevinden zich stroomafwaarts van de promotor. (B) De E1- en E2-restrictie-enzymen snijden het plasmide stroomafwaarts van de promoter verscheidene keren (hier twee keer voor elk enzym) door. (C) Het E1-restrictie-enzym knipt het plasmide stroomafwaarts van de promoter meer dan één keer door. (D) Het PCR-product, dat het tdTomato-gen en de plaatsen van de restrictie-enzymen bevat, is op een gel gerund voordat het voor downstream-toepassingen is geëxtraheerd.
Ten tweede is het met het oog op een hogere kloneringsefficiëntie bij gebruik van DNA-fragmenten met een kleverig uiteinde wenselijk dat ten minste één (beter nog beide) van de restrictie-enzymen een zogenaamde kleverige-eindsnijder is. Sticky-end knippers knippen het DNA asymmetrisch waardoor complementaire cohesieve uiteinden worden gegenereerd. Stompe eindknippers daarentegen knippen de sequentie symmetrisch en laten geen overhangs achter. Het kloneren van stompe eindfragmenten is moeilijker. Niettemin kan het kiezen van een hogere insert/vector molaire verhouding (5 of meer) en het gebruik 10% polyethyleenglycol (PEG) verbeteren ligatie van blunt-end fragmenten.
Derde, sommige restrictie-enzymen niet gemethyleerd DNA snijden. De meeste stammen van E. coli bevatten Dam- of Dcm-methylases die DNA-sequenties methyleren. Hierdoor zijn ze resistent tegen methyleringsgevoelige restrictie-enzymen. Aangezien vector-DNA meestal in E. coli wordt bereid, zal het worden gemethyleerd. Daarom is het wenselijk methyleringsgevoelige restrictie-enzymen te vermijden; soms is het isoschizomeer van een methyleringsgevoelig restrictie-enzym echter resistent tegen methylering. Het enzym Acc65I is bijvoorbeeld gevoelig, terwijl zijn isoschizomeer kpnI resistent is tegen methylering. Isoschizomeren zijn restrictie-enzymen die dezelfde nucleotidesequenties herkennen. Als er geen andere optie overblijft dan het gebruik van methyleringsgevoelige restrictie-enzymen, moet het vector-DNA worden geprepareerd in dam – dcm – E. coli-stammen. Een lijst van deze stammen en ook van de gangbare E. coli-gastheerstammen voor moleculair kloneren is opgenomen in tabel 1. Informatie over de methyleringsgevoeligheid van restrictie-enzymen wordt gewoonlijk door de fabrikant verstrekt.
Ten vierde wordt het klonen vergemakkelijkt als de buffer die nodig is voor de volledige functionaliteit van restrictie-enzymen dezelfde is, omdat men een dubbele restrictiedigestie kan uitvoeren. Dit bespaart tijd en vermindert het verlies van DNA tijdens de zuivering. Het kan gebeuren dat één van de restrictie-enzymen actief is in één buffer en het tweede enzym in twee keer de concentratie van dezelfde buffer. Het NheI-enzym van Thermo Scientific is bijvoorbeeld actief in Tango 1X buffer (Thermo Scientific) en het EcoR1-enzym is actief in Tango 2X buffer (Thermo Scientific). In dergelijke gevallen moet het plasmide-DNA eerst worden gedigesteerd met het enzym waarvoor de hogere bufferconcentratie nodig is (hier EcoR1). Daarna wordt de buffer voor het volgende enzym (waarvoor een lagere concentratie nodig is (hier NheI)) in dezelfde buffer verdund. De opkomst van universele buffers heeft de dubbele ontsluiting van DNA-sequenties echter vereenvoudigd. In ons voorbeeld bevat de vector de AgeI- en SalI-restrictieplaatsen. Deze enzymsites zijn gebruikt voor het ontwerpen van PCR-primers (figuur 1). Voor een goede restrictie-enzym digestie is het van essentieel belang dat de zuiverheid van het plasmide hoog is. De DNA-absorptie, gemeten met een spectrofotometer, kan worden gebruikt om de zuiverheid na zuivering te bepalen. DNA, eiwitten en oplosmiddelen absorberen respectievelijk bij 260 nm, 280 nm en 230 nm. Een OD 260/280-verhouding van >1,8 en een OD 260/230-verhouding van 2 tot 2,2 wordt voor DNA-monsters als zuiver beschouwd. De OD 260/280- en 260/230-verhoudingen van onze voorbeeldplasmidepreparaten waren respectievelijk 1,89 en 2,22. We merkten op dat de zuiverheid van de gel-geëxtraheerde vector en insert DNA-fragmenten lager waren na restrictie digestie; ligatie werkt zelfs in dergelijke gevallen, maar betere resultaten kunnen worden verwacht met behulp van een hoge zuiverheid fragmenten.
De volgende plasmide repository website kan nuttig zijn voor de selectie van verschillende vectoren (virale expressie en verpakking, lege backbones, fluorescerende eiwitten, induceerbare vectoren, epitoop tags, fusie-eiwitten, reporter genen, soort-specifieke expressie systemen, selectie markers, promoters, shRNA expressie en genoom engineering):http://www.addgene.org/browse/.
Een verzameling kloneringsvectoren van E. coli is beschikbaar op de volgende website:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Het ontwerpen van kloneringsprimers op basis van gedefinieerde criteria
Voor het ontwerpen van PCR-primers controleert u de start- en stopcodons van uw GOI. Zoek de sequentie van de gewenste restrictie-enzymen (beschikbaar op de websites van de fabrikanten) voor de voorwaartse primer (figuur 3A). Deze moet zich vóór de GOI bevinden (figuur 1B). De zogenaamde Kozak-sequentie wordt aangetroffen in eukaryote mRNA’s en verbetert de initiatie van de translatie. Het is gunstig de Kozak-sequentie (GCCACC) toe te voegen vóór het ATG-startcodon, aangezien deze de translatie en expressie van het eiwit van belang in eukaryoten verhoogt. Daarom hebben we GCCACC ingevoegd onmiddellijk na de restrictie-enzymsequentie AgeI en vóór het ATG-startcodon. Vervolgens worden de eerste 18 tot 30 nucleotiden van het GOI vanaf het ATG-startcodon aan de voorwaartse primersequentie toegevoegd. Deze overlappende nucleotiden die zich aan het template-DNA binden, bepalen de annealingtemperatuur (Tm). Deze is gewoonlijk hoger dan 60°C. Hier wordt gebruik gemaakt van Phusion high-fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific). Voor de bepaling van de optimale Tm kan gebruik worden gemaakt van de volgende websites:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Ontwerpen van primers op basis van vastgestelde criteria voor PCR-klonering. (A-B) De sequenties van de voorwaartse en de achterwaartse primer zijn afgebeeld. Het einde van de coderende streng moet worden omgezet in het omgekeerde complementformaat voor het ontwerp van de omgekeerde primer. Zie voor meer informatie de tekst.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
De Tm van onze voorwaartse primer is 66°C.
Kies de laatste 18 tot 30 nucleotiden inclusief het stopcodon van uw GOI voor het ontwerpen van de achterwaartse primer (figuur 3B). Bereken vervolgens de Tm voor deze sequentie, die boven 60°C moet liggen en dicht bij de Tm van de voorwaartse primer. De Tm van de overlappende sequentie van onze omgekeerde primer was 68°C. Voeg vervolgens de doelsequentie van de tweede restrictie-enzymplaats (in dit geval SalI) onmiddellijk na het stopcodon toe. Zet ten slotte deze geassembleerde sequentie om in een omgekeerd-complement-sequentie. De volgende websites kunnen worden gebruikt om de volgorde van de reverse primer te bepalen:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis is belangrijk omdat de reverse primer bindt aan de coderende streng en daarom moet de volgorde (5′ → 3′) reverse-complementair zijn aan de volgorde van de coderende streng (figuur 1A).
Performing PCR using proofreading polymerases
Since the PCR reaction follows logarithmic amplification of the target sequence, any replication error during this process will be amplified. De foutmarge van DNA-polymerasen zonder proofreading, zoals het Taq-polymerase, is ongeveer 8 × 10-6 fouten/bp/PCR-cyclus; proofreading-enzymen zoals Phusion-polymerase hebben echter een gerapporteerde foutmarge van 4,4 × 10-7 fouten/bp/PCR-cyclus. Wegens zijn superieure getrouwheid en verwerkbaarheid is in dit voorbeeld gebruik gemaakt van Phusion DNA-polymerase. Er zij op gewezen dat voor Phusion andere temperatuurvoorschriften gelden dan voor andere DNA-polymerasen. De primer Tm voor Phusion wordt berekend op basis van de Breslauer-methode en is hoger dan de Tm bij gebruik van Taq- of pfu-polymerasen. Voor optimale resultaten moet de Tm worden berekend aan de hand van de informatie op de website van de leveranciers van de enzymen. Voorts zijn, gezien de hogere snelheid van Phusion, 15 tot 30 seconden gewoonlijk voldoende voor de amplificatie van elke kb van de sequentie van belang.
Na de PCR moet het product op een gel worden geladen (figuur 2D). De overeenkomstige band moet worden doorgeknipt en het DNA geëxtraheerd. Het is van essentieel belang dat het PCR-product wordt gesequenteerd, aangezien het PCR-product mutaties kan bevatten. Er zijn verschillende PCR-kloneringskits beschikbaar, waarvan sommige in tabel 2 zijn vermeld. Wij hebben de pJET1.2/blunt-kloneringsvector gebruikt (Thermo Scientific, octrooipublicatie: US 2009/0042249 A1, Genbank-toetredingsnummer EF694056.1) en kloneerden het PCR-product in de gelineariseerde vector. Deze vector bevat een dodelijk gen (eco47IR) dat wordt geactiveerd indien de vector gecirculariseerd raakt. Indien het PCR-product echter in de kloneringsplaats binnen het letale gen wordt gekloond, wordt dit laatste verstoord zodat de bacteriën bij de transformatie kolonies kunnen vormen. Gecirculariseerde vectoren die het PCR-product niet bevatten, brengen het toxische gen tot expressie, waardoor de bacteriën worden gedood en er geen kolonies kunnen ontstaan. Bacteriële klonen worden vervolgens gekweekt, plasmide-DNA achtereenvolgens geïsoleerd en gesequeneerd. De kwaliteit van het geïsoleerde plasmide is essentieel voor optimale sequencingresultaten. We isoleerden het plasmide DNA uit een totaal van 1,5 ml gekweekte bacteriën (opbrengst 6 ug DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) met behulp van een plasmide mini-preparatie kit (QIAGEN). Het hele PCR-proces, inclusief het kloneren van het PCR-product in de sequencingvector en de transfectie van bacteriën met de sequencingvector, kan in één dag worden uitgevoerd. De volgende dag worden de bacterieklonen ’s nachts gekweekt voordat ze voor sequentiebepaling worden verzonden.
Analyse van sequentiegegevens
Sequencingbedrijven rapporteren sequentiegegevens gewoonlijk als een FASTA-bestand en ook als kant-en-klare nucleotidesequenties via e-mail. Voor sequentieanalyse kunnen de volgende websites worden gebruikt:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Hierbij zullen we ons richten op de eerste website. Klik op deze websitepagina op de optie “nucleotide blast” (Figuur 4A). Een nieuw venster wordt geopend. Standaard is de “blastn” (blast nucleotide sequenties) optie aangevinkt (figuur 4B). Vink vervolgens het vakje achter “Align two or more sequences” aan. Er verschijnen nu twee vakjes. In het vak “Enter Query Sequence” (het bovenste vak) voegt u de gewenste sequentie van uw gen van belang in, die wordt geflankeerd door de restrictieplaatsen die u al voor uw PCR-primers hebt ontworpen. In het vak “Enter Subject Sequence” (Onderwerpsequentie invoeren) (het onderste vak), voert u de sequentie in of uploadt u het FASTA-bestand dat u van het sequencingbedrijf hebt ontvangen. Klik dan op de “BLAST”-knop onderaan de pagina. Na een paar seconden worden de resultaten op een andere pagina getoond. Een deel van de alignment-gegevens wordt getoond in Figuur 4C. Voor de interpretatie moeten de volgende punten in aanmerking worden genomen: 1) het aantal identieke nucleotiden (weergegeven onder het item “Identiteiten”) moet gelijk zijn aan het nucleotidenaantal van het gen van uw interesse. In ons voorbeeld was het aantal nucleotiden van het tdTomato-gen samen met die van de restrictie-enzymplaatsen en de Kozak-sequentie 735. Dit komt overeen met het gerapporteerde aantal (figuur 4C). 2) De sequentie-identiteit (onder het item “Identiteiten”) moet 100% zijn. Soms is de sequentie-identiteit 100%, maar is het aantal identieke nucleotiden lager dan verwacht. Dit kan gebeuren als een of meer van de initiële nucleotiden afwezig zijn. Onthoud dat alle sequencing-technologieën een foutenpercentage hebben. Voor Sanger-sequencing varieert dit foutenpercentage naar verluidt van 0,001% tot 1%. Nucleotide-substitutie, -deletie of -insertie kan worden geïdentificeerd door de sequencingresultaten te analyseren. Daarom moet, als de sequentie-identiteit geen 100% bereikt, het plasmide opnieuw worden gesequenced om fouten van de PCR van eenvoudige sequencingfouten te onderscheiden. 3) Gaten (onder het punt “Gaps”) mogen niet aanwezig zijn. Als er hiaten voorkomen, moet het plasmide opnieuw worden gesequenced.
Sequentieanalyse van het PCR-product met behulp van het NCBI BLAST-platform. (A) Op de NCBI BLAST-webpagina is de optie “nucleotide blast” gekozen (aangegeven met de ovale lijn). (B) De “blastn”-optie verschijnt standaard (aangegeven door de cirkel). De sequentie van het gen van interesse (geflankeerd door de restrictieplaatsen zoals eerder ontworpen voor de PCR-primers) en het PCR-product moeten in de vakjes “Enter Query Sequence” en “Enter Subject Sequence” worden ingevoegd. Sequenties kunnen ook als FASTA-bestanden worden geüpload. (C) Nucleotide-uitlijning van de eerste 60 nucleotiden wordt getoond. Twee belangrijke punten voor de sequentieanalyse zijn aangegeven met ovale lijnen.
De gemiddelde lengte van een lees, of leeslengte, is voor Sanger-sequencing ten minste 800 tot 900 nucleotiden. Voor de pJET-vector moeten één voorwaartse en één achterwaartse primer worden gebruikt om het volledige gen te sequencen. Deze primers kunnen normaliter een genomvang tot 1800 bp bestrijken. Als de grootte van een gen groter is dan 1800, moet een extra primer worden ontworpen voor elke 800 extra nucleotiden. Aangezien betrouwbare base-calling niet onmiddellijk na de primer begint, maar ongeveer 45 tot 55 nucleotiden stroomafwaarts van de primer, moet de volgende voorwaartse primer worden ontworpen om te beginnen na ongeveer 700 nucleotiden vanaf het begin van het gen. Verschillende websites, waaronder de volgende, kunnen worden gebruikt om deze primers te ontwerpen:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Met een lengte van 735 bp lag de grootte van het PCR-product in dit voorbeeld ruim binnen het bereik van de pJET-sequencing primers.
Na het kiezen van de sequentie-gecontroleerde kloon, werden vector en insert plasmiden verteerd door de AgeI en SalI restrictie-enzymen (figuur 5). Dit werd gevolgd door gelzuivering en ligatie van de fragmenten. Transformatie van bevoegde E. coli met het ligatiemengsel leverde verschillende klonen op die werden gescreend met restrictie-enzymen. We beoordeelden acht klonen, die alle de tdTomato insert bevatten (figuur 6). Het is belangrijk om klonen te kiezen die groot zijn. Satellietklonen hebben misschien niet de juiste constructie. We gebruikten een snelle plasmide mini-preparatie kit (Zymo Research) om de plasmide te extraheren uit 0,6 ml bacteriële suspensie. De opbrengst en zuiverheid waren bevredigend voor restrictie-enzym-gebaseerde screening (2,3 ug DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Voor grootschalige plasmide zuivering, werd een maxi-preparation kit (QIAGEN) gebruikt om de plasmide extraheren uit 450 ml van de bacteriële cultuur (opbrengst 787 ug DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). De verwachte opbrengst van een pBR322-afgeleide plasmide isolatie van 1,5 ml en 500 ml bacteriële cultuur is ongeveer 2-5 ug en 500-4000 ug DNA, respectievelijk.
Vector en insert plasmide kaarten A) Illustratie van de CloneJET plasmide die het PCR-product. Invoeging van het PCR-product in de kloneringsplaats van het plasmide verstoort de integriteit van het toxische gen eco47IR en maakt de groei van transgeen-positieve klonen mogelijk. Het plasmide werd versneden met de enzymen AgeI en SalI, waardoor twee fragmenten van 3 kb en 0,7 kb werden gegenereerd. Het fragment van 0,7 kb (tdTomato gen) werd gebruikt als insert voor het klonen. (B) Illustratie van de vector plasmide. Het plasmide werd gesneden met de AgeI en SalI enzymen die twee fragmenten van 4,9 kb en 0,7 kb in grootte genereren. Het fragment van 4,9 kb werd gebruikt als vector voor het klonen. AMP: Ampicilline-resistentiegen; PRE: posttranscriptioneel regulerend element; MPSV: promotor van het myeloproliferatieve sarcomavirus.
Screening van het uiteindelijke plasmide met restrictie-enzymen. Illustratie van het uiteindelijke plasmide wordt getoond. Voor screening werd het plasmide doorgesneden met het enzym BsiwI, waardoor twee fragmenten van 4,8 kb en 0,8 kb werden gegenereerd. AMP: Ampicilline-resistentiegen; PRE: posttranscriptioneel regulerend element; MPSV: promotor van het myeloproliferatieve sarcomavirus.
Sommige plasmiden hebben de neiging te recombineren in de bacteriële gastheer, waardoor inserties, deleties en recombinaties ontstaan. In deze gevallen kan het nuttig zijn een recA-deficiënte E. coli te gebruiken (tabel 1). Bovendien kan, als de GOI toxisch is, incubatie van bacteriën bij lagere temperaturen (25-30°C) en gebruik van ABLE C- of ABLE K-stammen het probleem omzeilen.
Virale productie en transductie van doelcellen
Om de in vitro expressie van het gekloonde gen te onderzoeken, werden HEK293T cellen getransfecteerd met plasmiden die coderen voor het tdTomato gen, alfaretrovirale Gag/Pol, en de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVG) enveloppe. Deze cellen, die zijn afgeleid van menselijke embryonale nieren, kunnen gemakkelijk worden gekweekt en getransfecteerd. Daarom worden zij op grote schaal gebruikt in de biotechnologie en gentherapie om viruspartikels te genereren. HEK293T-cellen moeten om de dag worden gesplitst met behulp van warm medium. Zij mogen geen 100% confluentie bereiken voor optimale resultaten. Voor een goede transfectie-efficiëntie moeten deze cellen ten minste een week worden gekweekt om ze in de logfase te brengen. De transfectie-efficiëntie was 22%, zoals bepaald op basis van de expressie van tdTomato door fluorescentiemicroscopie 24 uur later (figuur 7A-B). Voor het genereren van een murine leukemie cellijn waarin het tdTomato gen voor immunotherapie studies, C1498 leukemie cellen werden getransduceerd met vers geoogste virus (36 uur van transfectie). Beeldvormende studies (figuur 7C) en flowcytometrische analyse (figuur 7D) vier dagen na transductie bevestigde de expressie van tdTomato in de meerderheid van de cellen.
Het beoordelen van in vitro expressie van het gekloonde gen. (A, B) HEK293T-cellen werden getransfecteerd met Gag/Pol, VSVG, en tdTomato plasmiden. De expressie van het tdTomato-gen werd beoordeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Fluorescentiebeelden werden gesuperponeerd op een helder-veld beeld voor de differentiatie van positief getransduceerde cellen. De transfectie-efficiëntie werd bepaald op basis van de expressie van tdTomato na 24 uur. Niet-getransfecteerde HEK293T cellen werden gebruikt als controles (blauwe histogram). (C, D) De muriene leukemie cellijn C1498 werd getransduceerd met vers virus. Vier dagen later werd de expressie van het transgen beoordeeld met fluorescentiemicroscopie (C) en flowcytometrie (D). Niet getransduceerde C1498 cellen werden gebruikt als controle (blauw histogram). Schaalbalken vertegenwoordigen 30 urn.
Geef een antwoord