Rapid lateral flow immunoassay for fluorescence detection of SARS-CoV-2 RNA

Design and operation of the HC-FIA assay

The murine S9.S. (SARS)のゲノムにおけるプローブの分布。6モノクローナル抗体をラテラルフローストリップのテストライン（T）にプレフィックスし、コントロールライン（C）にはヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体を塗布します（図1a）。 S9.6抗体とウサギIgGで標識したFNPを反応管に入れる。 検出の初期には、咽頭ぬぐい液または喀痰サンプル中のSARS-CoV-2が溶解・放出され、放出されたRNAが特異的なSARS-CoV-2 DNAプローブとハイブリダイズする。 得られたRNA-DNAハイブリッドはFNP標識S9.6抗体によって捕捉され、複合体は毛細管力によってサンプルパッドとニトロセルロース膜に沿って吸着紙に向かって流れる。 Tエリアを通過する際、複合体はS9.6抗体によって捕捉され、徐々に蛍光シグナルを発生する。 Cエリアでは、FNP標識ウサギIgGが抗ウサギIgGに捕捉される。 ターゲットとなるSARS-CoV-2 RNAの有無は、蛍光強度のカットオフ値に基づいて判断する（図1b,c）。 図1dは、次の2つのステップ：ハイブリダイゼーションと免疫蛍光分析（図1e）の後、1時間未満で定性的な結果を提供する能力を有するポータブルスーツケースラボラトリーを示している。 健常者211名の咽頭拭い液サンプルのT/C比を測定した結果、バックグラウンドT/C比の平均値は49.95、s.d.は17.16であった（補足図1a）。 受信者動作特性（ROC）曲線と曲線下面積（AUC）を用いてカットオフ値を決定し、様々な閾値における感度と特異度に基づいてHC-FIAアッセイの診断精度を評価した。 COVID-19の臨床確定例と除外例100例の咽頭拭い液サンプルを用いて、AUCが0.999、95％信頼区間（CI）が0.997-1.000のROC曲線を求めた（補足図1b）。 最も高い感度と特異度が得られるカットオフ値は102.07であり，これはYouden indexの0.980点に相当する． また，イムノアッセイでは通常，ネガティブバックグラウンド値の2倍の閾値（ここでは49.95×2＝99.90）がカットオフ値として使用される． 便宜上、T/Cのカットオフ値を100.00とした。

HC-FIA assay development

SARS-CoV-2 のターゲットRNA配列に対するDNAプローブの最適化は、アッセイ効率向上の鍵である。 我々が設計した全てのDNAプローブ配列のリストを補足表1に示す。 SARS-CoV-2のゲノムは約30,000塩基からなり、可変数（6-11）のオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいる。 最初のORFはゲノム全体の約67％を占め、16個の非構造タンパク質、ならびにヘルパータンパク質と構造タンパク質をコードしている。 4つの主要な構造タンパク質は、スパイク糖タンパク質（S）、小型エンベロープタンパク質（E）、マトリックスタンパク質（M）、ヌクレオキャプシドタンパク質（N）である15,16。 SARS-CoV-2の核酸検出アッセイの多くは、ウイルスゲノムの以下の3つの保存領域を利用している。 RNA依存性ポリメラーゼ遺伝子（rdrp）が存在するORF1ab15、NとEをコードする領域である。

我々はまず、National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (accession number, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 and NC_045512.1) から SARS-CoV-2 のRNAゲノム配列を取り出してみた。 SARS-CoV-2ゲノムの他の公開配列を詳細に解析した結果、これらの領域には顕著な変異は見られなかった。 設計ソフトウェアPrimer Premier 5.0を用いて、3つの領域に対してそれぞれ3つのプローブを設計した。 CoV01とCoV04はそれぞれORF1abとNの検出推奨領域に位置し、CoV08はE17と同じ領域に位置している。 参考ゲノム配列（NC_045512.2）におけるプローブ結合部位のゲノム位置を図1fに示す。

設計したDNAプローブとヒトゲノム、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、クラミジア、その他の一般的病原体のゲノムの配列のアライメントを実施した結果、プローブ結合部位はヒトゲノムと同じであった。 プローブはSARS-CoV-2のゲノム配列にのみ一致し、ヒトゲノムDNAとの相同性は見出せなかった。 陽性対照として、レンチウイルスをベクターとして構築した標的遺伝子の異なる領域を持つシュードウイルスを使用した。 使用した擬似ウィルスの標的遺伝子配列を補足表2に示す。 P1はSARS-CoV-2 N領域、P2はSARS-CoV-2 E領域、P3はSARS-CoV-2 ORF1ab領域について陽性であった。 3つの陽性対照の濃度は、3,000 transduction units (TU) ml-1であり、1mlあたり3,000個の感染性ウイルス粒子が存在することを示した。 N1〜N17の陰性対照として、生理食塩水、精製水、他の一般的な病原体に陽性の咽頭スワブ試料を使用した。 本研究で使用した陽性および陰性のリファレンスに関する情報のリストを補足表3に示す。 試験結果を補足表4〜6に示す。 ORF1ab領域については、プローブCoV01とCoV03を選択し、E領域については、プローブCoV08を選択し、N領域については、プローブCoV04とCoV06が優先的に標的RNAに結合した。 選択されたDNAプローブは、さらに組み合わせによって最適化され（補足表7）、各プローブ群は3つのセグメントすべてを同時にターゲットとした。 HC-FIA試験の結果から，Cov01，Cov04，Cov08プローブの組み合わせ（グループ2）は，すべての陽性対照試料と陰性対照試料を識別し，低いウイルス力価（1000 TU ml-1；付表3，L1-L3）の陽性試料を95%以上の高い陽性率で検出することが示された． そこで、グループ2を最終的な組み合わせとして選択した。 現在までにNCBIで公開されているSARS-CoV-2の塩基配列は13,411個である。 また、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間やテストストリップの読み出し時間など、試験条件の最適化も行った。 56℃でのインキュベーション時間10分、20分、30分、40分、50分、60分におけるアッセイ性能を補足表9に示す。 このことは、ウイルス力価の低い咽頭ぬぐい液および喀痰の陽性検出率（1,000 TU ml-1；付表3、L1-L3）が100％であることからも明らかである。 インキュベーション時間を50分，60分と長くすると，L1〜L3参照試料の陽性率が低下し，反応の安定性が低下した。 検出効率とウイルス不活性化の条件を考慮し、56 ℃でのハイブリダイゼーションのインキュベーション時間として30分を選択した。 また、ストリップの読み取り時間を10分、12分、15分、18分という値で評価した（補足表10）。 その結果、12分以上であれば、陽性および陰性の基準試料を正しく検出できることがわかった。 しかし，読み取り時間が15分の場合のみ，ウイルス価の低い陽性検体を検出するための変動係数（CV）が10%以下となった。 そこで，検体保存のための輸送媒体として，核酸抽出に最も使用される蛋白質変性剤であるチオシアン酸グアニジンと塩化グアニジンを比較検討した． その結果，チオシアン酸グアニジンは陽性・陰性の識別に優れ，ウイルス力価の低い試料では比較的低いCVとなった。 実際、6 mol l-1という高濃度のグアニジニウムチオシアネートは、優れた抗ウイルス性を示している18。 輸送媒体中のウイルス不活性化のためのタンパク質変性剤として、5 mol l-1の濃度のグアニジニウムチオシアネートを選択した。

HC-FIA assayの特異性

プローブ配列と反応条件の最適化後、SARS-CoV-2を検出するHC-FIA assayの特異性を検討した。 陽性対照には、標的遺伝子を持つ偽ウイルス（サンプルP1〜P3）と、RT-qPCRベースの核酸検出キット（上海ZJバイオテック社）を用いて確認した5つの臨床咽頭スワブサンプル（サンプルP4〜P8）を使用した。 咽頭拭い液サンプルからなる陰性対照は、SARS-CoV-2陰性、インフルエンザA、インフルエンザB、呼吸同期ウイルス、肺炎クラミジア、アデノウイルスなどの病原体陽性（サンプルN5〜N17）、MERS（サンプルN18）またはSARS（サンプルN19）のN領域の偽ウイルス陽性を確認した。 全検体のリストを補足表3に示す。 SARS-CoV-2と呼吸器疾患を引き起こす55の一般的な病原体との間に交差反応があるかどうかを検討した． 各病原微生物の出所と量的情報はSupplementary Dataset 1に記載した。 オリジナルのウイルス力価は、プラークアッセイを用いて106プラーク形成単位/mlとした。 細菌、マイコプラズマ、クラミジアの干渉試料については、濃度レベルは107 colony-forming units per mlであった。 さらに、ヒトゲノムDNAを抽出し、3つの全血試料から90-105 µg ml-1と定量された。 HC-FIA法はSARS-CoV-2に対して優れた特異性を示し、他のすべての病原体試料やヒトゲノムDNAとの明らかな交差反応は認められなかった（補足データセット1）。

モノクローナル抗体S9.6もRNA-RNA二重鎖19、特にAUに富んだもの20に結合するので、AUの分率を変えて二本鎖RNA配列を設計した。 詳細な配列情報は、補足表12に記載されている。 補足表13に示すように、AUの含有量にかかわらず、HC-FIAアッセイでは二本鎖RNAに対して検出可能な陽性シグナルを示さず、このことは、アッセイ条件下ではS9.6抗体と二本鎖RNAとの結合親和性が低いことを示している。 また、二本鎖RNAの存在が、臨床の咽頭ぬぐい液や喀痰サンプルの検出におけるアッセイの性能に影響を与えるかどうかについても検討した。 陽性咽頭拭い液2検体，陽性喀痰2検体，陰性咽頭拭い液10検体，陰性喀痰5検体を用いた． 干渉のないテストのT/C値に関してT/C比を測定したところ、0.9から1.1の範囲であった（Supplementary Dataset 1）。 このことから、二本鎖RNAの存在は、AU含量にかかわらず、HC-FIAアッセイの性能に大きな影響を与えないことがわかった。

Sensitivity and precision of the HC-FIA assay

標的遺伝子を3分割した偽ウイルス試料を、5000、2500、1000、800、500、250、100 TU ml-1の力価に連続希釈し、並行20試験の平均T/C値を算出した。 図2aは、SARS-CoV-2のN、EまたはORF1ab領域が陽性の偽ウイルスの検出限界（LOD）値が1,000 TU ml-1と低く、陽性率が95%以上であったことを示している。 また、偽ウイルスの力価が108 TU ml-1に達しても、顕著なフック効果は認められなかった(Supplementary Fig. 2)。 図2：HC-FIAの感度

縦軸はテストシグナル（T）とコントロールシグナル（C）の蛍光強度比（T/C）であり、縦軸はテストシグナルの蛍光強度比（T）、横軸はコントロールシグナルの蛍光強度比（C）である。 各濃度について、20回の試験を並行して行った。 LODは、陽性率が95%以上となる濃度として決定した。 a, SARS-CoV-2のN、E、ORF1ab領域が陽性の連続希釈した偽ウイルスサンプルのT/C比。 データは平均±s.d.

RT-qPCRを用いてSARS-CoV-2陽性と判定され、デジタルPCRを用いてウイルス量が定量された3人の重篤な患者からの咽頭ぬぐい液を、1mlあたり2000、1000、500、400、250コピーにシリアル拡張するために、陰性咽頭ぬぐい液を混合して調製される。 Fig. 2bに示すように，LODは500copies/mlであり，95%以上の陽性率が得られた． 陽性の臨界値（100）に近いT/C値を持つ臨床用咽頭拭い液サンプル（デジタルPCRによるORF1ab領域のコピー数が512、489、497/mlのサンプル）を用いてLODを検証した（試験は20回平行して実施した）。 これらの検体の陽性率は95％以上であった（補足表14-16）。

HC-FIAキットの精度を評価するため，臨床用咽頭拭い液検体ごとに5日間連続して20回の並行検査を実施した． 代表的な臨床検体として、陽性検体（ORF1ab領域1348コピー/ml）、重症者の検体（critical；512コピー/ml）、陰性検体（0コピー/ml）を選択した。 陽性試料を検出する際の3バッチの平均T/C値は以下の通りであった。 それぞれ，199.92 ± 8.25（CV = 4.13％），200.68 ± 7.91（CV = 3.94％），199.03 ± 7.43（CV = 3.73％）となり，一方，109.17 ± 5.68（CV = 4.65％），110.80 ± 5.68（CV = 3.75％）であった．63 (CV = 5.08%) と 111.48 ± 4.67 (CV = 4.19%) であり，臨界試料では 44.66 ± 3.36 (CV = 7.52%), 43.99 ± 2.72 (CV = 6.18%) と 44.72 ± 2.98 (CV = 6. 6) であり，臨界試料の方が優れていた。66%) が陰性試料に適用されました。 バッチ間CV値は3.89％、4.66％、6.74％であった。 6085>

HC-FIAの堅牢性

HC-FIAの堅牢性を知るために、内因性干渉物質（ヘモグロビンやムチンなど）と外因性干渉物質（特に、抗ウイルス剤、抗生物質、ホルモンなど呼吸器感染症患者の治療によく用いられる臨床薬）の影響を評価しました。 この実験では、臨床用咽頭拭い液サンプルを18個使用し、その内訳は、臨界サンプル（デジタルPCRによるORF1ab領域が500〜530コピー/ml）6個、陰性サンプル6個、陽性サンプル6個であった。 また、結果はT/C値の比率で記録した（干渉試料対対照試料）。 調製した干渉試料において、ヘモグロビン濃度は 0.5 g l-1, 1.0 g l-1, 2.0 g l-1 であり、ムチンに対する濃度は 5 g l-1, 10 g l-1, 20 g l-1であった。 外因性干渉サンプルの薬物濃度（補足表17-19）は、生体内の血漿中ピーク濃度よりもはるかに高かった。 予想通り、すべてのT/C比は0.9-1.1の範囲にあり（補足データセット2）、HC-FIAアッセイは干渉に対して堅牢であることが示された。

HC-FIA検査キットの臨床評価

HC-FIA検査の性能をさらに評価するために、3つの独立した医療機関でRT-qPCR（上海ZJバイオテック社製、NMPA承認SARS-COV-2検出キット）または臨床診断結果と比較する無作為二重盲検臨床試験が実施された。 臨床評価に使用したHC-FIA検査キットには、検査カード、溶血液、検体保存液、陽性・陰性コントロール、DNAプローブと標識抗体を含む反応チューブが含まれている。 指定病院から提供されたCOVID-19確定例または除外例の臨床診断結果は，中国の「新型コロナウイルス肺炎の診断と治療プロトコル（試行版6.0）」のガイドラインで規定されたCT画像と患者の臨床症状に基づいている。 670名から提供された合計734検体（咽頭拭い液593検体、喀痰141検体）を並行して検査した。 臨床試験の生データは、Supplementary Dataset 3として提供されている。 使用したRT-qPCR検出キットは3ターゲット（ORF、N、E）系として設計されており、陽性・陰性サンプルの識別はテストレテストの原則に従った。 内部標準が無効であったことによる4回の失敗検査に加え，標的rdrp遺伝子が1つだけ陽性であったことによる1回，NおよびE遺伝子だけが陽性であったことによる7回の再試験を行った。 6085>

試験に登録された670人のうち、313人が男性（46.72％）、357人が女性（53.28％）であった。 補足図3に示すように、登録者の年齢分布はSARS-CoV-2感染症の年齢分布と類似している21。 また、来院率、診断率も均衡していた。 HC-FIA検査キットの結果は、図3に示すように、蛍光灯下での典型的な結果の写真と、それに対応する読み出し正規化後のグラデーションカラーマトリックスであった。 補足図4のグラデーションカラーマトリックスには、734の臨床サンプル（補足データセット3）の正規化された蛍光読み出し値が示されています。

蛍光光源下の典型的な結果の写真、および最大読み出し値に対して正規化した、カラー勾配行列としての対応する蛍光読み出し値を示している。 E群はCOVID-19陰性の結果のみからなる。 カラーバーの水平線はカットオフ値を示す。 734の臨床サンプルの蛍光読み出し値のカラー勾配マトリックスを補足図4に、対応する数値データを補足データセット3に示す。

621例については、HC-FIA結果と臨床診断が一致した（確定210例、除外411例、表1）、49例（臨床診断で確定27例、除外22例）はHC-FIA結果とは矛盾していた。 730検体について、HC-FIA検査の結果とRT-qPCRの結果は一致していた（陽性249例、陰性481例；表1）。 RT-qPCRでは陰性であった4検体が，HC-FIAでは陽性であった． このうち3検体は臨床的にCOVID-19を除外して診断された患者のものであり，HC-FIA検査が偽陽性であったことを示している． 残りの1検体は臨床診断で確定した症例であり、HC-FIA検査と一致した。

コーヘンカッパは、カテゴリ変数間の一致の信頼性を測る指標としてよく使われますが、変数間の単純一致率に比べて、特にバランスの悪いデータセットでは偶然生じる一致も考慮に入れているのでより堅牢な指標と言えます。 我々は、κ値が0.75より大きい場合、高い一致度を示すと考えた（完全一致はκ=1に対応する）。 表2に示すように、HC-FIAテストの結果は、臨床診断（κ=0.8393）およびRT-qPCR（κ> 0.98、サンプルタイプによらず）と高い一致を示した。