Abstract
Trametes種は数千年にわたり伝統医学および通常医学において様々な種類の疾患の治療に使用されてきた． 本研究では、Trametes属の菌糸体および担子細胞抽出物の抗原毒性の可能性を評価し、抗酸化能への依存性を評価することを目的とした。 Trametes versicolor, T. hirsuta, T. gibbosaが研究対象種であった。 Trametes versicolor, T. hirsuta, T. gibbosaの抽出物を用いて，ヒト末梢血白血球に対する抗原毒性について検討した。 アルカリコメットテストにより，DNA鎖切断とアルカリに不安定な部位の検出，およびDNAの移動の程度を調べた。 DPPHアッセイは、抽出物の抗酸化性を評価するために使用した。 T. versicolorとT. gibbosaの果実体抽出物およびT. hirsuta抽出物は，20.0 mg/mLのものを除き，遺伝毒性はなかった。 T. versicolor抽出物は5.0 mg/mLで、白血球の前処理と後処理の両方で最大の抗原毒性作用を示した。 3種の菌糸体抽出物は、H2O2によるDNA損傷に対して、前処理、後処理ともに遺伝毒性はなく、有意な抗原毒性作用を示した。 この結果は，これら3種の抽出物が細胞の遺伝子保護反応を刺激する強力な抗原毒性物質であることを示唆している
1. はじめに
キノコは古くから食用として利用されてきたが、西洋と東洋の伝統医学においても同様に利用されてきた。 多くのキノコが健康食品として認識されているにもかかわらず、その偉大な薬理学的可能性はまだ十分に活用されていない。 世界には60種近くのキノコが生息していることが知られていますが、薬効が確認されているのはそのうちの数種に過ぎません。 Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloydは、この属の中で最も有名な薬用種である。 この種は、西洋文化圏ではターキーテイル、中国では雲子、日本ではカワラタケと呼ばれ、特にアジアでは数千年にわたり伝統医学に用いられてきた。 明の時代に書かれた『中国医学大全』によると、120以上の菌株が記録されており、中国の伝統的な薬学では、このキノコは毒素の除去、強化、エネルギーの増加、肝臓や脾臓の機能の改善、免疫反応の強化に役立つと考えられており、特に乾燥させて粉砕し、お茶にすると良いとされています。 これらの特性はすべて、民間療法においてトラメテス属の製剤を慢性的に使用する際に非常に有用であると考えられていました 。 従来の医学では、この種は主に様々な種類の癌の治療に使用されているが、慢性肝炎、関節リウマチ、呼吸器、泌尿器、消化管の感染症にも使用されており、これは多くの研究によって確認されている . さらに、T. versicolorから単離されたいくつかの多糖ペプチドの強い抗ウイルス作用やTrametes属の子実体抽出物の有意な抗酸化活性が報告されている . これらの効果は、主に多糖体クレスチン（PSK）や様々な多糖体-ペプチド複合体の生成に基づくもので、癌の転移を抑え、ヒト細胞におけるインターロイキン-1の生成を刺激する化合物である。
環境中にフリーラジカルが豊富に存在すると、酸化ストレスが生じ、これが老化や世界人口の大部分が苦しみ、死亡する様々な病気や障害の始まりと進行の基礎となる … DNAは、他の高分子よりも酸化的な損傷に敏感である。 鎖切断などのDNA損傷は、様々な物質によって誘発されるが、中でもH2O2は遺伝毒性作用を示す。 これらの損傷は、炎症性疾患だけでなく、癌の免疫反応に影響を与えることが知られている。 コメットテストは、DNA損傷を調べるために使用されてきた高感度で効果的なテストであり、いくつかの天然物の遺伝毒性および保護能を評価するために適用することができる。
DNAの酸化的損傷の軽減に基づくキノコ抽出物の遺伝保護活性は、いくつかの言及された疾患や障害の予防および治療において重要な役割を果たすことができるが、今日まで様々な治療における作用手段として考えられる研究はごくわずかである。 そこで本研究では、Trametes属菌の菌糸体および担子体抽出物のヒト末梢血白血球に対する抗原毒性作用を評価し、抗酸化能への依存性を評価することを目的とした。 Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301, T. gibbosa BEOFB 310はセルビアから採取した子実体から分離し、ベオグラード大学生物学部植物研究所（BEOFB）の培養コレクションでMalt寒天培地上で維持した。0 g L-1; NH4NO3, 2.0 g L-1; K2HPO4, 1.0 g L-1; , 0.4 g L-1; , 0.5 g L-1; yeast extract, 2.0 g L-1; pH 6.5) に25枚の菌糸ディスク（直径 0.)を接種することにより作成した。5 cm，モルト寒天から7日間培養したもの）を250 mLフラスコに入れ，100 rpm，室温（℃）の回転式シェーカーで7日間培養した。得られたバイオマスを洗浄し，100.0 mLの滅菌蒸留水（dH2O）で実験室のブレンダーで均質化させた。 均質化したバイオマス（30.0 mL）を 500.0 mL の修正合成培地（グルコースが 65.0 g L-1 である）に接種するために使用した。 得られたバイオマスを濾過し、マグネチックスターラー上でdH2Oで3回洗浄し、50℃で乾燥させて一定重量とした。 真菌抽出物の調製
乾燥した子実体および菌糸体（3.0g）を96％エタノール90.0mLで30℃、72時間撹拌して抽出した。 得られた抽出液を遠心分離（20℃、3000rpm、15分）し、上清をワットマン4号ろ紙でろ過し、ロータリーエバポレーター（BÜCHI R-114、スイス）で40℃、減圧下で乾燥するまで濃縮し、抗酸化測定用96%エタノールまたは抗原毒性測定用水に再溶解して初期濃度20.0 mg mL-1とした。 抽出収量は乾燥重量基準でパーセント表示した。 遺伝子保護活性
2.3.1. 被験者
25歳以下の健康なドナー3名から静脈穿刺によりヘパリン化全血を採取した。 この研究の参加者は、非喫煙者、非アルコール中毒者であり、いかなる治療や投薬も受けておらず、栄養補助食品も摂取していなかった
2.3.2. 試験デザイン
DNA損傷を評価する目的で、ヒト末梢白血球を37℃で30分間処理し、すべての抽出物と濃度(20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.312mgL-1) の遺伝毒性を調査しました。 通常、白血球は、比較的非侵襲的な方法で得られ、組織の分解を必要とせず、コメットアッセイで良好な挙動を示すことから、使用されている。 ポジティブコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で37℃、30分間処理し、ネガティブコントロールとして25.0μM H2O2で氷上、15分間処理した。
抽出物の抗原毒性能を評価するために、抽出物の前処理と後処理を用いた2つの独立したプロトコルが使用された。 前処理では、細胞を抽出物とともに37℃で30分間インキュベートし、PBSで洗浄した後、H2O2に15分間暴露した。 後処理では、細胞を氷上で15分間H2O2処理し、PBSで洗浄した後、7つの濃度の抽出物で37℃、30分間処理した。 各処理後、細胞はPBSで洗浄した。 PBSを用いた37℃、30分間のインキュベーションをネガティブコントロールとし、25.0μM H2O2を用いた氷上、15分間の処理をポジティブコントロールとした。 Single Cell Gel Electrophoresis Assay
コメットアッセイは、Singhらによって記述されたように実施された。 アルカリコメットテストは、DNA鎖切断やアルカリに不安定な部位を検出することができ、DNAの移動の程度が細胞のDNA損傷の程度を示す。
全血試料（6.0μL）を0.67%低融点（LMP）アガロース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）に懸濁し、1%正常融点アガロース（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO）をプレコートした過霜取ガラス顕微鏡スライドにピペッティングしてカバースリップで広げ、氷上に5分間保持して固化させた。 カバースリップを静かに取り除いた後、スライド上の細胞懸濁液を上記のように抽出物とH2O2 で処理した。 処理後、すべてのスライドを0.5%LMPアガロースの第3層で覆い、再び氷上で5分間固化させた。 カバースリップを除去した後、スライドを冷溶解液（2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100, 10% dimethyl sulfoxide, pH 10.0 NaOHで調整）に4℃で一晩浸し、その後電気泳動と臭化エチジウムによる染色を実施した . コメットは、倍率100倍で蛍光を記録する装置を備えたOlympus ×50 顕微鏡（Olympus Optical Co. DNA損傷の評価は、Andersonらによって記述されたように行った。 すなわち、細胞は、尾部における以下のDNA量に対応する5つのカテゴリーに目視で等級付けされた。 (A) 損傷なし、<5%; (B) 低レベル損傷、5-20%; (C) 中レベル損傷、20-40%; (D) 高レベル損傷、40-95%; (E) 完全損傷、>95% (Figure 1). 解析は、被験者ごとに無作為に選んだ100個の細胞（2枚の複製スライドからそれぞれ50個ずつ）について行った。 データの半定量的な分析を得るために、DNA損傷は5%以上のDNA移動として特徴づけられた（B + C + D + Eコメットクラス）。
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(c)
(d)
(e)
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2.4. 抗酸化活性
2.4.1. DPPH-アッセイ
酸化防止活性は安定な1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical ()の紫色のメタノール溶液の漂白度を測定することによって定義しました。 抗酸化作用は517 nmで分光光度計(CECIL CE 2501)により測定し、式で算出した。ここで、陰性対照（抽出物なしの反応混合物）の吸光度は反応混合物の吸光度である。
50%の減少（EC50）をもたらす抽出物濃度（mg extract/mL）は線形回帰分析による内挿法で求めた。 統計解析のため、すべての測定は三重で行われた。 ポジティブコントロールとして、20.0 mg mL-1-0.02 mg mL-1の濃度範囲で市販の抗酸化剤、butylated hydroxyanisole (BHA) を使用しました。 総フェノール量の測定
菌糸体抽出物中の総フェノール化合物は、Singleton and Rossi , の方法に従って、没食子酸を標準として Folin-Ciocalteu 試薬で推定しました。 濃度は、標準没食子酸グラフから得た式を用いて、乾燥抽出物1mgあたりの没食子酸等価物（GAE）μgとして、
2.4.3 として求めた。 総フラボノイド含量の測定
総フラボノイド含量は、ケルセチンを標準としてParkらの方法で測定した。 その量は、標準ケルセチン水和物のグラフから得られた式
2.5 を用いて、乾燥エキス1mgあたりのケルセチン相当量（QE）μg として表した。 統計解析
結果は、3回の平行測定から得られたデータの平均値±標準誤差で表した。 一元配置分散分析（ANOVA）は、STATISTIKAソフトウェア、バージョン5.0（StatSoft Inc.）を使用して行い、有意差を検定した。0.01未満の値は、統計的に有意であるとみなした。 コメットアッセイからのデータの統計分析は、Statgraph 4.2ソフトウェアを使用してχ2検定によって行った。 χ2 検定を行うために、3つの実験の結果をプールし、DNA損傷を受けた細胞の総数を評価した。 この結果は、統計的に有意な差とみなされた。 抽出収量
3種とも菌糸体バイオマスの抽出収量は子実体()と比較して有意に高かった。 T. gibbosaは乾燥菌糸体バイオマスからの抽出収率が最も高く（34.6%），乾燥子実体の収率は最も低かった（2.2%）。 子実体の抽出収率が最も高かったのはT. versicolorで6.67%であり、菌糸体の抽出収率は8.0%であった。 T. hirsutaの収率は12.0%（菌糸体）および2.85%（子実体）であった。 また、菌糸体、子実体ともに種による抽出効率の差は統計的に有意であった（）。
これまでの報告では、バイオマス抽出能は種、株、溶媒に依存することが示されていた。 また，Ren らは，T. gibbosa 基質果皮の抽出率は，石油エーテル抽出物で 1.22%，酢酸エチル抽出物で 6.44%，メタノール抽出物で 9.2% であることを明らかにした． また，メタノールはT. versicolor 基質果実の抽出に適した溶媒であり，その収率は4.1%から9.16%であった。 この結果から、アルコール類は最も優れた溶媒であるが、エタノールはメタノールよりも弱いと結論づけられる。 遺伝子保護活性
すべての献血者は健康で年齢もほぼ同じであり、投薬を受けていなかったため、統計解析の結果、抽出物に対する反応に明確な差は見られなかった。 したがって、3つの実験の結果はプールされました。 末梢血白血球をH2O2で処理すると、核DNAの一本鎖切断が迅速かつ強力に誘導され、コメットアッセイでDNAの移動として確認できた。
この結果から、T. versicolor子実体抽出物は0.312から20.0 mg mL-1 では、ポジティブコントロールと比較して、DNA 損傷細胞の総数が有意に増加しないことから、被検抽出物は遺伝毒性物質ではないことが明らかである（図2（a）（A））。 また、総DNA損傷数の分布（値）も陽性対照と同じであった。 一方、これらの抽出物は、白血球の処理前と処理後の両方でH2O2に対する保護効果を示した（図2（A）（B、C））。 5.0 mg mL-1の抽出物が両処理において最も大きな効果を示し、20.0 mg mL-1の抽出物が最も小さな効果を示した。 全DNA損傷の値は、すべての濃度においてポジティブコントロールと比較して統計的に減少した()。
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(b)
(c)
(b)
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T. hirsuta子実体抽出物は、20.0 mg mL-1を除くすべての濃度において、総DNA損傷のレベルがポジティブコントロールにおけるものよりも統計的に高くなかったので、遺伝毒性活性を示さなかった（図2（b）の（A））。 しかし、20.0 mg mL-1 の濃度では、遺伝毒性作用および細胞内の全DNA損傷は、ポジティブコントロールと比較して統計的に異なることがわかった。 白血球の前後処理において、最高濃度を除くすべての濃度の抽出物は、H2O2誘発DNA損傷に対して保護効果を示し、ポジティブコントロールと比較して総DNA損傷の有意な減少を示した（図2（b）（B、C））。 これらの処理は用量依存的な相関を示し、抽出物濃度0.312 mg mL-1で最大の保護効果を示し、20 mg mL-1の濃度はH2O2によって誘発されるコメットに対する保護効果を示さなかった。
7つの濃度において、処理前と処理後の両方で、遺伝毒性のみならず有意な抗原毒性、すなわち、H2O2によって誘発されたDNA損傷の低減がないことも、T. gibbosa子嚢体抽出物で認められた（図2（c））。 しかし，T. hirsuta抽出物とは異なり，T. gibbosa担子細胞抽出物では用量依存的な応答は観察されなかった；すなわち，抽出物濃度の漸減はH2O2による遺伝毒性の比例的減少に対応しなかった．
T. versicolor, T. hirsuta, T. gibbosaの菌糸体抽出物は、すべての分析濃度において、遺伝毒性は認められなかった（図3（a）（A）、図3（b）（A）、図3（c）（A））。 すべての菌糸体抽出物および濃度で、H2O2 による DNA 損傷に対して、処理前と処理後の両方で有意な抗原毒性効果を示し、これらの活性に顕著な差は見られなかった。 T. versicolorでは、最も低い抽出物濃度において、わずかに低い活性が認められた。 T. hirsutaでは、5.0, 2.5, 20.0 mg mL-1の濃度がより有効であり、T. gibbosaでは、2.5 mg mL-1の濃度で最大の保護効果が、20.0 mg mL-1で最も低いものが認められた（図3 (a) (B, C), 3(b) (B, C), 3(c) (B, C))．
(a)
(b)
(c)
(b)
(c)
数多くの変異原性および発癌性化合物が、異なる天然資源に存在する。 一方、いくつかの天然化合物は、濃度や暴露時間によって、遺伝毒性および/または細胞毒性効果を引き起こすプロオキシダントまたは抗酸化物質のどちらかになる可能性があります。 栄養価が高く薬効もあるキノコ類は、消化条件下で不安定であったり、消化管で吸収されないために、in vitro と in vivo で異なる作用を示すことがあります。 すなわち、in vitroで得られた活性は、必ずしもin vivoでの活性と一致するものではありません。 また、キノコ抽出物の遺伝毒性および抗原毒性作用は、菌種、濃度、評価に用いるアッセイに依存することを強調することが重要です。 例えば、T. hirsutaの子実体抽出物は、最も低い活性を示した。 また、T. hirsutaの子実体抽出物のみ、DNA損傷レベルと抽出物濃度との間に明確な逆相関が認められた。 しかし、T. versicolorとT. gibbosaでは、最適量以上に抽出濃度を上げてもコメット結果の改善は認められず、Miyajiらの結果を確認することができた。 また、Lentinus edodes の抽出物濃度と抗原毒性との間に用量反応関係がないことを示した。 このように、抽出物中のフェノール、フラボノイド、その他の成分は、個々の成分よりも大きな力を持つはずであり、すべての成分の相互作用が重要であることを示すことが重要である。 このことは、Trametes spp.の抗原毒性活性の異なる傾向をもたらす可能性がある。 すなわち、Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatusの担子細胞抽出物は、Ames Salmonella/microsome testを用いて哺乳動物細胞に対して変異原性を示さないことが報告されている。 しかし、P. ostreatus抽出物の弱い活性は、CHO/HPRTアッセイを用いて得られた。
キノコ抽出物の抗原毒性作用の基礎メカニズムは、まだ完全に知られていない。 抽出物の保護効果は、複数の作用機序に基づいているようであり、Gebhart によれば、キノコでは珍しくないことである 。 抗原毒性のメカニズムは、前処理および後処理、すなわち抽出物と H2O2 の多様な組み合わせの適用によって評価することができた。 両方の処理で良好な結果が得られたことから、抽出物には予防と介入の両レベルで保護効果があり、デスミューテンおよびバイオアンチミューテンとして作用することが、以前の研究でも実証されている。 本研究で指摘された前処理の有効性は、細胞の抗酸化能力を高めること、すなわち、酸化ストレスの誘発中に抗酸化酵素の合成と活性を刺激することで説明できる。 後処理の効果は、Chiaramonteらによって示唆されたように、フリーラジカル消去と抗酸化酵素の刺激、およびDNA修復の促進を介した介入活動の相乗作用の結果である可能性がある。 これらの著者らは、酸化剤に30-60分暴露した後にDNA損傷の修復が顕著になることを報告しているので、後処理条件として30分までのインキュベーションを考慮すると、H2O2に対する保護においてDNA修復はそれほど重要な役割を果たしていないと結論づけることができるだろう。 したがって、Trametes属抽出物の遺伝子保護活性は、おそらく抗酸化作用に基づくものであると考えられる。 一方、真核生物は、DNA損傷応答と呼ばれるシグナル伝達経路を進化させ、ゲノムの傷害から保護することが知られている。 GasserとRauletは、DNA損傷応答が、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）や一部のT細胞に発現する活性化免疫受容体NKG2Dの細胞表面リガンドの発現を誘導することによって、免疫系に警告を発することを明らかにした。 したがって、遺伝毒性物質に暴露された細胞におけるトラメテス属細菌の遺伝子保護活性は、DNA損傷反応を調節し、初期の腫瘍形成におけるバリアとして機能する可能性がある。 今後、Trametes spp.抽出物で処理したリンパ球のスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼレベルを、H2O2処理前と処理後の両方で分析し、細胞内の抗酸化能力の増強がこれらの抽出物によって誘導されていることを確認する必要がある
3.3. 抗酸化活性
試験したエタノール抽出物は良好な抗酸化剤であったが、その活性は樹種に依存した。 果実体抽出物は菌糸体抽出物より有意に高い消去効果を示した()。 DPPHラジカル消去活性が最も高かったのはT. versicolorの子実体および菌糸体抽出物であり（それぞれ63.5%と59.4%）、EC50値（15.22 mg mL-1 と 16.18 mg mL-1）でも確認されました。 T. hirsuta抽出物の活性はやや低く（担子菌糸体59.0%、菌糸体46.8%）、その濃度はそれぞれ17.06 mg mL-1と21.81 mgL-1で、ラジカルの50%の減少をもたらした。 T. gibbosaは，EC50値が26.15 mg mL-1で，特に菌糸体抽出物（39.7%）の消去力が最も低い種であった。 しかし、子実体抽出物のラジカル消去能は、他の2種と比較して有意に低いものではなかった（53.7%、EC50は18.13 mg mL-1）。 また、合成抗酸化剤BHAの消去率は94.28%で、0.10 mg mL-1の濃度で50%の減少をもたらした。
Trametes種の子実体および菌糸体抽出物の総フェノール量は、有意差（表1）であった。 一般に、子実体抽出物のフェノール含量は、菌糸体抽出物よりも高かった。
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T. versicolor basidiocarpとT. versicolor myceliumの両抽出物はフェノールとフラボノイドが最も豊富で、T. gibbosa抽出物で最も低い濃度が測定されました。 フェノールとフラボノイドの濃度によると、T. hirsutaの抽出物は他の2種の抽出物の間に位置していた（表1）。 また、抽出物の抗酸化活性とフェノールおよびフラボノイド含量との相関は、子実体でそれぞれ0.98および0.99、菌糸体で0.97および0.99と高い相関を示した
これまでの研究でもTrametes属の抗酸化能は示されている。 また、Johnsy and Kaviyarasanaは、1.0 mg mL-1のT. gibbosa basidiocarpsのメタノール抽出物によって、91.5%のラジカルを減少させたと述べています。 MauらやPalaciosらによると、フェノール化合物は抗酸化活性に重要な役割を果たすという。 これらの化合物は、キノコの子実体や菌糸体に非常に多く含まれ、重要な成分である。 その能力は、還元剤、金属キレート剤、一重項酸素クエンチャー、水素供与体として働く水酸基の存在に基づくものである。 しかし，場合によっては，その活性は抽出物中の総フェノール量に帰することができない。このことは，JohnsyとKaviyarasanaの結果との比較で確認された。 すなわち，23.8 μg GAE mg-1抽出物を含むT. gibbosa basidiocarp抽出物は91.5%のラジカルを消去したが，フェノール濃度が20.07 μg GAE mg-1抽出物のBEOFB 310株抽出物は，わずか63.5%のラジカル消去にとどまった。 しかし、セルビア産T. gibbosa株のフラボノイド濃度は、JohnsyとKaviyarasanaが試験した株（それぞれ7.63 μg QE mg-1抽出物および0.59 μg QE mg-1抽出物）と比較して著しく高く、これは、溶媒の極性が異なることと、フラボノイド合成に対する株の能力が異なることによって説明できると思われる …
4.結論
本研究はT. versicolor, T. hirsuta, T. gibbosa抽出物のDNA保護活性を評価する最初の試みで、これが抗酸化能に基づいているかどうかを判断するものであった。 その結果、これら3種の抽出物は、免疫機能の強化、毒素の除去、強化に寄与する細胞の遺伝子保護反応を刺激できる強力な抗原毒性物質と考えることができ、これは伝統的な使用法に言及するものであることが示唆された。
Conflict of Interests
著者らは、この論文の発表に関して利害関係がないことを宣言する。
Acknowledgements
著者らは、英語の修正と改善を行った英国ニューカッスル大学客員教授、スティーブクアリ博士に感謝する。 本研究は，セルビア共和国教育・科学・技術開発省プロジェクト番号173032およびプロジェクト番号173034の財政支援を受けて実施されたものである。
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