Abstract

Mycobacterium genus veroorzaakt een verscheidenheid van zoönotische ziekten. Het bekendste voorbeeld is de zoönotische tuberculose door M. bovis. Veel minder is bekend over “niet-uberculeuze mycobacteriën (NTM)”, die ook in verband worden gebracht met infecties bij de mens. De Mexicaanse norm NOM-ZOO-031-1995 regelt de aanwezigheid van M. bovis bij vee; er bestaat echter geen regelgeving voor de NTM-soorten. Het doel van deze studie was het isoleren en identificeren van niet tuberculeuze mycobacteriesoorten bij vee van lokale kuddes in de zuidelijke regio van de staat Mexico door middel van de identificatie en detectie van de 100 bp moleculaire marker in het 23S rRNA-gen met daaropvolgende sequencing van het 16S rRNA-gen. Er werden melkmonsters (35) en neusexsudaatmonsters (68) verzameld. Van de 108 geïsoleerde stammen werden er 39 geselecteerd voor identificatie. Dertien uit neusexsudaten geïsoleerde stammen amplificeerden de 100 bp moleculaire marker en werden geïdentificeerd als M. neoaurum (zes stammen), M. parafortuitum (vier stammen), M. moriokaense (twee stammen), en M. confluentis (één stam). Behalve M. parafortuitum zijn de andere geïdentificeerde soorten van belang voor de volksgezondheid en de diergeneeskunde omdat ze pathogeen zijn voor mensen, vooral voor mensen met onderliggende medische aandoeningen.

1. Inleiding

Het genus Mycobacterium veroorzaakt een grote verscheidenheid van zoönotische ziekten. Het bekendste voorbeeld is zoönotische tuberculose door M. bovis, waarvan runderen het voornaamste reservoir zijn. M. bovis maakt deel uit van het “tuberculosecomplex”, waartoe ook de soorten M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae, en M. microti behoren.

Tot de mycobacteriële groep behoren de “niet-uberculeuze mycobacteriën (NTM)”, die ook in verband worden gebracht met infecties bij de mens. De NTM worden aangetroffen in verschillende milieubronnen zoals bodem, water, vegetatie, dieren, zuivelproducten en feces en kunnen onopzettelijk worden overgedragen door inademing, inslikken of huidpenetratie.

De Mexicaanse norm NOM-ZOO-031-1995 regelt de aanwezigheid van M. bovis bij vee ter bestrijding en uitroeiing van rundertuberculose (bTB); er bestaat echter geen regelgeving voor de NTM-soorten. De officiële diagnose van rundertuberculose door de aanwezigheid van M. bovis op het veld is gebaseerd op de intradermale test met een gezuiverd eiwitderivaat (tuberculine) . Hoewel deze test al verscheidene jaren wordt gebruikt, heeft hij geen goede gevoeligheid en specificiteit. Ongeveer 20% van de dieren met tuberculose reageert niet op de test , en de aanwezigheid van andere mycobacteriële soorten, zowel tuberculosis complex als NTM soorten, veroorzaakt interferentie die leidt tot vals-positieve en vals-negatieve diagnoses.

Hoewel Mexico een regelgevende norm heeft, wordt in sommige gebieden een BTB-prevalentie van meer dan 2% gerapporteerd. Gezien de slechte specificiteit en gevoeligheid van de tuberculinetest, is de werkelijke aanwezigheid van M. bovis waarschijnlijk lager en de besmetting van vee met andere mycobacteriën waarschijnlijk hoger. Veehouders, dierenartsen, technici en werknemers in de vee-industrie kunnen dus beroepsmatig blootgesteld worden aan infecties met M. bovis en NTM. Er is zeer weinig bekend over beroepsmatige blootstelling aan zoönosen door NTM-soorten omdat de identificatie van deze soorten een vrij moeilijke taak was vóór de ontwikkeling van identificatietechnieken op basis van moleculaire biologie.

De momenteel meest gebruikte moleculair-biologische technieken voor de diagnose van ziekten veroorzaakt door mycobacteriën zijn restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) voor de diagnose van M. tuberculosis , spoligotypering voor de diagnose van M. bovis , en de opsporing van een “specifieke invoeging” van 100 basenparen (bp) op het 23S rRNA-gen die kenmerkend is voor Gram-positieve bacteriën met een hoog guanine-cytosinegehalte (HGC), en die wordt beschouwd als een moleculaire marker voor deze groep bacteriën , gevolgd door sequentieanalyse van het 16S rRNA-gen voor de identificatie van bacteriën op soortniveau .

Onder de NTM-soorten die met bovengenoemde technieken zijn geïdentificeerd, zijn M. balnei, M. marinum, en M. platypoecilus, die oppervlakkige en diepe huidlaesies hebben veroorzaakt ; M. kansasii van longlaesies ; M. simiae van gegeneraliseerde infecties ; M. scrofulaceum bij infecties van de huid en inwendige organen ; M. szulgai bij longinfecties, osteomyelitis, tenosynovitis en lymfadenitis ; M. ulcerans bij subcutane granulomen ; M. fortuitum en M. chelonae geassocieerd met vasculitis, endocarditis, osteomyelitis, mediastinitis, meningitis, keratitis, en hepatitis ; M. abscessus, geassocieerd met erythemateuze laesies die evolueerden tot ulcereuze nodules ; en andere species.

Het grootste percentage van de staatsinventaris voor runderkoppen in de staat Mexico in Mexico is geconcentreerd in de zuidelijke regio, en een van de belangrijkste economische activiteiten is de veehouderij . De Mexicaanse verordening voor veecontrole NOM-ZOO-031-1995 richt zich alleen op de tuberculinetest voor de diagnose van M. bovis. Er is weinig bekend over de aanwezigheid van NTM bij het vee in de regio. Gezien de mogelijkheid om actinobacteriesoorten te identificeren door detectie van de 100-basenpaar moleculaire marker op het 23S rRNA-gen en de daaropvolgende sequentiebepaling van het 16S rRNA-gen, is het mogelijk om de bovengenoemde NTM-soorten te identificeren.

Het doel van de huidige studie was het isoleren en identificeren van NTM-soorten bij runderen van de zuidelijke regio van de staat Mexico. De Mycobacterium-soorten werden geïsoleerd uit monsters van neusexsudaat en rundermelk en geïdentificeerd door detectie van de 100-base-paar moleculaire marker in het 23S rRNA-gen met daaropvolgende sequencing van het 16S rRNA-gen.

2. Materialen en methoden

2.1. Bemonstering

Een bemonstering werd uitgevoerd op basis van de ruimtelijke verdeling van beslagen positief voor rundertuberculose in de staat Mexico uitgevoerd door Zaragoza et al. 2015 . Vier rundveekuddes werden geselecteerd in de zuidelijke regio van de staat Mexico, één kudde behorend tot de gemeente Temascaltepec en drie kuddes behorend tot de gemeente Zacazonapan. In totaal werden 103 monsters, 35 melkmonsters en 68 monsters neusexsudaat, verzameld. De verdeling van het aantal en het type van de verzamelde monsters in elk beslag is weergegeven in tabel 1.

.

Karakteristiek Herd 1 Herd 2 Herd 3 Herd 4 Totaal
Gemeente Temascaltepec Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan
Breed F1 Swiss-Cebu Holstein Friesian Holstein Friesian Holstein Friesian
Geografische ligging La-19°03′13.7′′Lo-100°13′36.7′′ La-19°03′39.5′′Lo-100°16′30.9′′ La-19°04′0.4′′Lo-100°15′11.5′′ La-19°03′41′′Lo-100°16′06′′′
Geschiedenis van bTB Prevalentie Prevalentie Prevalentie Prevalentie
Verkregen monsters
Melk 15 20 0 0 35
Nasaal exsudaat 0 18 23 27 68
103
La: breedtegraad; Lo: lengtegraad; bTB: rundertuberculose. verkregen van het Comité voor de promotie en de bescherming van de veestapel van de staat Mexico.
Tabel 1
Stalen die zijn genomen bij rundveebeslagen in de zuidelijke regio van de staat Mexico.

2.2. Het verkrijgen van monsters van melk en neussudaat

De uier en de tepels werden gereinigd met gezuiverd water en zeep en vervolgens gedroogd met papieren handdoeken, en vervolgens werd een tepelasepsis uitgevoerd met in 70% alcohol gedrenkte swabs. Vijf milliliter melk werd rechtstreeks van de tepel opgevangen in steriele 20 ml vaatjes, waarbij de eerste stroom werd weggegooid. Neusexsudaat werd rechtstreeks van de binnenkant van de neusopening verzameld met een 10 cm lange steriele swab, die vervolgens werd ondergedompeld in een isotone zoutoplossing (0,85%). De melk- en neusexsudaatmonsters werden tot de verwerking bij 4°C bewaard

2.3. Verwerking van de monsters
2.3.1. De melkmonsters werden gecentrifugeerd bij 2500 toeren per minuut (rpm) gedurende 10 minuten. De pellets van de melk- en neusexsudaatmonsters werden geënt in het volgende kweekmedium dat selectief is voor mycobacteriën: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521), en Middlebrook (BD BBL 254521), aangevuld met 6 g natriumpyruvaat per liter (Middlebrook-P). De geïnoculeerde media werden gedurende 8 weken geïncubeerd bij 37°C en werden om de 3 dagen beoordeeld.

2.3.2. Indeling van geïsoleerde stammen

De geïsoleerde stammen werden in groepen verdeeld op basis van de volgende kenmerken: kolonie pigmentatie, groeitijd, en kolonie kenmerken (vorm, consistentie, textuur, en pigment productie). Geïsoleerde stammen werden gekleurd met Ziehl-Neelsen om de aanwezigheid van zuurvaste bacillen (AFB) te bevestigen. DNA-extractie

Stammen met microscopische kenmerken die lijken op mycobacteriën (zuurvaste-positiviteit) en twee representatieve stammen van elke groep werden geselecteerd voor identificatie. Om biomassa te verkrijgen werden de stammen geënt in 30 ml vloeibaar kweekmedium van Middlebrook (BD BBL 254521) in kolven van 125 ml en gedurende 7 dagen geïncubeerd bij 37°C. Het vloeibare medium werd overgebracht in steriele Falcon-buizen van 15 ml en gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 14.000 rpm. Vervolgens werd het supernatant verwijderd en de pellet overgebracht in Eppendorf-buisjes van 1,5 ml; de buisjes werden vervolgens gecentrifugeerd bij 14.000 rpm × 5 minuten, en het supernatant werd weggegooid. DNA-extractie werd uitgevoerd op de resulterende pellet met behulp van de Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega A1120).

2.5.

2.5. Detectie van de moleculaire marker in het 23S rRNA-gen

De 100 bp moleculaire marker in het 23S rRNA-gen werd geamplificeerd volgens de methode beschreven door Roller et al. (1992) met behulp van de volgende primers: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, en 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

De reactie werd uitgevoerd met een commercieel Taq DNA-polymerase (Promega M1661). De volgende thermische cycluscondities werden gebruikt: een predenaturatiestap gedurende 5 minuten (94°C); 29 cycli van denaturatie gedurende 30 seconden (94°C), hybridisatie gedurende 45 seconden (46°C), en elongatie gedurende 50 seconden (72°C); en tenslotte een postelongatiecyclus van 5 minuten (72°C). De geamplificeerde fragmenten werden bevestigd op een 2% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide (SIGMA 46065).

2.6. 2.6. Amplificatie van het 16S rRNA-gen

Strains die de fylogenetische marker van 100 bp amplificeerden, werden geselecteerd voor sequentieanalyse met behulp van 16S rRNA. Voor de amplificatie werden de volgende primers gebruikt: 8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG en 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

De reactie werd uitgevoerd met een commercieel Taq DNA-polymerase (Promega M1661). De volgende thermische cycluscondities werden gebruikt: een predenaturatiestap gedurende 5 minuten (94°C); 34 cycli van denaturatie gedurende 30 seconden (94°C), hybridisatie gedurende 20 seconden (52°C), en elongatie gedurende 1 minuut 30 seconden (72°C); en tenslotte een postelongatiecyclus van 7 minuten (72°C).

De geamplificeerde fragmenten werden bevestigd op een 1% agarosegel gekleurd met ethidiumbromide (SIGMA 46065). De producten van deze amplificatie werden gezuiverd met behulp van de Amicon Ultra Filter® kit (Millipore UFC901008) en bevestigd op een 1% agarose gel om hun aanwezigheid en kwaliteit te verifiëren.

2.7. Identificatie van Mycobacterium-soorten

De geamplificeerde producten van het 16S rRNA-gen werden opgestuurd naar de Macrogen Sequencing Service, Maryland, VS. De verkregen sequenties werden geanalyseerd en gecorrigeerd met behulp van het BioEdit programma. Consensussequenties werden geconstrueerd uit de voorwaartse en achterwaartse fragmenten, die werden vergeleken met sequenties die eerder waren gedeponeerd in GenBank van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) met behulp van het programma BLAST en EzTaxon 2.1 .

2.8. Fylogenetische analyse

Sequenties van het 16S rRNA-gen werden verkregen voor de volgende mycobacteriële soorten uit de American Type Culture Collection (ATCC) en de German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , en M. confluentis . De sequenties van de verzamelstammen en die van de in dit onderzoek geïsoleerde stammen werden uitgelijnd met het BioEdit-programma . Fylogenetische analyse werd uitgevoerd met behulp van de maximale parsimony methode in MEGA software versie 4 . Om de wortel van het cladogram te vormen, werd de sequentie van Pantoea agglomerans DSM 3493 gebruikt.

3. Resultaten

De 108 stammen geïsoleerd uit de 103 verzamelde stalen werden verdeeld in 13 groepen volgens hun macroscopische en microscopische morfologische karakteristieken (Tabel 2). Vooral de groepen 11 en 12 bestonden uit zuurvaste stammen.

Groep Aantal stammen Morfologische kenmerken Moleculaire marker (bp)
Macroscopisch Microscopisch 23S rRNA
Pigmentatie Opzicht Ziehl-Neelsen
1 29 Geel Crèmeachtig – 250
2 10 White Creamy – 250
3 14 White Dry – 250
4 2 Salmon Creamy – 250
5 2 Zalm Droog – 250
6 2 Wit, donker Crèmeachtig – 250
7 2 Wit Crèmeachtig – 250
8 3 Wit, donker Droog – 250
9 4 Wit Droog – 250
10 10 Wit Crèmekleurig, droog – 250
11 10 Wit Droog + 350 en 250
12 7 Geel Crèmeachtig + 350
13 13 Wit Droog – 250
-: afwezigheid van zuurvaste bacillen; +: aanwezigheid van zuurvaste bacillen; Bp: basenparen.
Tabel 2
De geïsoleerde stammen zijn gegroepeerd volgens hun morfologische kenmerken en de aanwezigheid van de moleculaire marker (100 bp) op het 23S rRNA-gen.

Voor identificatie op soortniveau werden 39 stammen gekozen: 10 daarvan behoorden tot groep 11 en 7 tot groep 12. Uit elk van de resterende 11 groepen werden twee stammen geselecteerd om het aantal van 39 stammen te completeren. De moleculaire merker van 100 bp werd bij 33% (13/39) van de geselecteerde stammen gevonden. Voor hen werd het 16S rRNA-gen geamplificeerd voor sequencing en identificatie op soortniveau.

De totale prevalentie van NTM op de verzamelde monsters was 12,6% (13/103) voor zowel melk- als neusexsudaatmonsters. De specifieke prevalentie voor nasale exsudaatmonsters was echter 19,1% (13/68).

Volgens de sequentievergelijking werden vier NTM-soorten van het genus Mycobacterium geïdentificeerd; 64% (6/13) van de stammen vertoonde 98% en 99% overeenkomsten met M. neoaurum, terwijl 31% (4/13) een overeenkomst van 99% had met M. parafortuitum, 15% (2/13) overeenkomsten van 98% en 99% had met M. moriokaense, en, tenslotte, 8% (1/13) een overeenkomst van 99% had met M. confluentis (Tabel 3).

Stam Herkomst van de kudde Kweekmedium Gemplificeerd fragmentgrootte (bp) Gelijkenis (Blast) % Gelijkenis (EzTaxon) %
1-AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3
2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1
3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2
5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.2
8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0
12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4
4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9
10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4
11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2
13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2
7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1
2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.
Tabel 3
Vergelijking van de 16S rRNA-gensequenties van bij runderen geïsoleerde stammen met de in GenBank gedocumenteerde stammen, met behulp van BLAST en EzTaxon.

De fylogenetische boom werd gevormd met het genus Mycobacterium en vier van zijn soorten waarmee de fylogenetische relaties tussen de verzamelstammen en de in dit onderzoek geïsoleerde stammen werden waargenomen (figuur 1).

Figuur 1
Phylogenetische boom geconstrueerd door vergelijking van de 16S rRNA-gensequenties van de geïsoleerde en referentiestammen.

4. Discussie

De NTM-soorten werden alleen geïsoleerd uit monsters van neusexsudaat, waardoor de monsters van een van de lokale boerderijen van deze studie werden geëlimineerd (tabel 1). Wij stelden vast dat de specifieke prevalentie 19,1% bedroeg in beslagen van de zuidelijke regio van de Staat Mexico. Vergelijkbare studies in de Verenigde Staten, Zuid-Afrika, Tanzania en Brazilië rapporteerden NTM-prevalentiewaarden van respectievelijk 3,4%, 24,5%, 7% en 7,8%; daarom ligt de in deze studie gevonden prevalentiewaarde binnen het eerder gerapporteerde bereik. In deze studie werden 13 van de 39 geanalyseerde stammen geïdentificeerd als de NTM-soorten M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis, en M. parafortuitum.

M. neoaurum, een lid van het Mycobacterium parafortuitum complex, is verantwoordelijk voor een breed spectrum van ziekten, waarvan de meeste apparaatgerelateerde infecties zijn, zoals Hickman katheters, BROVIAC katheters, PICC lijnen , arterioveneuze fistels die een polytetrafluorethyleen graft bevatten , pace makers , en protheseklep endocarditis . Immuungecompromitteerde patiënten die in het bezit zijn van deze hulpmiddelen zijn de voornaamste gastheren, bijvoorbeeld kankerpatiënten en diabetici met nierfalen en hartproblemen. M. neoaurum is ook geïsoleerd bij patiënten met urineweginfecties , meningoencefalitis en veranderingen in het centrale zenuwstelsel , bacteriëmie en endocarditis , en longinfectie . Hoewel het voornamelijk geïsoleerd is uit klinische gevallen, zijn er ook rapporten over de isolatie uit melk en vee.

M. moriokaense werd geïsoleerd uit sputummonster. Hoewel hij als niet-pathogeen voor de mens wordt beschouwd, is hij in verband gebracht met longziekten. M. confluentis werd ook geïsoleerd uit sputummonsters, en samen met M. parafortuitum worden beide soorten beschouwd als niet-pathogeen. M. confluentis, M. moriokaense, en M. neoaurum zijn geïsoleerd uit verschillende weefsels van runderen en in het wild levende dieren met tuberculoseletsels, terwijl M. parafortuitum alleen geïsoleerd is uit melk van runderen . In ons werk werd M. parafortuitum echter alleen geïsoleerd uit nasale exsudaatmonsters.

De voedingsbehoeften van mycobacteriën verschillen tussen verschillende soorten, wat de reden was voor het gebruik van verschillende kweekmedia. Met name werden zeven van de 13 in deze studie geïdentificeerde stammen geïsoleerd in Stonebrink medium, waaronder M. neoaurum, M. parafortuitum, en M. moriokaense. Dit resultaat komt overeen met dat van Sepúlveda et al. die aangaven dat Stonebrink-medium geschikt is voor de recuperatie van verschillende soorten van het genus Mycobacterium. García-Martos en García-Agudo meldden dat Middlebrook-medium optimaal is voor de isolatie van actinomyceten, hetgeen overeenkomt met het onderhavige onderzoek, aangezien twee soorten, M. neoaurum en M. parafortuitum, in dit medium werden geïsoleerd. Met name M. confluentis werd alleen geïsoleerd in Middlebrook-medium aangevuld met natriumpyruvaat; de strategie van het gebruik van verschillende kweekmedia was dus geschikt omdat daardoor verschillende soorten van het genus Mycobacterium konden worden geïsoleerd.

De detectie van de moleculaire marker die aanwezig is in het 23S rRNA-gen van Gram-positieve bacteriën met HGC-gehalte maakte het mogelijk onderscheid te maken tussen stammen van eubacteria en mycobacteria. De sequentieanalyse van het 16S rRNA-gen maakte de identificatie op soortniveau mogelijk; daarom is de combinatie van deze methodologieën geschikt voor de identificatie van NTM-soorten.

5. Conclusies

Met behulp van de in deze studie beschreven methodologie werden vier NTM-soorten geïsoleerd en geïdentificeerd: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum, en M. parafortuitum. Deze soorten werden voor het eerst geïsoleerd uit neusexudaten van runderen uit de zuidelijke regio van de staat Mexico. Drie van de geïdentificeerde soorten (M. neoaurum, M. moriokaense, en M. confluentis) zijn van openbaar gezondheids- en veterinair belang.

Bekendmaking

Dit werk is afgeleid van het proefschrift voor de graad van Doctor in de Gezondheidswetenschappen (Universidad Autónoma del Estado de México), geregistreerd in het PNPC-CONACYT.

Belangenconflicten

Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Erkenningen

De auteurs willen graag de financiële steun van het Secretariaat voor Onderzoek en Geavanceerde Studies van de Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) erkennen door middel van de volgende onderzoekssubsidies: (i) “Implementatie van geografische informatiesystemen en technieken van moleculaire biologie, als hulpmiddelen bij de detectie en identificatie van Mycobacterium spp.,” SIEA-UAEM 3486/2013CHT, en (ii) het netwerk “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud,” 039/2014RIF.