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神経系は発生過程でパターン化、リモデリング、細胞の特定など広範な変化を遂げます。 成熟した哺乳類では、体のあらゆる器官や部位に行き渡る細胞のネットワークからなり、内外の刺激に対する本質的な生理反応をタイムリーに制御するために、インパルスを行き来させている。 神経系は、性質の異なる多数の細胞を用いて極めて複雑な構造を形成しており、その発生と機能発現には精巧な遺伝子制御機構が必要である。この神経系制御の新たなキープレイヤーとして、マイクロRNA（miRNA）が加わった。miRNAは、幅広い生物種とそのあらゆる細胞型で内因的に発現する約22塩基長の大量RNAの一群である。 miRNAは、多くのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することにより、様々な重要な生物学的プロセスを制御しています（Ambros, 2004）。 本総説では、哺乳類の神経系におけるmiRNAの役割について、現在の理解をまとめています。 miRNA は、宿主遺伝子のイントロンまたはエクソン内に位置する場合と、独立した転写単位を構成する場合があります (Rodriguez et al., 2004)。 miRNAは、通常RNAポリメラーゼIIによって、より長い一次転写産物の一部として転写される(Cullen, 2004)。 哺乳類では、転写物はDroshaと呼ばれるRNaseとその制御サブユニットDGCR8によって切断され、核内で約65ヌクレオチドのヘアピン前駆体が遊離される。 少数の前駆体はDroshaに依存しない方法で生成することもできる（Berezikovら、2007；Okamuraら、2007；Rubyら、2007）。 前駆体はその後、GTPと結合したExportin5とそのRan補因子によって細胞質へ輸送される。 細胞質では、前駆体はさらに別のRNaseであるDicerによって処理され、約22塩基対のRNA二重鎖中間体が生成される。 この二重鎖にアルゴノートタンパク質が結合し、構造が変化することで、成熟した一本鎖のmiRNAがアルゴノート：miRNA複合体中に保持される。 mRNAの発現と同様に、miRNAの発現も転写および転写後に制御することができ、いくつかの例については後述する。

アルゴノート：miRNA複合体は、RNA干渉および関連機構を介してmiRNAの直接生物効果を仲介する (He and Hannon, 2004)。 アルゴノートタンパク質と相互作用するタンパク質は数多く報告されているが、その後の機能はしっかりと確立されていない。 miRNAは、動物のmRNAの3′-非翻訳領域に存在する標的配列に結合することにより、RNAサイレンシングプロセスに特異性を与えることが知られている。 miRNAの5′末端、いわゆるシード領域と標的mRNAとの間の相補性は、結合特異性にとって不釣り合いなほど重要であり、一方、miRNAの3′末端は標的認識にはあまり寄与しないようである（Lewis et al.） 動物のmiRNAはその標的と完全に一致することはほとんどなく、部分的な相補性でmiRNAの機能としては十分であるため、1つのmiRNAが数百の遺伝子の発現を制御することもあり、一方、mRNAは複数のmiRNA標的部位を持つこともある (Lewis et al., 2005; Xie et al., 2005; Miranda et al., 2006)。 miRNAと標的mRNAの相互作用は、主に標的遺伝子産物（タンパク質）の産生を低下させるが、その詳細なメカニズムは不明である（Filipowicz et al.、2008）。 Argonauteタンパク質は、おそらく翻訳機構と相互作用してタンパク質合成を阻害する。この阻害は、おそらくmiRNAと標的転写物の性質に依存して、翻訳中の様々な段階（例えば、開始および伸長段階）で起こるかもしれない。翻訳が妨げられたmRNAは、しばしば蓄積も減少させる。 その他の作用機序もまた、miRNAに起因している。 例えば、miRNAは、循環培養細胞では遺伝子発現を抑制するが、停止細胞では遺伝子発現を増強する可能性がある（Vasudevan and Steitz, 2007; Vasudevan et al.） 後者の可能性は、ポストミトーシス神経細胞にとって重要な意味を持つが、これまでの研究努力は、神経系におけるmiRNAを介した遺伝子抑制の理解に集中している。

現在のmiRNAデータベースには約600のヒトmiRNA遺伝子があり、約1000の潜在的miRNAをコードする（Griffiths-Jonesら、2008）。 miRNA遺伝子は、種の保存を考慮して、miR-1、miR-2などの発見順に命名されているが、lin-4とlet-7の2つのmiRNAは例外である。 しかし、これらのアプローチには注意点がある。 少数のmiRNAは、おそらく誤った注釈であり、無関係な転写産物の分解産物であると考えられます（Berezikovら、2006a）。 さらに、miRNAは標的mRNAに結合することで機能するため、その数は数百に及ぶ可能性があり、miRNAの機能はその質量に決定的に依存する。 最も豊富なmiRNAのコピー数は、細胞や神経細胞あたり10,000をはるかに超えるが(Lim et al., 2003; Kye et al., 2007)、特定のデータベースmiRNAは発現レベルが低すぎて、それ以外の潜在的標的に対してほとんど効果がない可能性もある。 一方、あるmiRNAが全組織サンプルでほとんど見つからなくても、特定の細胞タイプまたは発生段階の細胞のサブポピュレーションに高度に制限されていれば、機能的である可能性があり、これは神経系の状況に関連している可能性がある

miRNA Expression in the Nervous System.を参照。 他の組織および細胞と同様に、神経系および神経細胞株もまた、miRNAを発現し、そのうちのいくつかは、組織および神経細胞において濃縮されているかまたは独特である（例えば、miR-9、miR-124、miR-125、miR-128、およびmiR-129）（Lagos-Quinanaら、2002；Dostieら、J． 2003; Babak et al., 2004; Barad et al., 2004; Kim et al., 2004; Liu et al., 2004; Nelson et al., 2004; Sempere et al., 2004; Baskerville and Bartel, 2005; Berezikov et al., 2006b; Hohjoh and Fukushima, 2007a; Landgraf et al., 2007; Bak et al., 2008)が挙げられる。 神経系で発現が確認されているmiRNA遺伝子の数は、他の多くの臓器に比べて多いようです。これは、神経系には多くの種類の細胞やサブタイプが存在することを反映しているのかもしれません。 miRNAの発現の複雑さを理解するために、これらの研究はさらに、成人の中枢神経系の解剖学的に異なる領域（例えば、小脳、視床下部、海馬）が同様のmiRNAを発現するが、相対的なmiRNAレベルは異なる領域で著しく変化しうることを明らかにしました。 オールトランスレチノイン酸で処理すると、胚性がん細胞はニューロン様細胞へと末期分化することが分かっています。 この形態変化に伴い、miR-9、miR-124、miR-125などのmiRNAの発現が経時的に著しく誘導されることから、これらのmiRNAは、成体での潜在的機能に加えて、分化や細胞の運命決定に関与している可能性が示唆されています（Sempereら、2004；Smirnovaら、2005；Hohjoh and Fukushima、2007b）。 また、神経系に特異的でない多くのmiRNAが影響を受けています。 例えば、miRNAのlet-7ファミリーは顕著に発現が上昇しており、おそらく分化や発生の過程により一般的な影響を及ぼしていると考えられる。 胚性幹細胞が神経発生やグリア形成を行う際にも、miRNAの発現に類似した深い変化が観察される（Smirnova et al, 2005; Krichevsky et al, 2006）。 さらに、miR-124およびmiR-128は神経細胞で優先的に発現し、一方、miR-23、miR-26、およびmiR-29はアストロサイトに限定されるか濃縮されることが示されている（Smirnova et al, 哺乳類の神経系発生におけるmiRNAの発現プロファイルも調べられており、ここでも時間的に制御されたmiRNA発現の波が観察されている（Krichevskyら、2003；Miskaら、2004；Smirnovaら、2005；Wheelerら、2006；Doginiら、2008）。 これらの結果はすべて、miRNAの発現プロファイルが神経細胞の発達のマーカーとして機能し、特定のmiRNAが発達過程に寄与している可能性を示唆している。

miRNAは培養神経細胞のポリソームから分離されており、miRNAが翻訳の制御に関与することと一致している (Kim et al., 2004; Nelson et al., 2004). 神経細胞における遺伝子制御の戦略的な側面は、多くのmRNAが特定の構造の近くに集中し、局所的で活性制御されたタンパク質合成を確実に行うことである。 miRNAの中にも、このような細胞内分布パターンを示すものがあると考えられる。 実際に、樹状突起におけるmiRNAの選択的な濃縮や枯渇が報告されている(Schratt et al., 2006; Kye et al., 2007)。 これらの結果は、miRNAが配列特異的なmRNA結合タンパク質と同様に、遺伝子発現を局所的に制御し、神経細胞のシナプス可塑性に影響を与える可能性を示唆している

miRNA Function: miRNAのグローバルロスの研究からの教訓。 miRNAの生合成に必要な遺伝子であるDicerの条件付きノックアウトは、マウスの特定の組織や細胞型におけるmiRNAの集団的役割を調べるために広く使用されている。 成熟プルキンエ細胞におけるDicerの喪失は、細胞の生理学や機能に直ちに影響を与えることなく、miRNAの急速な拡散をもたらす(Schaefer et al.、2007)。 しかし、最終的には細胞死を引き起こし、小脳変性症の進行や運動失調の発症につながり、ヒトの神経変性疾患と類似している。 中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるDicerの切除もまた、in vitroおよびin vivoでニューロンの進行性喪失をもたらし、変異マウスはパーキンソン病患者を思わせる運動量の著しい減少を示した（Kim et al.） 胚15.5日目からマウスの大脳皮質と海馬でDicerをホモ接合でノックアウトすると、樹状突起の形態変化、アポトーシス、小頭症、運動失調、生後3週までに死亡する（Davis et al.、2008）。 線条体のドーパミノ受容体ニューロンのDicerを欠損させたマウスも、行動および神経解剖学的表現型を示すが、他の研究で対象としたニューロンとは異なり、影響を受けたニューロンは動物の寿命である約10週間にわたって生存する（Cuellarら、2008年）。 Dicerはさらに、胚における嗅覚の分化、嗅覚前駆細胞の維持、嗅覚前駆細胞の分化に必要であるが、マウスの成熟神経細胞が適切に機能するためには不要である（Choi et al.、2008年）。 これらの表現型の根本的な原因は、miRNAの枯渇により、重要なタンパク質が非常に徐々に失われること、あるいは特定のタンパク質が最終的に細胞にとって毒となるレベルまで蓄積されることにあるのかもしれない。 Dicerはsmall interfering RNAなど他のsmall RNAも処理するため、観察された表現型のいくつかがDicerのmiRNAに依存しない機能の喪失に起因するかどうかは不明なままである。 miRNAの処理に関与する別の遺伝子であるDGCR8のハプロイン欠損は、同様にマウスでmiRNAの発現低下と神経細胞および行動の障害をもたらす（Starkら、2008）。 全体として、神経細胞の分化と生存におけるmiRNAの重要な機能については、非常に強い主張が可能であり、他の組織におけるmiRNAの遍在的な発現とその機能とも一致します。 個々のmiRNAの研究からの教訓。 発達中の神経細胞における個々のmiRNAの機能が研究されている。 中脳ドーパミン作動性ニューロンの維持におけるmiRNAの複合的な役割を示した同じ研究（Kimら、2007年）において、miR-133bは、胚性幹細胞および中脳培養物からのこれらのニューロンの分化を抑制することが見いだされました。 著者らは、miR-133bの標的を、ドーパミン作動性ニューロンの遺伝子発現を通常活性化する転写因子Pitx3であると同定した。 Choiら（2008）は、miR-200が嗅覚前駆細胞の分化に必須であり、その機能はNotchシグナル伝達経路、トランスフォーミング増殖因子-βシグナル伝達経路およびFoxg1を標的とする能力に依存している可能性があることを明らかにした。 miR-124の発現は、胚性幹細胞や神経細胞前駆細胞では少ないが、神経細胞では劇的に増加する。 miR-124をもう一つの豊富なmiRNAであるmiR-9とともに早期に過剰発現させると、前駆細胞の分化がニューロンに移行することから、miR-124とmiR-9がニューロンの分化を刺激することが示唆された（Krichevskyら、2006年）。 別の研究では、miR-124の過剰発現は神経突起伸長を促進し、一方、miR-124の機能阻害は神経突起伸長を遅延させた（Yu et al.、2008）。 一方、成熟した神経細胞でmiR-124の活性をブロックすると、非神経細胞のmRNAのレベルが上昇する（Conaco et al. まず、RE1-サイレンシング転写抑制因子の構成要素であるsmall C-terminal domain phosphatase 1の発現を抑制する（Visvanathan et al.、2007）。 非神経組織では、RE1-silencing転写抑制因子は、mRNAとmiRNAの両方の発現を調節する重要な転写因子の新しい例であるmiR-124 (Conaco et al., 2006) を含む多くの神経細胞遺伝子の転写をシャットダウンしている。 神経細胞でmiR-124が増加した結果、多くの神経細胞特異的な遺伝子の転写が誘導される。 第二に、miR-124は、非神経細胞におけるニューロン特異的な代替エキソン封入のグローバルな抑制因子であるポリピリミジントラクト結合タンパク質1の発現をブロックする（Makeyevら、2007年）。 このように、miR-124は2つのマスターレギュレーターを操り、様々な遺伝子の発現に影響を及ぼしている。 miR-124は、細胞骨格の制御に関わる多くの遺伝子を直接標的としており、このことが神経突起伸長を促進する機能を説明できるかもしれません（Yuら、2008）。 ラット海馬ニューロンでは、miR-134はシナプス樹状突起コンパートメントに集中している（Schrattら、2006年）。 miR-134を過剰発現させると、シナプスの強さに近似する樹状突起スパインの体積が著しく減少し、一方、miR-134の機能を阻害すると、スパインの体積が増加することがわかった。 樹状突起では、miR-134は、アクチンフィラメントの動態を制御するlim-domain containing protein kinase 1（Limk1）の翻訳を阻害している。 Limk1の過剰発現は、miR-134のスパイン形態への影響を打ち消すことから、Limk1の発現阻害が、miR-134が樹状突起スパインのサイズを抑制する主要な経路であることが示唆された。 Limk1とmiR-134の機能的相互作用は、シナプス刺激時に放出される脳由来神経栄養因子によって、まだ解明されていないメカニズムで緩和されるため、神経細胞の活動によって制御される可能性がある。 つまり、RNA特異的結合タンパク質と同様に、miRNAと標的mRNAの結合が刺激によって制御されれば、その刺激によってmiRNAとmRNAの相互作用を調節し、遺伝子発現を迅速かつ協調的に制御することが可能になるということである。 miR-134は、今のところ、神経細胞に局在する機能を持つことが示された唯一の哺乳類miRNAであるが、miRNAの生合成と機能に関わるタンパク質がシナプス後密度、軸索、成長コーンに存在するという発見は、追加のmiRNAの特定の機能がそのような場所で特定される可能性を示唆している（Lugliら、2005；HengstとJaffrey、2007）。 神経伝達物質の放出制御におけるmiRNAの役割を示唆するものとして、miR-130aおよびmiR-206がヒト間葉系幹細胞由来の神経細胞における神経伝達物質サブスタンスPの合成を阻害し、インターロイキン1αがこれらのmiRNAの発現を低下させて阻害状態を解除することが報告されています (Greco and Rameshwar, 2007)。

神経系miRNAの発現や機能は、薬物などの外部からの合図によって影響を受ける。 エタノールが胎児の脳の発達にどのように影響するかを研究するためのマウス胎児大脳皮質由来ニューロスフィア培養モデルにおいて、高用量のエタノールはmiR-21、miR-335、miR-9、およびmiR-153の発現を抑制するが、低用量のエタノールでmiR-335を誘導することが示されている (Sathyan et al., 2007)。 活性酸素種は、ヒトの脳細胞培養におけるmiRNAの発現を変化させ（Lukiw and Pogue, 2007）、この状況は、アルツハイマー病と関連性があると考えられる（Lukiw, 2007）。 miRNAを標的とする精神療法薬の例として、リチウムとバルプロ酸という2つの重要な気分安定薬が、ラット海馬のlet-7b, let-7c, miR-128a, miR-24a, miR-30c, miR-34a, miR-221, および miR-144 の長期発現に影響を与えている (Zhou et al., 2008)。 これらのmiRNAの機能は、より明確に定義される必要があります。 これらのmiRNAは、エタノール、活性酸素、気分安定薬の遺伝子発現への影響を部分的に仲介しているかもしれませんし、脳細胞の適応的な変化を意味しているかもしれません。 miRNAの変化から、その標的遺伝子の発現変化を推測し、検証することで、様々な薬剤や治療法の作用機序を明らかにすることができる。 そのような研究の1つで、長期の高浸透圧刺激が視床下部におけるmiR-7bレベルを増加させることが示され、miR-7bの標的が、多くの神経薬理作用に対する反応を仲介する重要な転写因子であるFosであることが特定された（Leeら、2006年）。 miR-132の転写は、Fosと同様に、様々な刺激や神経活動に応答するcAMP response element binding proteinによって正に制御されている（Vo et al.、2005；Wayman et al. miR-132がcAMP response element binding protein依存的に産生されると、p250GAPが抑制され、神経突起が伸長し、樹状突起の可塑性に寄与することが分かっています。 miR-132の第二の標的は、一般的な転写抑制因子であるメチルCpG結合タンパク質2です（Kleinら、2007）。 さらに、miR-132ともう一つの脳特異的miRNAであるmiR-129は、光と概日時計によって制御され、今度はin vivoで視交叉上核の概日リズムプロセスを調節する（Chengら、2007）。 今後、転写因子、mRNA結合タンパク質、その他の制御タンパク質と協調して、miRNAがどのように作用し、内外の刺激に応答して遺伝子発現を時間的、空間的に微調整しているかが明らかにされるでしょう。 miRNAの発現および機能の異常は、神経系における癌および他の疾患との関連が示唆されています。miRNAは、グリオブラストーマおよび神経芽腫において異なる発現が見られます（Chanら、2005年；Ciafreら、2005年；Laneveら、2007年；Lukiwら、2009年；Silberら、2008年）。 例えば、グリオブラストーマでは、miR-21、miR-221、miR-222が増加し、miR-7、miR-124、miR-137が減少する。miR-21はがんにおいて頻繁に過剰発現するがん遺伝子として疑われている。 miR-221とmiR-222の潜在的な標的には、細胞周期進行の阻害剤であるp27とp57が含まれ（Gillies and Lorimer, 2007; Medina et al, 2008）、一方、miR-7の減少は上皮成長因子受容体とAkt経路の発現を上昇させるかもしれない（Kefas et al, 4096>

多くのDicerノックアウト研究により、ヒトの神経変性疾患（上記参照）で示される表現型と同様のマウス表現型が明らかにされており、グローバルおよび／または特定のmiRNAの喪失が疾患に寄与している可能性があることが示唆されている。 ヒトでは、トゥレット症候群の有力な候補遺伝子であるSLITおよびTrk-like 1をコードするmRNAの3′-非翻訳領域におけるmiR-189結合部位の一塩基多型が同定されている（Abelsonら、2005年）。 パーキンソン病患者の中脳ではmiR-133bの発現が欠損しているが、miR-133bの欠損とパーキンソン病の因果関係の解明が待たれる（Kimら、2007年）。 統合失調症患者の前頭前野(Perkins et al., 2007)やアルツハイマー病患者の脳では、多くのmiRNAが異なる発現で見つかっている(Lukiw, 2007; Lukiw et al., 2008)。 例えば、アルツハイマー病患者の脳細胞では、miR-146aの発現が上昇し、一方、その推定標的である補体因子Hの発現が低下していることが知られている。 miR-146aの転写は、nuclear factor-κBによって刺激されることから（Taganov et al. アルツハイマー病は、さらに、通常βセクレターゼの発現を抑制する脳内miR-29およびmiR-107の消失と相関している（Hebertら、2008年；Wangら、2008年）。 最後に、ハンチントン病患者では、miR-132の減少を含むmiRNAの発現の変化が報告されている（Johnsonら、2008年）。 miRNAの発現と神経疾患との間に相関関係が確立されると、これらの様々な疾患に対するmiRNAの寄与を解明することが困難な課題となっています。 様々な疾患においてmiRNAの発現に差があることから、そのような疾患を治療するためにmiRNAを過剰発現させたり、miRNAの機能を阻害したりすることは魅力的なことである。 まだ予備的な結果ではありますが、miR-21の機能を阻害することで、グリオブラストーマ細胞にアポトーシスを誘導し、マウスでの細胞毒性腫瘍治療に対して細胞を感作することが示されています（Chanら, 2005; Corstenら, 2007）。 グリオブラストーマ細胞におけるmiR-221およびmiR-222の過剰発現は、早期の細胞周期入りを促進し、細胞死を引き起こす（Medinaら、2008年）。 同様に、miR-7の過剰発現は、in vitroにおける初代グリオブラストーマ株の生存率および侵襲性を低下させる（Kefasら、2008年）。 これらの研究は、miRNAの発現の差は機能的な結果をもたらし、miRNAは薬物介入のための標的として機能する可能性があることを実証している。 例えば、コレステロールを結合させたmiRNAやその阻害剤、あるいはそれらのウイルス発現ベクターを、脳内に標的として注射することにより、miRNAの機能を変化させることが可能である。 一方、miRNAの発現を制御する薬剤が開発されたり、miRNAの下流エフェクターが明らかになれば、それらも薬剤ターゲットとなる。

また、人工miRNAやショートヘアピンRNAが設計され、疾患モデルにおいてRNA干渉を介して遺伝子発現を抑制するのに使用されている。 このような場合、miRNAは小干渉RNAとして機能し、ウイルス遺伝子や病気を引き起こすことが知られている内因性遺伝子を標的とする。 ある研究では、レンチウイルスにコードされたショートヘアピンRNAを頭蓋内に1回投与することで、日本脳炎ウイルスによって引き起こされる致死性脳炎からマウスを保護しました（Kumarら、2006）。 別の研究では、脊髄小脳失調症1型の原因タンパク質である変異型アタキシン-1に対するショートヘアピンRNAを発現する組み換えアデノ随伴ウイルスを小脳内に注入すると、マウス疾患モデルにおいて運動協調性が改善し、小脳形態が回復し、アタキシン-1の核内封入体が減少しました（Xiaら、2004年）。 3番目の研究は、ハンチントン病（McBrideら、2008年）を対象としている。ハンチントン病は、優性突然変異体のハンチンチンタンパク質によって引き起こされる。 このタンパク質に対する人工的なmiRNAは、組み換えアデノ随伴ウイルスによってコードされ、変異型ヒトハンチンチンタンパク質を発現するマウスの線条体に注射することで送達される。 このmiRNAは、マウス脳内で明らかな毒性を引き起こすことなく、変異型ハンチンチンの発現を低下させることができる

今後の展望。 検証されたmiRNAの標的および機能のコレクションは、近い将来、勢いよく拡大することは間違いない。 神経系を制御するmiRNAの複雑な役割の理解を深めるには、以下のような多くの問題に取り組むことが非常に有益である。 まず、発達・成熟期の神経系に存在する様々な種類の細胞やサブタイプに対応するために、miRNAの発現分解能を向上させることは可能か？ さらに、miRNAの細胞内局在は動的であり、神経細胞においてmiRNAの機能は空間的に制御されているのでしょうか？ 第二に、システムあるいはグローバルな視点から、miRNAの発現の変化がどのようにタンパク質の発現の変化、ひいては表現型の変化につながるかを評価する必要がある。 miRNAは、おそらく多くの標的を持っています。 発表された報告書では、すべてのmiRNAについて、その活性がmiRNAの機能全体と一致する標的を1つだけ調べていますが、miRNAは生体内の特定のプロセスを正にも負にも制御する遺伝子を制御できる可能性が非常に高いのです。 miRNAの作用はまた、他の調節分子（例えば、転写因子）の作用と統合されている。 第三に、遺伝学的アプローチ（個々のmiRNAの条件付きノックアウトなど）により、哺乳類の神経系におけるmiRNAの機能について、より明確な答えが得られると思われます。 ワムシ、ハエ、ゼブラフィッシュを用いた遺伝学的解析は、miRNAに関する我々の知識を大きく前進させ、実際、哺乳類系における多くの知見を予言または裏付けてきました。 最後に、miRNAと神経疾患との因果関係を明らかにし、新たな治療法の考案に役立てる必要がある

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