Trp53 ヌルおよび R270H 変異アレルはマウス大腸腫瘍形成における浸潤、転移および遺伝子発現の制御において同等の効果を有する

CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK) mouseにおいて、Missense and null Trp53変異はマウス結腸腫瘍進行を促進させる。 a CDX2P-CreERT2AK（AK）マウス（n＝10、生存期間中央値＝336日）、CDX2P-CreERT2AKP270/+（AKP270/+）マウス（n＝16、生存期間中央値＝166日）のカプラン-マイヤー生存曲線。 CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) マウス（n = 16、生存期間中央値 = 97日）および CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) マウス（n = 20、生存期間中央値 = 88日）。 TAMは2日間毎日投与し、時間0はこのうちの2日目を表す。 P値は、以下の比較において、log-rank検定によって得られた。 AK vs. AKP270/+のP = 1.4E-6; AKPfl/fl vs. AKP270/+のP = 1.4E-7; AKP270/fl vs. AKP270/+のP = 1.9E-8 b AKマウス、AKP270/+マウス、AKPflマウスおよびAKP270/+マウスの異なる深さの侵入を持つ大腸腫瘍のパーセンテージを示す。 データは、マウスあたりの複数の病変から得たものである（1群あたりn = 10-14マウス）。 Fisher Exact検定およびExact Poisson検定に基づくP値を、それぞれ表1および補足表1に示す。 エラーバーは平均値の標準誤差である。 a adenoma, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d AKP270/fl マウス（c）と AKPfl/fl マウス（d）の近位結腸（右）と盲腸（左）組織からの代表的浸潤腫瘍の Hematoxylin and eosin (H&E) staining を示している． c）および（d）の腫瘍は、TAM注入後3ヶ月で回収した。 高倍率の画像は下のパネルに示されており、対応する上のパネルでは低倍率の領域で枠が付けられている。 破線は筋層と亜漿膜の境界を示す。 スケールバー 低倍率画像（上段）は500μm。 高倍率画像（下パネル）は100μm）

上述の通り、TP53変異はヒトCRCの約60％に見られ、腺腫から癌への進行中に選択されると思われる． 我々は、in vivoでの結腸腫瘍の進行におけるTrp53の不活性化とApcおよびKras変異の協力を評価し、またTrp53ミスセンス変異アレルの潜在的なGOF効果がこのモデルで見られるかどうかを決定しようと努めた。 我々はAKモデルに構成的Trp53R270H変異体（ヒトR273Hのマウス版、P270と呼ぶ）および／または条件付きヌル対立遺伝子Trp53flox（Pflと呼ぶ）を導入した。 複合遺伝子型を持つマウスを作製し、それらの略称は以下の通りである。 CDX2P-CreERT2AKP270/+（AKP270/+マウス）、CDX2P-CreERT2AKP270/fl（AKP270/flマウス）、およびCDX2P-CreERT2AKPfl/fl（AKPfl/flマウス）である。 成体AKP270/+、AKP270/fl、AKPfl/flマウスのコホートは、TAM処理により結腸腫瘍を誘発し、健康状態を観察した。 AKマウス（生存期間中央値＝336日）と比較して、AKP270/+、AKP270/fl、AKPfl/flマウスはいずれも寿命が著しく短くなっていた。 AKP270/flマウスおよびAKPfl/flマウスの生存期間中央値はそれぞれ88日および97日であり、AKP270/+マウスの生存期間中央値は166日だった（図1a）。 AKP270/+マウスは、AKP270/flマウスおよびAKPfl/flマウスよりも有意に生存期間が長かったが（AKP270/+マウスと比較してそれぞれP < 0.0001）、AKP270/flマウスとAKPfl/flマウスを比較すると統計的に有意な生存期間の違いは見られなかった（Fig. 1a）。 Trp53変異（R270Hまたはnull）の付加は、AKマウスで見られる腫瘍発生率と比較して、全体の腫瘍発生率を有意に増加させた（AKマウスと比較した場合、AKPfl/flおよびAKP270/flともにP < 0.0001 、補足表1左下）。 AKPマウスはまた、AKマウス（0.8個/マウス、図1bおよび補足表1右上、AKPfl/fl vs. AKP270/flともにP < 0.0001）と比較して、浸潤性を示す複数の結腸および盲腸腫瘍（AKPfl/flマウスおよびAKP270/flマウスではそれぞれ7.3および8.9個の浸潤腫瘍/マウス）があった。 5292>

剖検時に得られたマウスの盲腸および結腸組織の詳細な解析により、AKP270/+、AKPfl/fl、およびAKP270/flマウスにおける腫瘍負荷は広範囲に及び、腺腫から末期の腺癌までの病変が認められた（図1b-dおよび表1）。 調査したAKP270/+、AKPfl/fl、およびAKP270/flマウスはすべて、少なくとも1つの腺癌（粘膜下層または深部への浸潤を伴う腫瘍）を保有していた。 AKP270/flおよびAKPfl/flマウスの盲腸および結腸近位部では、平滑筋への浸潤と、場合によっては漿膜への浸潤が認められた（それぞれ図1c、d）。 Cre標的にした上皮細胞が機能的な野生型Trp53対立遺伝子1つを最初に保持しているAKP270/+マウスは、腫瘍発生の潜伏期間が長く、全体の腫瘍量（マウスあたり18.5個）および深部浸潤を有する腫瘍の割合（11.9%）は、AKP270/flまたはAKPfl/flマウスと比較して有意に低かった（補足表1および表1、マウスあたりの腫瘍負荷および腺癌の割合についてAKP270/flまたはAKPfl/flマウスと比較してP < 0.01 ）。 これらの知見は、野生型p53が、Trp53ミスセンス変異対立遺伝子との関係においても、結腸腫瘍形成において腫瘍抑制機能を有するという考えを支持するものである。 観察されたすべての腫瘍をAKP270/flマウスとAKPfl/flマウスで比較すると、粘膜下浸潤または深部浸潤を有する腺癌の割合がAKP270/flマウスでAKPfl/flマウスよりも高い（それぞれAKP270/flおよびAKPfl/flで36.9%と26.1%、表1、P = 0.0026）ことから、R270H Trp53アリルが組織侵襲性を高めるという穏やかなGOF効果を持つ可能性を示唆した。 しかしながら、AKP270/flマウスにおける浸潤能の適度な増加は相殺されるかもしれない、なぜならマウスあたりの平均腫瘍負荷はAKP270/flマウスよりもAKPfl/flマウスで高い傾向にあった（マウスあたり28.0対24.2、P = 0.054；補足表1）、AKPfl/flマウスとAKP270/flマウスは腺癌の発生率に有意差を示さなかった（7.3 vs 8.9 adenocarcinoma per mouse、補足表1右上、P = 0.16）。 さらに、一部の腫瘍の筋原線維、漿膜下層、漿膜への浸潤がAKP270/flマウスとAKPfl/flマウスの両方で見られた（図1bおよび表1）。 AKP270/flまたはAKPfl/flマウスの腫瘍のうち、研究期間中に腺癌に進行したのは約30％であったことから、AKPマウスの癌の発生には、Apc、Kras、Trp53の欠陥以外にも体細胞変化が重要である可能性が高いと考えられる。

AKP270/flまたはACPfl/flマウスにおける腫瘍組織学および転移

AKP270/flおよびACPfl/flマウスのそれぞれは、人道的エンドポイントに達するまでに1つまたは複数の腺癌を発症していた。 AKP270/flマウスでは、80%以上の腺癌が高分化から中分化の特徴を示し、浸潤前線での腫瘍の出芽/発芽と時折のムチン分泌が見られた（図2a、上）。 AKP270/fl腺癌の約15-20%は低分化で、トラベキュラー型の固形形態を有していた（図2a、中）。 AKP270/flマウスでは、まれにシグネットリングセル癌が見られた（図2a、下）。 AKPfl/flマウスでは、腺癌の約50％がムチン分泌を伴う高分化から中分化であった（図2b、上）；残りは低分化であった（図2b、下）。 浸潤性AKP270/flおよびAKPfl/fl腫瘍では、β-カテニンの強い核および細胞質染色が見られ（図2、中）、Apc不活性化に起因するWntシグナルの欠陥と一致した。 p53の強い核染色がAKP270/fl腫瘍細胞で観察された。 予想通り、AKPfl/fl腫瘍細胞ではp53染色は見られなかった（図2、右）。

p53変異マウスからの大腸腺癌の組織学的型。 AKP270/flマウス（a）およびAKPfl/flマウス（b）からの代表的な組織型の独立した結腸腫瘍について、H&E染色（左パネル）およびβカテニン（中央パネル）およびp53（右パネル）の免疫組織化学染色が示されている。 腫瘍は、TAM誘導の3ヶ月後に採取した。 スケールバー。 50μm

剖検時、リンパ節転移は13匹のAKPfl/flマウス中3匹、14匹のAKP270/flマウス中5匹に認められた（表2）。 それぞれ腹部リンパ節への転移を認めた3匹のAKPfl/flマウスのうち、1匹は肺への多発性転移も認め、もう1匹は肝臓への多発性転移を認めた（表2）。 腹部リンパ節に転移を認めたAKP270/flマウス5匹のうち、1匹は肺に多発性転移を、もう1匹は肺と肝臓の両方に転移病巣を有していた（表2）。 AKやAKP270/+マウスには転移病巣は見られなかった（表2）。 我々のデータは、Trp53のミスセンスあるいはヌル変異を有するマウスCRCが、同等の頻度で自然リンパ節転移および遠隔転移を生じさせることを示し、我々のマウスCRCモデルにおいて転移を促進するミスセンスTrp53変異のGOF効果を否定するものであった。

Epithelial-mesenchymal transition in metastatic CRCs with missense or null Trp53

In the individual lymph node metastatic deposits found in each of five different AKP270/fl mouse.All Rights Reserved.この表では、5種類のAKP270/flマウスのそれぞれで見つかったリンパ節転移沈着物について説明する。 4つの病巣は中分化型腺癌を示し、1つの病巣は低分化型であった（Fig. 3a, b, 上段）。 中分化リンパ節転移病巣はすべて、核のβ-カテニン染色が強く、膜のE-カドヘリン染色も強く、ビメンチン染色はなかった（図3a）。これは、中分化の特徴を保持するAKP270/fl転移細胞では上皮の性質が保持されていることを示唆していた。 リンパ節転移が低分化型であった1匹のAKP270/flマウスでは、肺、肝臓、盲腸にも低分化型の形態を持つ腺癌病変が認められた（図3bおよび補足図1）。 盲腸の低分化病変と転移病変では、核のβ-カテニン染色が強く、E-カドヘリンの発現が消失し、ビメンチンが強く発現しており、上皮間葉転換（EMT）の特徴と一致していた（図3b、補足図1）。 AKP270/flマウスのすべての転移巣はCDX2陽性染色であり（補足図2）、大腸上皮由来と一致した。 3

Trp53変異を有する大腸由来の転移性腫瘍は上皮間葉転換（EMT）を起こし得る。 a TAM注射後2カ月半の代表的AKPfl/flマウスのリンパ節で認められた中等度分化腫瘍病変を示すH&E染色セクション（上図）の顕微鏡写真である。 この病変の免疫組織化学的染色は、β-カテニンの強い核発現、E-カドヘリンの強い膜発現、ビメンチン発現の欠如を示す（下3パネル）。 b TAM注射4ヶ月後の別のAKPfl/flマウスの盲腸、リンパ節、肺に見つかった低分化病変を示すH&E染色断面の光顕写真（上図）。 これらの病変はすべて、β-カテニンの強い核発現、E-カドヘリンの発現消失、ビメンチンの強い発現を示し、このマウスで見つかった原発および転移病変がEMTを起こしたことを示している（下3パネル）。 H&E染色切片の代表的な顕微鏡写真は、方向性を示すために低倍率で示した。連続切片は免疫組織化学染色を行い、β-カテニン、E-カドヘリン、ビメンチンの染色がある枠付き部分は高倍率で示した。 スケールバー。 全ての画像で20μm

Stabilization of missense mutant p53 protein is associated with loss of wild-type p53 and disease progression

Missense TP53変異を有するヒト腫瘍の大半はTP53 loss of heterozygosity (LOH) を有すると報告されており、ある研究ではマウス肉腫および乳癌の両方でミスセンスミュータント p53安定化に TP53 LOHが必須条件と指摘された . AKP270/+マウスのCre標的大腸上皮は、当初1つの機能的Trp53対立遺伝子を持っているので、TAM注入による腫瘍発生誘導後のAKP270/+マウスの腫瘍発生の各段階におけるp53の染色パターンを評価した。 AKP270/+マウスの大腸組織では、p53 R270Hミスセンス変異タンパク質が体質的に発現しているにもかかわらず、Krasが活性化しApc LOHがまだ起こっていないAKP270/+マウスの過形成ポリープでは、野生型マウスの上皮で見られたp53の陰性染色（図5a）に類似した、非検出性（図5b、パネルHP）であった。 AKP270/+マウスに生じた腺腫（図5b、パネル腺腫および表3、n＝185）および癌（図5cおよび表3、n＝28）には、いくつかのp53免疫反応性がはっきりと見られた。 これらの腫瘍のうち、腺腫の94％と癌腫の43％は弱いp53染色を示したが（図5と表3、5-10％の陽性）、腺腫の6％と癌腫の57％は強いp53染色を示した（図5と表3、>10％の陽性、P < 0.0001）。 p53が強く染色された腫瘍の大部分はp53 LOHを示し，p53が弱く染色された腫瘍はTrp53野生型アレルをまだ保持していた（図6）。 この結果は、マウスの肉腫や乳癌におけるp53ミスセンスタンパク質の発現に関する最近の研究で見られたものと類似している 。 我々のデータは、ヒトの大腸腫瘍形成における状況と同様に、安定化したミスセンス変異p53タンパク質の発現は、野生型p53機能の喪失および浸潤への進行と密接に関連していることを示している。

AKP270/+マウスの過形成から癌化までの腫瘍進行におけるp53R270H変異タンパク質の安定化。 AKP270/+マウスの盲腸に生じた代表的な過形成ポリープ（HP，b，左図），腺腫（b，右図）および3つの癌（c）におけるp53の免疫組織化学的染色。 対照として、野生型マウスの盲腸の切片を用いた（a）。 p53の染色性は、正常（a）およびHP（b）の切片では非検出、腺腫（b）と癌腫1（c、左図）では弱い染色（＜630＞10％陽性）、癌腫2および3では強い染色（＜3211＞10％陽性）の範囲となる。 破線は粘膜筋を示す。 黒矢印はp53の弱い染色の浸潤腺を、赤矢印はp53の強い染色の浸潤腺を示す。 スケールバー。 50 μm

p53R270Hミスセンス変異体の安定化はp53ロスオブヘテロ接合（LOH）と相関する。 a TAM誘導5ヶ月後にAKP270/+マウスで生じた大腸腫瘍（T2-T6）の遺伝子型判定。 AKP270/flマウスに発生した腫瘍（T1）および野生型マウスの結腸組織（N）をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。 Trp53野生型アレルの存在と組み換えTrp53変異アレルの存在（flox out）はPCRで検出した。 b-e （a）に記載した結腸組織におけるp53の免疫組織化学染色は、腫瘍4-6における弱いp53染色とTrp53野生型アレルの存在（e）と比較して、変異p53安定化（d、T2およびT3）とp53ロスオブへテロ接合性の強い相関があることを示す。 破線は粘膜筋を示す。 スケールバー。 100 μm

Global gene expression profiling reveals few differences between mouse or human colon tumor hbring R270H/R273H missense mutant and null Trp53/TP53 alleles

AKP270/fl mouse (n = 6) or AKPfl/fl mice (n = 6) の結腸腺癌組織における遺伝子発現についてAffymetrix Mouse ST 2.0 を用いてプロファイルを作成し、その結果を報告した。1アレイを用い、24,562プローブセットで解析した。 各マウスの浸潤性原発腫瘍1個からがん細胞をレーザー捕捉マイクロダイセクション（LCM）し、RNAを単離した。 対照として、野生型マウス（n = 3）の正常な結腸上皮細胞をマイクロダイセクションしたものも含まれる。 これら15サンプルについて、3つの平均を表す項を持つANOVAモデルを当てはめた。 腫瘍組織と正常組織の比較では、AKP270/fl腫瘍とAKPfl/fl腫瘍ともにP < 0.001で2400以上のプローブセットが得られたが、2種類の腫瘍を互いに比較すると、偶然に24.6プローブセット (24,562*0.001) を期待できるところわずか30プローブセットが得られただけだった。 この後者の結果は、見つかった30個のプローブセットのほとんどが偽陽性であり（表4、上部）、Trp53ミスセンス変異を持つ結腸腫瘍とTrp53ヌル変異を持つ腫瘍の間で、遺伝子発現に観察できる有意差はほとんどないことを示している。 この考えと一致して、AKP270/flとAKPfl/flの腺癌は、両群とも野生型大腸上皮とは明らかに異なる遺伝子発現パターンを持っているが、遺伝子発現の主成分（PC）分析では区別がつかないことが分かった（補足図）。 5292>

また、AKP270/flマウス（n = 3）またはAKPfl/flマウス（n = 2）に生じた結腸腫瘍から得られたオルガノイドについてアフィメトリクス遺伝子発現解析を実施した。） Apcfl/flマウスの腺腫（Cont 1、n = 3）または野生型大腸上皮（Cont 2、n = 4）由来のオルガノイドを対照として用いた。 4つのグループのオルガノイドにANOVAモデルを当てはめた。 Apc-nullオルガノイドと比較して、AKPfl/flオルガノイドではP < 0.001のプローブセットが435個、AKP270/flオルガノイドでは609個見つかった（Cont 1, Table 4）。 さらに、AKPfl/flまたはAKP270/flオルガノイドを正常大腸オルガノイドと比較すると、より多くの差次的発現プローブセットが同定された（AKPfl/flで960、AKP270/flで1332、P < 0.001）(Cont2, Table 4)。 AKPfl/flとAKP270/flの腫瘍とオルガノイドの両方で、正常大腸上皮と比較して差次的に発現していた遺伝子について、パスウェイ濃縮試験を行った。 その結果、p53欠損およびミスセンス変異腫瘍由来細胞では、様々なパスウェイが有意に変化しており、G2Mチェックポイント、細胞増殖、ストレス応答、細胞代謝に関わる遺伝子が最も有意に変化した遺伝子群として認められた（Supplementary Table 2）。 しかし、AKPfl/flとAKP270/flの比較でP < 0.001のプローブセットが35個しか得られず（表4）、ここでも偶然に予想された24.6個であり、Trp53ヌル変異とミスセンス変異のあるオルガノイド間で遺伝子発現差を見つけることは困難であることが示された。 PCプロットでは、AKPfl/flとAKP270/flのサンプルは常に一緒にクラスター化し、Apc変異腺腫（Cont1、補足図6）または正常結腸上皮（Cont2、補足図6）由来のオルガノイドと区別された。

ミスセンスとヌルのTP53変異を持つヒトCRCの間で遺伝子発現パターンに実証的な違いがあるかどうかを調べるために、The Cancer Genome Atlas (TCGA) .のCRCのRNA-seqデータからlog2変換した正規化カウントを分析した。 TP53コドン273のミスセンス変異を持つ9個の腫瘍とヌル変異（フレームシフト、スプライスサイト、ナンセンス変異による、詳細は補足表3を参照）を持つ36個の腫瘍を比較し、20531遺伝子について2標本のT検定により検討した。 その結果、P < 0.01の遺伝子は244個、P < 0.001の遺伝子は30個だけで、偶然に予想される数（それぞれ205と20.5、表4）よりわずかに多いだけであった。 TP53自体は遺伝子発現に最も有意な差を与え、ヌル変異を持つ腫瘍とTP53コドン273変異を持つ腫瘍では平均でほぼ5倍低かった（補足表4、P = 2×10-10）。 ここでもまた、PC解析では2つの腫瘍セットの分離はほとんど見られなかった（補足図7）。 類似の転写シグネチャーと一致して、年齢、ステージ、TP53の状態をモデルに用いて、生存データのある43人の患者にCox比例ハザードモデルを当てはめたが、患者の転帰とTP53変異の状態との間に有意な関連は見られなかった（R273ミスセンス変異対ヌル変異、補足表5、Wald検定によるP = 0.67）。 これらの患者のうち死亡したのはわずか7人であり、差を検出する力はかなり低かったことは言及に値する。 最後に、上記の3つのデータセット（すなわち、ヒトとマウスの結腸腫瘍、マウス結腸オルガノイド）のいずれにおいても、Trp53/TP53ミスセンスとヌルの比較で同じ方向に変化したP < 0.05を与える遺伝子の交差点を調べた。 補足表4では、3つのデータセットのうちいずれか2つのデータセットでP < 0.05と少なくとも1.3のfold-changesを与えた遺伝子を示す。 3つの研究すべてで同じ方向に変化したのはTrp53/TP53のみであった（補足表4；3つのデータセットすべてにおける各遺伝子の詳細な統計は、我々の公開GEOシリーズで入手可能である）。 まとめると、マウスとヒトのCRCに関する我々の遺伝子発現解析は、R270/R273ミスセンスまたはNull Trp53/TP53変異を有する大腸腫瘍は非常に類似した遺伝子発現プロファイルを有することを示し、これはAKP270/flおよびAKPfl/flマウスにおいて大腸腫瘍および生体内で生じる表現型に大きな差異が存在しないことと整合している＜5292＞。