Resultaten en Discussie

Structuur van het TE-domein. Hoewel de structuur van het geïsoleerde TE-domein dat werd opgelost twee onafhankelijke moleculen (1 en 2) in de asymmetrische eenheid vertegenwoordigt (tabel 1), werd het domein gezuiverd en volledig actief als een monomeer (Z.G. en B.C., ongepubliceerde gegevens). Native menselijk FAS is gerangschikt als een kop-staart antiparallel homodimer (1) zoals onlangs gevisualiseerd in de elektron cryo-microscopie (cryo-EM) kaarten (31). Deze opstelling zou de twee TE domeinen van de FAS monomeren aan tegenovergestelde uiteinden van elkaar plaatsen, waardoor er geen functionele relevantie is voor de vorming van een dimeer. Om deze redenen is het dimeer een artefact van de kristallisatie. De structuur van molecuul 1 wordt hierna als representatief beschouwd.

Het TE-domein van menselijk FAS bestaat uit twee subdomeinen (A en B) (Fig. 1). Het grotere subdomein A (≈23 kDa) bestaat uit twee niet-samenhangende segmenten van de amino- (of N-) en carboxyl- (of C-) uiteinden (Figs. 1, 2, 3). Het tussenliggende segment is ingedeeld bij het kleinere (≈9-kDa) subdomein B. Subdomein A heeft een algehele α/β-vouwing, terwijl subdomein B een volledig α-helicaal motief heeft. De gehele structuur bestaat uit negen α-helixen en acht β-strengen (fig. 1 en 2). Het grootste deel van de gehele TE-domein structuur kon worden ingepast in de elektronendichtheid, met uitzondering van de drie segmenten en een glycine residu in Figs. 1, 2, 3, met ontbrekende of zwakke dichtheid, wat duidt op hun hoge mobiliteit. Alle ongeordende segmenten bevinden zich in gebieden die blootgesteld zijn aan oplosmiddelen en komen niet in de buurt van betrokkenheid bij kristalcontacten.

De drie katalytische residuen van de menselijke FAS TE (Ser-2308, His-2481, en Asp-2338) zijn met elkaar en de naburige residuen verbonden door een uitgebreid waterstofbruggennetwerk (Fig. 4). De hydroxylgroep van Ser-2308 is betrokken bij een coöperatieve waterstofbrug, die van het aangrenzende amide ruggengraat van Tyr-2309 accepteert en doneert aan Nε2 van His-2481. Dit zou op zijn beurt de activering van Ser-2308 als nucleofiel vergemakkelijken en helpen bij het stabiliseren van het oxyanion tetrahedral intermediair dat zich naar verwachting zal vormen tijdens de TE katalytische reactie zoals gezien in serine hydrolases. Het residu His-2481 (Nε2) is op zijn beurt waterstofgebonden aan Asp-2338 (Oδ2). Het Asp-2338 (Oδ1 atoom) maakt extra waterstofbruggen met zowel de backbone amide van Ala-2448 als de hydroxylgroep van Tyr-2462. Tyr-2462 is volledig invariant, terwijl Ala-2448 gedeeltelijk geconserveerd is van insecten tot zoogdieren (Fig. 3). Vandaar dat de interactie tussen deze residuen en het katalytische aspartaat residu belangrijk lijkt te zijn om Asp-2338 in zijn specifieke positie gefixeerd te houden, hetgeen de belangrijke rol die dit residu speelt nog eens onderstreept. Het uitgebreide waterstofbruggennetwerk op de katalytische plaats houdt het enzym klaar voor actie door de katalytische residuen op hun vereiste posities te oriënteren en te plaatsen, net als in serinehydrolasen (40).

Palmitoylketenbindingsplaats en ketenlengtespecificiteit. Om inzicht te krijgen in het mechanisme waarmee het TE-domein van FAS de ketenlengtespecificiteit regelt, hebben we de TE-structuur geanalyseerd op de aanwezigheid van een groef dicht bij het katalytische centrum die lange vet-cylketen-substraten zou kunnen bevatten. De aanwezigheid van slechts één groef is duidelijk, die zich bevindt op het grensvlak tussen de subdomeinen A en B (Fig. 5). Analyse met behulp van proshape (zie Materialen en Methoden) bevestigde de aanwezigheid van de groef met een volume van 186,9 Å3 en een oppervlakte van 140 Å2, waarvan het distale uiteinde een holte vormt (Fig. 5). De groef bevindt zich dicht bij de amino terminus van het TE-domein, dat verbonden is met het ACP-domein van FAS dat de groeiende acyl-ketens vasthoudt voor scanning en vrijgave door het TE-domein na het bereiken van de optimale 16 koolstof vetzuurketenlengte. De meeste residuen die de groef bekleden zijn afkomstig van de ampifiele helix α8 van subdomein B. Andere residuen die tot de groef bijdragen zijn afkomstig van helix α5 van subdomein B, de N-terminale helix α1 van subdomein A, en de lus tussen β2 en α2 van subdomein A. De residuen langs de groef, die meestal hydrofoob van aard zijn, bestaan uit Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423, en Lys-2426 van helix α8, Phe-2370 en Phe-2371 van helix α5, Leu-2222, Leu-2223, en Val-2224 van helix α1, en Ile-2250 en Glu-2251 van de lus tussen β2 en α2 (Fig. 5A ). Van deze residuen zijn Ile-2250, Glu-2251, en Lys-2426 invariant tussen de soorten, terwijl Val-2224, Phe-2371, Ala-2419, en Phe-2423 grotendeels geconserveerd zijn (Fig. 3). De rest van de residuen zijn volledig geconserveerd bij zoogdieren (Fig. 3). Alle bovenstaande waarnemingen tezamen suggereren dat het raakvlak tussen de twee subdomeinen een uitstekende vetzuurketenbindingsregio is. Twee experimenten werden ondernomen om deze suggestie te staven en inzicht te verkrijgen in de selectiviteit van de vetzuurketen.

Fig. 5.

Lipide bindingsplaats. (A) Stereoview van de kandidaat palmitoyl bindingsgroef voor de eerste 11-12 carbons en de pocket voor de laatste 5-4 carbons. De hexadecylsulfonylremmer wordt voorgesteld als een Corey-Pauling-Koltun ruimtevullend model (C, geel; O, rood; S, groen). De zijketens langs de groef zijn weergegeven als ball-and-stick figuurtjes (C, geel; O, rood; N, blauw). De zijketens die samen de actieve plaats vormen, worden ook weergegeven als ball-and-stick figuurtjes met een kleurenschema dat vergelijkbaar is met dat van de residuen. De kaart van het oppervlak van de groef is weergegeven in een groen draadraster. De residuen die de groef vormen zijn gelabeld, behalve Ile-2250, dat niet te zien is omdat het onder de inhibitor valt. De eerste 11-12 koolstofatomen van de sulfonylgroep zijn blootgesteld aan oplosmiddelen met de 11e en 12e koolstofatomen aan de mond van de zak. (B) Een ander beeld van de groef en de holte. De pijlen geven de rotaties aan van de oriëntatie van het aanzicht in A naar B. Dit aanzicht toont aan dat het grootste deel van de vette acylketen van de hexadecylremmer blootgesteld is aan het oplosmiddel.

Voreerst toonden wij met gerichte mutagenese aan dat vervanging van verscheidene residuen die de groef en de zak van het TE-domein bekleden, de TE-activiteit verminderde, zij het in verschillende mate (tabel 2).

Bekijk deze tabel:

  • View inline
  • View popup

Tabel 2. Mutaties in de kandidaat-bindingsgroef verminderen de activiteit van TE

Ten tweede konden we de binding van een C16 palmitoylketen-bevattende remmer hexadecyl sulfonyl f luoride (HDSF) in de groef modelleren. De modellering werd geleid door de gegevens van de kristalstructuur van palmitoyl-eiwit TE 1 (PPT1) met covalent gebonden hexadecylsulfonaat (HDS) (PDB ID code 1exw; ref. 41) en aangevuld met energieminimalisatie in cns. Net als TE bevat de katalytische plaats van PPT1 een geconserveerde katalytische triade van serine, histidine, en aspartaat. De structuur van het PPT1-HDS complex toonde de vorming van de covalente binding tussen het zwavelatoom van HDS en het zuurstofatoom van het katalytische serine en de aanwezigheid van de vette acylketen in een lange overwegend hydrofobe oppervlaktegroef van het eiwit (41). De gemodelleerde covalent gebonden HDS in de TE structuur (getoond in Fig. 5) onthulde verschillende kenmerken van ligand binding met belangrijke functionele en biochemische implicaties. Het passen van de HDS veroorzaakte geen grote herschikking van de residuen in de bindingsplaats. De palmitoylketen maakt een scherpe bocht ten opzichte van de sulfonaatgroep op een vergelijkbare manier als gezien in de gebonden PPT1 structuur. De 16 koolstofatomen tellende palmitoylketen past goed in de groef, waarbij de eerste ≈12 koolstofatomen zijn blootgesteld aan het oplosmiddel en de resterende ≈4 koolstofatomen zijn ingebracht en op hun plaats worden gehouden in de distale zak. Deze fit is volledig in overeenstemming met de waarneming dat FAS TE bij zoogdieren de vorming van palmitinezuur katalyseert als zijn belangrijkste product (20). De aanwezigheid van de laatste ≈4 koolstofatomen in de holte helpt de vetzuurketen op zijn plaats te houden voor de hydrolyse van het palmitoyl acylsubstraat. De aard van de bindingsplaats, die een blootliggende groef combineert met een gesloten holte, is uniek en ontworpen voor de specificiteit van deze TE. De bevinding dat het TE-domein van zoogdier-FASs geen significante activiteit vertoont ten opzichte van vetzuren met een ketenlengte korter dan 14 koolstofatomen (20) kan worden verklaard door niet-productieve binding als gevolg van het ontbreken van tethering en de daaruit voortvloeiende grotere beweeglijkheid van de blootliggende kortere ketens. De laatste ≈4 koolstofatomen van de palmitoylketen bezetten gedeeltelijk de distale holte, waardoor er genoeg ruimte overblijft om slechts 2 extra koolstofatomen te herbergen. Dit resultaat is consistent met het dramatische verlies in activiteit gezien met modelsubstraten langer dan 18 koolstofatomen (20). Het is onduidelijk of de laatste ≈4 en ≈6 koolstofatomen van respectievelijk de C16 en C18 vet-cyl-ketens in een voorgevormde holte tussen de twee subdomeinen worden ingebracht, zoals te zien is in de structuur van de ongebonden vorm, of dat ze in eerste instantie worden gebonden aan een open vorm van het domein dat vervolgens een scharnier-bochtbeweging tussen de subdomeinen ondergaat om de eindkoolstofatomen van de vet-cyl-ketens in te sluiten en de productieve configuratie van het actieve gebied te creëren.

Er is veel moeite gedaan om TE te kristalliseren met verschillende analogen van lange-keten vetzuren (b.v, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, palmitinezuur, hexadecylsulfonylfluoride, en palmitinezuur), maar er werden geen langlevende stabiele complexstructuren gevonden. De meeste complexen, zoals aangetoond door onafhankelijke enzymactiviteit of radioactieve bindingsproeven in oplossing, dissocieerden binnen 5 min tot 1 uur, waardoor ze ongeschikt werden voor kristallisatie of kristal weken proeven.

Cryo-EM Fit van TE Structuur. Hoewel de 20-Å cryo-EM reconstructie structuur van de menselijke FAS dimeer is beschreven (31), was er geen indicatie van de N- tot C-terminale polariteit van de FAS subeenheid met uitzondering van een eerdere indicatie van antilichaam labeling dat de FAS TE domein was gelegen aan een van de uiteinden van de gehele structuur (42). We probeerden een voorlopige beoordeling van de polariteit door handmatig de kleinere (32 kDa) menselijke FAS TE domein structuur te koppelen, die het C-terminale uiteinde van de FAS subeenheid bezet, en de grotere (42 kDa) E. coli β-ketoacyl synthase I (of KSI) kristalstructuur (PDB ID code 1ek4) (43), die een nauwe homoloog is van het N-terminale KS domein van zoogdier FAS, in elk uiteinde van de monomere eenheid aangeduid als hoofd en voet van de cryo-EM massadichtheid (Fig. 6). De TE-structuur past goed in het uiteinde van de substructuur aangeduid voet, terwijl de KSI het best past in het uiteinde van de substructuur aangeduid hoofd (Fig. 6). In het FAS-dimeer interageert het ACP-domein met zowel het TE-domein van hetzelfde monomeer als het ketoacylsynthasedomein in het tegenoverliggende monomeer, wat leidt tot de vorming van twee actieve centra aan de twee uiteinden van het dimeer. De oriëntatie van het TE domein en het KS domein homoloog voor de beste passing aan de voet en kop, respectievelijk, zorgde voor zowel ruimte als functionele interactie van het ACP molecuul met beide eiwitten. Wanneer de structuren werden verwisseld, was de passing veel slechter, met sommige delen van KS-domein die buiten de dichtheid vielen en een groter volume van onverantwoorde dichtheid in de TE fit (Fig. 6).

Fig. 6.

Preliminaire fit van TE (groene backbone spoor) en KSI (kastanjebruine spoor) in de 20-Å resolutie cryo-EM massa dichtheid. De substructuren die uit de dichtheid naar voren komen, worden aangeduid als Hoofd, Romp en Voet. Het TE-spoor past het best in de substructuur die Foot wordt genoemd, terwijl het KSI-backbone-spoor het best past in de substructuur die Head wordt genoemd. De beste passing voor zowel KSI als TE is in rood omcirkeld. De backbone-sporen van TE en KSI aan de onderkant van de massadichtheid passen minder goed in respectievelijk het hoofd en de voet. Op basis van voorafgaande proteolytische digestie-experimenten van intact FAS werden drie domeinen geïdentificeerd: domein I, dat de KS-AT/MT-DH enzymcentra en de linker regio omvat; domein II, dat de ER-KR-ACP regio omvat; en domein III, dat wordt toegewezen aan de TE (1, 2). De Head en Torso substructuren, die in essentie zijn samengesmolten, zouden kunnen corresponderen met domein I en delen van domein II, en de Foot zou de rest van domein II en domein III kunnen vertegenwoordigen.

Conclusies. De voornaamste conclusies die kunnen worden getrokken uit de kristalstructuur van het TE-domein van het menselijke FAS zijn de volgende. (i) Het TE is samengesteld uit twee subdomeinen die verschillen in grootte en vouwmotieven. (ii) Het grotere A-subdomein vertoont een α/β-motief, terwijl het kleinere B-subdomein volledig spiraalvormig is. (iii) Subdomein A draagt bij aan de katalytische triade van Ser, Asp, en His residuen. (iv) De lange groef met een distale holte tussen subdomein B en delen van subdomein A vormt de bindingsplaats voor de vette acylketen. De geometrie en de aard van deze plaats zijn in overeenstemming met de hoge specificiteit van de TE voor C16- tot C18-vetzuursubstraten. De groef werkt als een liniaal die de juiste substraatlengte meet. (v) De voorlopige inpassing van de TE in de cryo-EM structuur van het menselijke FAS suggereert een plausibele N-C terminus polariteit van de subeenheden. Een hogere resolutie cryo-EM kaart is echter nodig voor verdere verificatie van de fit en een diepgaande analyse van de FAS functie.