Molecular Identification of Mycobacterium Species of Public Health and Veterinary Importance from Cattle in South State of México

Abstract

Mycobacterium属は様々な人獣共通感染症を引き起こす． 最もよく知られた例はM. bovisによる人獣共通感染症の結核である。 非結核性抗酸菌（NTM）」についてはあまり知られていないが、これらもヒトの感染症に関連している。 メキシコの規格NOM-ZOO-031-1995は，牛のM. bovisの存在を規制しているが，NTM種に対する規制は存在しない。 本研究の目的は，メキシコ州南部地域の牛群から非結核性抗酸菌種を分離・同定し，23S rRNA遺伝子における100 bp分子マーカーの同定・検出とその後の16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定を通じて，非結核性抗酸菌種を特定することにある． 牛乳サンプル（35）と鼻腔滲出液サンプル（68）が採取された。 分離された108株から39株が同定用に選択された。 鼻汁から分離された13株は100 bpの分子マーカーを増幅し，M. neoaurum（6株），M. parafortuitum（4株），M. moriokaense（2株），M. confluentis（1株）であると同定された． M. parafortuitum以外の種は，ヒト，特に基礎疾患を有するヒトに対して病原性を示すため，公衆衛生上，獣医学上，懸念される。

1. はじめに

マイコバクテリウム属は、多種多様な人獣共通感染症を引き起こす。 最もよく知られた例はM.bovisによる人獣共通感染症の結核で、牛が主なレポジトリである。 M. bovis は、M. tuberculosis、M. africanum、M. caprae、および M. microti という種も含む「結核複合体」の一部です。

結核菌群には、ヒトでの感染にも関連する「非結核性マイコバクテリア (NTM) 」が含まれます。 NTMは土壌、水、植生、動物、乳製品、糞便など様々な環境中に存在し、吸入、摂取、皮膚からの侵入によって不用意に感染することがある。

メキシコの規格NOM-ZOO-031-1995は牛結核（bTB）の制御と撲滅のために牛におけるM. bovisの存在を規制するが、NTM種に関する規制は存在しない。 現場レベルでの M. bovis の存在による牛結核の公式診断は、精製タンパク質誘導体（ツベルクリン）を用いた皮内テストに基づいている。 数年前から使用されているが、この検査は感度、特異性ともに良好ではない。 結核を持つ動物の約20％は検査に反応せず、他のマイコバクテリア種（結核菌複合体とNTM種の両方）の存在が干渉を引き起こし、偽陽性や偽陰性の診断につながる。

メキシコには規制基準があるが、いくつかの地域では2％を超えるbTB流行が報告される。 ツベルクリン反応の特異度と感度が低いことから、実際の M. bovis の存在はもっと低く、他のマイコバクテリアによる牛の感染率はもっと高い可能性がある。 したがって、牧畜業者、獣医師、技術者、および畜産業に従事する従業員は、M. bovisおよびNTMによる感染に職業的に曝露される可能性がある。 現在，マイコバクテリアによる疾患の診断に最もよく用いられている分子生物学的手法は，M. bovis の診断に用いられる制限断片長多型（RFLP）であり，NTM の診断に用いられる制限断片長多型は，M. bovis の診断に用いられる制限断片長多型（RFLP）である。 tuberculosisの診断にはRFLP、M. bovisの診断にはスポリゴタイピング、そしてグラム陽性菌に特徴的な23S rRNA遺伝子上の高グアニン-シトシン（HGC）含量の100塩基対（bp）の「特異的挿入」を検出し、これがこのグループの分子マーカーとされ、続いて16S rRNAの配列解析により菌種レベルでの同定に用いられている 。

前述の手法で同定されたNTMの中には、表皮および深部皮膚病変を引き起こすM. balnei, M. marinum, M. platypoecilus、肺病変のM. kansasii、全身感染症のM. simiae、そして、M. scrofulaceum；肺炎、骨髄炎、腱鞘炎、リンパ節炎を伴うM. szulgai；皮下肉芽腫を伴うM. ulcerans； M. szulgaiを含むM. fortuitum and M. chelonae associated with vasculitis, endocarditis, osteomyelitis, mediastinitis, meningitis, keratitis and hepatitis; M. abscessus, associated with erythematous lesions that progressed to ulcerated nodules; and other species.

Mexico State of cattle in the state inventory for heads of Mexico in Mexicoは南部地区に集中している、経済活動は牧畜が主なものである、.Mo. fortsはMo.fortuitum and M. chelonaeと関連している。 メキシコの牛の管理に関する規則NOM-ZOO-031-1995は、M. bovisの診断のためのツベルクリン反応にのみ焦点を当てている。 この地域の牛にNTMが存在するかどうかは、ほとんど知られていない。 23S rRNA遺伝子上の100塩基対の分子マーカーの検出とそれに続く16S rRNA遺伝子の配列決定により、放線菌の種を特定できることを考えると、前述のNTM種を特定することが可能である。

本研究の目的は、メキシコ州南部地域の牛からNTM種を分離し、特定することであった。 鼻腔滲出液と牛乳からMycobacterium speciesを分離し、23S rRNA遺伝子の100塩基対分子マーカーの検出とその後の16S rRNA遺伝子の配列決定により同定した。 材料と方法

2.1. サンプリング

Zaragoza et al. 2015が実施したメキシコ州における牛結核陽性牛群の空間分布に基づいてサンプリングを実施した。 メキシコ州南部地域でテマスカルテペック市所属の1群、サカソナパン市所属の3群、計4群を選定した。 牛乳35検体、鼻腔滲出液68検体の計103検体が採取された。 各牛群で採取されたサンプルの数と種類の分布を表1に示す。

2.2. 乳汁と鼻汁のサンプル採取

乳房と乳首を精製水と石鹸で洗浄し、ペーパータオルで乾燥させ、その後70％アルコールに浸した綿棒を用いて乳首の無菌化を行った。 乳首から直接5ミリリットルのミルクを滅菌20mL容器に採取し、初流は廃棄した。 鼻腔滲出液は、10cm長の滅菌綿棒を使用して鼻孔の内側から直接採取し、等張食塩水（0.85%）に浸した。 ミルクと鼻腔滲出液のサンプルは、処理まで4℃で保存された

2.3. サンプルの処理

2.3.1. マイコバクテリアの単離

牛乳サンプルは2500 rpmで10分間遠心分離した。 牛乳および鼻腔滲出液サンプルのペレットを、マイコバクテリアに選択的な以下の培養液に接種した。 Stonebrink（BD BBL 220504）、Middlebrook（BD BBL 254521）、および1リットル当たり6gのピルビン酸ナトリウムを添加したMiddlebrook（BD BBL 254521）（Middlebrook-P）。 接種した培地は37℃で8週間培養し、3日ごとに評価した。

2.3.2. 分離株の分類

分離株は，コロニー色素，増殖時間，コロニー特性（形状，硬さ，質感，色素産生）によりグループ分けを行った． 分離株はZiehl-Neelsenで染色し、AFB（acid-fast bacilli）の存在を確認した.

2.4. DNA抽出

顕微鏡的にマイコバクテリアに類似した特徴を持つ株（酸菌陽性）と各グループの代表的な2株を選び、同定を行った。 バイオマスを得るために，125 mLフラスコに入れたMiddlebrook液体培地（BD BBL 254521）30 mLに菌株を植菌し，37℃で7日間培養した。 液体培地を滅菌済み15 mLファルコンチューブに移し、14,000 rpmで15分間遠心分離を行った。 その後、上清を除去し、ペレットを1.5 mLエッペンドルフチューブに移した。その後、14,000 rpm×5分遠心し、上清を廃棄した。 得られたペレットに対して、Wizard Genomic DNA Purification kit（Promega A1120）を用いてDNA抽出を行った

2.5. 23S rRNA遺伝子における分子マーカーの検出＜2876＞＜6061＞23S rRNA遺伝子上に位置する100bpの分子マーカーは、Rollerらによって記載された方法論に従って増幅された。 (1992)の方法論に従って、以下のプライマーを用いて増幅した：23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, および23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′

反応は、市販の Taq DNA polymerase (Promega M1661) を用いて実施された。 熱サイクル条件は次の通りである：5分間の前変性ステップ（94℃）；30秒間の変性（94℃），45秒間のハイブリダイゼーション（46℃），50秒間の伸長（72℃）を29サイクル；そして最後に5分間の後伸長サイクル（72℃）。 増幅された断片は、エチジウムブロマイド（SIGMA 46065）で染色した2％アガロースゲルで確認した。

2.6. 16S rRNA遺伝子の増幅

100bpの系統マーカーを増幅した株を選び、16S rRNAの塩基配列の解析を行った。 増幅には以下のプライマーを使用した：8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAGおよび1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

反応は市販のTaq DNA polymerase (Promega M1661)を用いて実施した。 次の熱サイクル条件を用いた：1回の前変性ステップを5分間（94℃）；30秒間の変性（94℃）、20秒間のハイブリダイゼーション（52℃）、1分30秒間の伸長（72℃）を34サイクル；そして最後に7分間の後伸長サイクル（72℃）。

増幅した断片はエチジウムブロミド（SIGMA 46065）で染色した1％のアガロースゲル上で確認された。 この増幅産物をAmicon Ultra Filter®キット（Millipore UFC901008）を用いて精製し、1%アガロースゲルで確認して、その存在と品質を確認した。

2.7. Mycobacterium Speciesの同定

16S rRNA遺伝子の増幅産物はMacrogen Sequencing Service, Maryland, USAに送付した。 得られた配列はBioEditプログラムを用いて解析、修正した。 順方向断片と逆方向断片からコンセンサス配列を構築し、BLASTプログラムとEzTaxon 2.1 .

2.8 を用いてNational Center for Biotechnology Information (NCBI) のGenBankに登録された配列と比較した。 系統解析

American Type Culture Collection (ATCC) と German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM) から以下の菌種について16S rRNA遺伝子の塩基配列を入手した。 M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , and M. confluentis . これらの菌株と今回分離した菌株の塩基配列を BioEdit でアラインメントした． 系統解析は，MEGA ソフトウェア Ver.4 を用いて，最大パーシモン法で行った． クラドグラムのルートにはPantoea agglomerans DSM 3493の塩基配列を用いた。 結果103検体から分離された108株は，マクロおよびミクロの形態的特徴により13グループに分類された（表2）． 特に11群，12群は酸菌の多いグループであった．

種レベルでの同定には39株が選ばれ、そのうち10株はグループ11、7株がグループ12に属していた。 残りの11群からそれぞれ2株を選び、39株を完成させた。 100 bpの分子マーカーは33％（13/39株）で検出された． これらの菌株については，16S rRNA遺伝子を増幅して塩基配列を決定し，菌種レベルの同定を行った．

収集した試料におけるNTMの有病率は，牛乳と鼻汁の両方を含めて12.6％（13/103）であった． 配列比較の結果，Mycobacterium属の4種のNTMが同定され，64％（6/13）の菌株がM. neoaurumと64%（6/13）が，M. parafortuitumと31%（4/13）が，M. moriokaenseと15%（2/13）が，そして最後に，M. confluentisと8%（1/13）が99%類似していた（表3）．

Mycobacterium属とその4種で系統樹を形成し、収集株と本調査で分離した株の系統関係を観察した(図1)。

4.考察

NTMは鼻腔滲出液のみから分離され，本研究の地元農場の1検体からは除外された（表1）． その結果，メキシコ州南部地域の牛群における特異的有病率は19.1％であった． 米国、南アフリカ、タンザニア、ブラジルにおける同様の研究では、NTMの有病率はそれぞれ3.4%、24.5%、7%、7.8%と報告されており、本研究で得られた有病率は、これまでに報告された範囲内にあると言える。 本研究では，39株中13株がNTMのM. neoaurum，M. moriokaense，M. confluentis，M. parafortuitumであると同定された． neoaurumはMycobacterium parafortuitum複合体の一員であり、幅広い疾患の原因となっている。その多くは、Hickmanカテーテル、BROVIACカテーテル、PICCライン、ポリテトラフルオロエチレングラフトを含む動静脈フィステル、ペースメーカー、人工心内膜炎などの器具関連感染症である 。 これらの器具を持つ免疫不全の患者が主な宿主で、例えば、がん患者、腎不全や心臓病を患う糖尿病患者などである。 また，尿路感染症，髄膜脳炎や中枢神経系の変化，菌血症や心内膜炎，肺感染症の患者からもM. neoaurumは分離されている． 主に臨床例から分離されるが，牛乳や牛からの分離も報告されている．

M. moriokaenseは喀痰から分離された． ヒトに対しては非病原性とされているが、肺疾患との関連が指摘されている。 M. confluentisも同様に喀痰から分離され，M. parafortuitumとともに非病原性菌とされた． M. confluentis，M. moriokaense，M. neoaurumは結核性病変を有する異なるウシおよび野生動物の組織から分離されているが，M. parafortuitumはウシの乳からのみ分離されている …． しかし，本研究では，M. parafortuitumは鼻腔滲出液からしか分離されなかった。

マイコバクテリアの栄養要求性は種によって異なり，これが異なる培地を使用する理由であった。 注目すべきは，本研究で同定された13株中，M. neoaurum，M. parafortuitum，M. moriokaenseなど7株がStonebrink培地で分離されたことである． この結果は，Stonebrink培地がMycobacterium属の異なる種の回収に適していることを示したSepúlvedaらによる報告と一致している． García-MartosおよびGarcía-Agudoは、Middlebrook培地が放線菌の分離に最適であると報告しており、M. neoaurumおよびM. parafortuitumの2種がこの培地で分離されたことから、この結果は本調査と合致している。 また，M. confluentisはピルビン酸ナトリウム添加Middlebrook培地でのみ分離された．このように，異なる培地を用いる戦略は，Mycobacterium属の異なる種の分離を可能にし，適切であった．

HGC含有グラム陽性細菌の23S rRNA遺伝子に存在する分子マーカーの検出により真正細菌株とマイコバクテリア株を識別することができた． また，16S rRNA遺伝子の塩基配列解析により，菌種レベルでの同定が可能となった。したがって，これらの手法を組み合わせてNTMの菌種を同定することが適切であると考えられる

5. 結論

本研究で述べた方法論を用いて、4種のNTMが分離・同定された。 M. confluentis、M. moriokaense、M. neoaurum、M. parafortuitumの4種を分離・同定した。 これらの菌種は，メキシコ州南部地域のウシの鼻腔滲出液から初めて分離された． 6899>

情報公開

この研究は、PNPC-CONACYTに登録された健康科学博士号（Universidad Autónoma del Estado de México）の論文に由来するものである。

利益相反

すべての著者は、利益相反がないことを宣言する。

謝辞

著者らは、以下の研究助成金を通じて、メキシコ自治大学研究・高等研究長官（UAEMex）からの財政支援に感謝したい。 (i)「マイコバクテリウム属の検出と同定におけるツールとしての地理情報システムと分子生物学の技術の実装」SIEA-UAEM 3486/2013CHT, (ii) the network “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud,” 039/2014RIF.

を通して以下の研究助成金を得たことに感謝する。