結果と考察

転写因子NF-κBの一定した活性化は、転座t（11；18）のMALTリンパ腫のAPI2とMALT1融合蛋白によるB細胞転換に必須と考えられています。 293T 細胞に API2-MALT1 を一過性に過剰発現させると、NF-κB ルシフェラーゼレポーター遺伝子が強力に活性化されるため、 API2-MALT1 が NF-κB にシグナルするメカニズムを調べるための有用なモデル系となる。 トランスフェクション効率をモニターするために、我々は多くの実験でpEGFP-N2 (Clontech) を共発現させた。 驚いたことに、EGFPはAPI2-MALT1によって誘導されるNF-κBの活性化を用量依存的に阻害することが観察された（図1A）。 対照的に、EGFPはNF-κBのp50/p65サブユニットの発現によって誘導されるレポーター活性化に影響を与えなかった（図1B）ことから、NF-κBの上流でAPI2-MALT1によって活性化するNF-κBシグナルカスケードに干渉することが示唆された＜788＞ ＜1982＞ ＜8365＞thumbnail＜2447＞ ＜9497＞ ＜1982＞ダウンロード

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図1. EGFPは293T細胞のNF-κBおよびJNK活性化を抑制する

(A) Flagタグ付きAPI2-MALT1融合タンパク質によるNF-κBルシフェラーゼレポーターの活性化は、EGFPにより用量依存的に抑制された。

(B) EGFPはNF-κBのp50/p65サブユニットの発現によって誘導されるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性をブロックしない(C) Flag-API2-によるNF-κBルシフェラーゼレポーターの活性化は、Flag-API2-MALT1融合タンパク質によるルシフェラーゼ活性化によって誘導される。MALT1は、TRAF6結合モチーフについて変異させたEGFPによって阻害される。 (D) EGFPではなくpmaxGFPは、293T細胞において、TNF-αによって誘導されるNF-κBルシフェラーゼレポーターの活性化、およびIκB-αとJUNのリン酸化を阻止する。

EGFPは293T細胞においてHSP70レベルを増加させず、HSP70B′を誘導しない。

EGFPおよびpmaxGFPの蛍光強度（Ex485／EM520nm）は両方ともバックグラウンドより〜100倍であった。 (E）N末端および／またはC末端のEGFP融合タンパク質（API2、CHIC2、NXF5a、NXF1、MALT1、アクチン、Rab5、シンデカン結合タンパク質2（SDCBP2）またはβチューブリン用）と核局在シグナル（NLS）またはファーニシレーションサイト付きEGFP（pEGFP-F）は293T細胞のTNF-α誘発NF-κBルシフェラーゼレポーター活性を低下させる。 下図 ヒトでは、HSP70は通常の状態では構成的に発現しているが、Hsp70B′はストレスに応答してのみ誘導される。

Hsp70B′の基底発現は存在しない。

HSP70B′発現の陽性対照として、293T細胞（レーン2）を44℃で2時間（レーン3）熱ショックし、収穫前に37℃で5時間（レーン4）または18時間（レーン5）回復させた。 NF-κB依存性ルシフェラーゼ活性は、ベクター導入細胞の倍率誘導として各実験について表され、少なくとも3つの独立した実験の平均および標準偏差としてグラフで表される。

すべての分子量標準はkDaである。 BCL10はMALT1のオリゴマー化を仲介し、TRAF6との複合体形成を可能にすると考えられている。 TRAF6のオリゴマー化は、そのRINGドメインのE3ユビキチンリガーゼ活性を引き出し、Lys63に結合したポリユビキチン鎖を介してIKKγ (NEMO) を修飾することになる。 これにより、IKKγはTGF活性化キナーゼ1（TAK1）と相互作用し、IKKβのリン酸化を介してIKKキナーゼ複合体（IKK）を完全に活性化し、NF-κBを活性化させることになります。 同様に、API2-MALT1融合タンパク質は、TRAF6を介したIKKγのポリユビキチン化を介して、NF-κBを活性化する 、. TRAF6とMALT1のカルボキシ末端との相互作用は、2つの潜在的なTRAF6結合モチーフ（PxExxAr/Ac、Ar/Acは芳香族または酸性残基）を介して行われる . EGFPの配列を調べたところ、TRAF6結合コンセンサス（PNEKRD、AA212-217）が存在することがわかった。 EGFPの結晶構造から、PNEKRDモチーフは2枚のβシートの間のループに露出しており、そのアクセス性とTRAF6を隔離することによるEGFPの負の調節因子としての役割が示唆された。 しかし、co-IP実験ではEGFPとTRAF6の相互作用は確認できず（データなし）、TRAF6結合コンセンサスの変異体もEGFPと同様にAPI2-MALT1によるNF-κB活性化をブロックした（図1C）。 ここでも、EGFPは、レポーター活性の低下およびNF-κBの阻害剤であるIκB-αのリン酸化の低下によって示されるように、NF-κBシグナルを減少させた（図1D）。 次に、EGFP融合タンパク質が同じ効果を持つかどうかを評価した。 N末端とC末端の両方のEGFP融合タンパク質は、API2-MALT1（データは示さず）およびTNFα誘導のNF-κB活性化をブロックした（図1E）。 NF-κB経路の活性化に加えて、TNF-α処理もJNKシグナル伝達を誘発する。 788>

GFP 発現細胞を長時間可視化すると、活性酸素の産生が誘導され、生理的変化や最終的には細胞死を引き起こすことが報告されている。 興味深いことに、TRAF6結合コンセンサスのEGFP変異体は、いずれも緑色の蛍光を失っていたが、NF-κBシグナルを効率的に阻害していた（図1C）。 さらに、構造的に異なる蛍光タンパク質であるpmaxGFP（Amaxa Biosystems）は、TNF-α処理によるNF-κBおよびJNKの活性化に影響を与えなかった（図1D）ことから、阻害はフリーラジカルに伴う光障害に起因しないことが示唆された。 別の研究では、高レベルの EGFP が熱ショックタンパク質 70（HSP70）を誘導し、IKKγおよび TRAF6 との相互作用を介して NF-κB 活性化を抑制できることが示された。 しかし、HSP70の誘導は内皮細胞に限られ、EGFP発現293T細胞ではHSP70レベルの増加やHSP70Bの誘導は見られなかった（図1D-E）。

API2-MALT1発現やTNF-α処理によるNF-κB活性化には、IKKγをLys63結合ポリユキビチンで修飾する、TRAF6やTRAF2によるそれぞれの修飾と関連しているという。 さらに、TNFαで誘導されたJNKシグナルは、TRAF2の自動ユビキチン化を必要とする 。 TRAF6とTRAF2のRING E3ユビキチンリガーゼ活性に対するEGFPの影響を評価するために、重合に利用できるLys63のみを持つHAタグ付きユビキチン変異体（HA-Ub-K63）を介してユビキチン化を観察した。 API2-MALT1の発現またはTNF-α刺激により、293T細胞におけるポリユビキチン化タンパク質のレベルが上昇し、免疫沈降物におけるIKKγポリユビキチン化の増強と関連しており、両方の過程がEGFPにより阻害された（図2A、1、2、5、6レーン）。 さらに、EGFPは293T細胞におけるK63結合ポリユビキチン化の基底レベルを減少させた（図2A、レーン3および4）。 同様に、API2-MALT1の発現またはTNFα処理は、K48-リンクユビキチン鎖の集合を刺激し、これは再びEGFPおよびその構造的ホモログdsRed（Clontech）によってブロックされるがpmaxGFPによってブロックされない（図2B）

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図2. EGFPはLys63およびLys48に結合したポリユビキチン化を阻害する。

(A) 示した構築物をトランスフェクトし、20ng/ml TNF-αで4時間処理した293T細胞（レーン5および6）を抗Flag（API2-MALT1）、抗HA（HA-Ub-K63）および抗EGFP抗体で免疫ブロットし（左パネル）または抗IKKγ免疫沈降を抗Flag（IKKγ）または抗HA（ユビキチン）により免疫ブロットした（右パネル）。

(B) EGFPはK48結合ポリユビキチン化に影響を与える。

293T 細胞に、重合に利用できるLys48のみを有するユビキチン構築物（HA-Ub-K48）をトランスフェクトし、20ng/ml TNF-αで4時間処理するか未処理として、細胞溶解物を抗HA (Ub-K48) および抗EGFP抗体で免疫ブロッティングを行った。

EGFPとpmaxGFPの蛍光強度（励起485/放出520nm）は同等であり（バックグラウンド値より約100倍高い）、pDs-Redの発現は蛍光顕微鏡で確認された。

(C) EGFPは、そのLys48に関連した自動ユビキチン化およびプロテアソーム分解の減少を介して、293T細胞において外因性API2-Mycを安定化させる

(D) メルケル細胞癌細胞株MCC14におけるEGFPの安定発現。2は、ポリユビキチン化を減少させ、内因性p53発現レベルを高める。

アクチン信号に対するp53信号の平均比および標準偏差が与えられる（3回の独立実験）、（Ub）n：ポリユビキチン化された蛋白質。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002

EGFPがTRAFタンパク質によるユビキチン化にのみ影響するかどうかを調べるために、我々は、Lys48と結合した自動ユビキチン化を介して自身を不安定化するRING E3ユビキチンリガーゼであるAPI2について評価した。 EGFPを293T細胞に共発現させると、API2によるポリユビキチン化が抑制され、API2の発現量が増加した（図2C）。 また、EGFPを安定発現させたMCC14.2細胞では、ユビキチン化の定常状態が減少していることが観察された。 その結果、MDM2によるLys48結合ユビキチン化によって厳密に制御されている内在性p53の基底レベルは、EGFP発現細胞でわずかに増加した（図2D）。 EGFPトランスジェニックマウスの脾臓リンパ球では、ポリユビキチン化の基底レベルが減少しており、これはコントロールマウスと比較して抗原刺激後のIκB-αのリン酸化の減少と関連しており、EGFPがB細胞受容体によるNF-κB活性化を減少させていることを示しています（図3A-B）。 API2-MALT1トランスジェニックマウスは、API2-MALT1によるNF-κB活性化によってナイーブB細胞への成熟が促進されるため、骨髄中のB220+/CD40+ B細胞が欠損している。 これらのAPI2-MALT1トランスジェニックマウスをEGFPマウスと交配すると、EGFP/API2-MALT1ダブルトランスジェニックマウスの骨髄におけるB220+/CD40+ B細胞の欠損が回復し（図3C）、さらに生体内のユビキチン化とNF-κBシグナルへの影響が支持された。 同様に、EGFPマウスの肝細胞ではポリユビキチン化が減少し、その発現量の増加によって示されるように、p53の安定化に関連していた（図3A, D）。 肝臓のγ線照射によるDNA損傷に伴うp53の主要な標的遺伝子はp21であり、これは細胞周期の停止とDNA修復に必要である。 従って、γ線照射による DNA 損傷は、EGFP マウスで高い p53 応答を示しただけでなく、p21 の誘導も若干亢進した（Fig. 3D）。 最後に、EGFPがユビキチン鎖の集合に直接影響するかどうかを評価するためにin vitroの実験を行った。しかし、組換えEGFPは対照基質のポリユビキチン化に影響を与えなかった（図3E）ことから、EGFPのユビキチン化への影響は細胞の状況に依存していると思われる＜788＞＜1982＞＜4138＞thumbnail＜2571＞＜9497＞＜1982＞ Download:

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図3. EGFPはin vivoでポリユビキチン化依存プロセスに影響を与える .

(A) FVB野生型（wt）およびEGFPトランスジェニックマウスの脾臓および肝臓抽出液をユビキチン、EGFPおよびアクチンに対する抗体（ロードコントロール）を用いて検出したウェスタンブロット。

（B）EGFPは、EGFPマウスから精製した抗IgM／抗CD40刺激Bリンパ球におけるIκB-αのリン酸化を低減する。

実験は3連で行い、1実験の代表画像を示す。

非刺激細胞に対するアクチンに対するIκB-αPの比の平均および標準偏差が与えられる。

(C) API2-MALT1マウスの骨髄におけるB220+/CD40+ B-細胞の欠損は、EGFP/API2-MALT1ダブルトランスジェニックマウスにおいて回復する。

3連で行った実験、その平均および標準偏差が描かれる。 eMalt1: endogenous Malt1, *a-specific band (D) EGFPマウスは肝臓でp53レベルの増加を示し、γ線照射によるDNA損傷時にp53/p21反応が亢進することがわかった。

サンプル1に対するp53/p21とアクチンのシグナルの比の平均と標準偏差を示す。

(E) 組み換えEGFP（rEGFP）はin vitroでのビオチン-リゾチーム基質のポリユビキチン化を阻止しない。 (Ub)n: polyubiquitinated proteins.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003

結論として、我々のデータは、EGFPおよびEGFP融合タンパク質が細胞株およびマウスにおいてNF-κBおよびJNKシグナルまたはp53ホメオスタシスなどのRING E3ユビキチンリガーゼ依存プロセスに影響を与えることを示している。 NF-κB は、自然免疫、適応免疫、発生、細胞増殖、生存など、多様な生物学的プロセスの制御において中心的な役割を担っています。 生存促進シグナルは、B細胞白血病/リンパ腫-XLのようなアポトーシスの阻害剤の発現上昇に起因している。 したがって、細胞内またはマウスの脳の運動野と線条体におけるEGFPによって誘導されるアポトーシスの増加は、ポリユビキチン化およびその上流の制御因子の活性化/分解の欠陥によるNF-κB活性の低下に関連している可能性がある。 また、ユビキチン化の欠陥は、アクチンのユビキチンリガーゼであるTrim32の変異に関連する四肢帯状筋ジストロフィーを引き起こすと推測されている。 EGFPは筋肉細胞におけるアクチン-ミオシン相互作用を阻害し、EGFPマウスに拡張型心筋症を誘発することが示されていることから、アクチンのユビキチン化は正常な筋肉機能において必須の役割を果たし、EGFPによるその調節が上記の表現型を引き起こすと推測することができます。 したがって、多くの細胞プロセスにおけるユビキチン化の新たな役割を考慮すると、ライブセルレポーターとしてのEGFPの使用は慎重に検討されるべきであろう

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