Molecular Cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering

対象遺伝子の開始と終了の概要を示す。 (A）tdTomato遺伝子の開始点および終了点のヌクレオチド配列を示す。 B）適切な制限酵素部位を含むフォワードプライマーとリバースプライマーのヌクレオチド配列、およびコザック配列を示す。 最適な制限酵素を選択するために、いくつかの基準を考慮する必要がある。 まず、制限酵素の結合部位は、理想的にはベクター内のマルチプルクローニングサイトで利用できることが望ましい。 あるいは、ベクター配列中のプロモーターの下流に配置することも可能である。 制限酵素はシングルカッターであることが望ましい（シングルカッターはDNA配列内の1つの制限部位のみをターゲットとする）（図2A）。 もし、ダブルカッターやマルチカッターであれば、ベクタープラスミドの正常な機能に必要のない配列内を切断し、最終的に除去されるはずである（図2B）。 また、プロモーターの下流でベクターを切断するダブルカッターまたはマルチプルカッター酵素を1つ選択することも可能であり、またプラスミドの重要な配列内でないことも可能である（図2C）。 ダブルカッター酵素やマルチプルカッター酵素は、それぞれDNA配列上に2つ以上の制限部位を持つ。 ダブルカッターやマルチカッターでベクターを切断すると、2つの同じ末端が生じることになる。 このような場合、インサートカセットもその両末端に同じ制限酵素部位を含むはずである。 したがって、ライゲーション実験でインサートとベクター断片を混合すると、インサートは正しい方向（開始コドンから停止コドンへ）または逆方向（停止コドンから開始コドンへ）のどちらかでベクターに融合することができる。 第3のシナリオは、ベクターフラグメントがインサートを全く含まないセルフライゲーションサークルを形成する場合である。 DNAを制限酵素とインキュベートした後、アルカリホスファターゼ酵素を用いてベクタープラスミドの5′と3′末端を脱リン酸化すれば、セルフライゲーションのリスクを大幅に減少させることができる。 したがって、断片ライゲーション後にこれら3つの産物（右向き、逆向き、自己ライゲーション）についてクローニング産物をスクリーニングすることが重要である。

PCR クローニングに定められた基準に基づいて適切な制限酵素の選定をする。 (A）2つのシングルカッター制限酵素（E1およびE2）がプロモーターの下流に位置する。 (B）E1、E2制限酵素はプロモーターの下流にあるプラスミドを数回（ここでは各酵素2回）切断する。 (C）E1制限酵素がプロモーター下流のプラスミドを1回以上切断する。 (D）tdTomato遺伝子と制限酵素部位を含むPCR産物を、下流への応用のために抽出する前にゲル上で実行した。

次に、粘着末端DNA断片を用いたより高いクローニング効率により、制限酵素の少なくとも一方（両方がよい）は、いわゆる粘着末端カッターであることが望まれる。 スティッキーエンドカッターは、DNAを非対称に切断し、相補的な凝集末端を生成する。 一方、鈍端切断酵素は、オーバーハングを残さず、対称的にDNAを切断する。 鈍端の断片をクローニングすることはより困難である。 しかし、インサートとベクターのモル比を高くし（5以上）、10%のポリエチレングリコール（PEG）を使用することで、鈍端断片のライゲーションを改善することができる。 大腸菌のほとんどの株は、DNA配列をメチル化するDamまたはDcmメチル化酵素を持っている。 そのため、メチル化感受性のある制限酵素に抵抗性がある。 ベクターDNAは大腸菌で調製されることが多いので、メチル化されていることになります。 しかし、メチル化感受性のある制限酵素のアイソシゾマーがメチル化に耐性を持つ場合がある。 例えば、Acc65Iはメチル化感受性であるが、そのアイソシゾマーであるkpnIはメチル化耐性である。 アイソシゾマーとは、同じヌクレオチド配列を認識する制限酵素のことである。 メチル化感受性制限酵素を用いる以外に方法がない場合、ベクターDNAはdam – dcm – E. coli株で調製することが必要である。 これらの菌株と、分子クローニングに用いられる一般的な大腸菌の宿主株の一覧を表1にまとめた。 制限酵素のメチル化感受性については、通常メーカーが情報を提供している

第四に、制限酵素を十分に機能させるためのバッファが同じであれば、二重制限消化ができるためクローニングが容易になることである。 これは時間の節約になり、精製時のDNAの損失も少なくなる。 また、一方の制限酵素がある緩衝液で活性を持ち、もう一方の制限酵素が同じ緩衝液の2倍の濃度で活性を持つということもあり得る。 例えば、Thermo Scientific社のNheI酵素はTango 1X buffer (Thermo Scientific社)で、EcoR1酵素はTango 2X buffer (Thermo Scientific社)で活性を発揮する。 このような場合、まずプラスミドDNAを、より高いバッファー濃度を必要とする酵素（ここではEcoR1）で消化する必要がある。 続いて、次の酵素（低濃度を必要とする酵素（ここではNheI））用のバッファーを、同じバッファーで希釈することになる。 しかし、ユニバーサルバッファーの出現により、DNA配列の二重消化が簡略化された。 この例では、ベクターはAgeIとSalIの制限部位を含んでいる。 これらの酵素部位はPCRプライマーの設計に使用された（図1）。 制限酵素による消化を適切に行うためには、プラスミドの純度を高くすることが不可欠である。 精製後の純度は、分光光度計で測定したDNAの吸光度を用いて決定することができる。 DNAは260 nm、タンパク質は280 nm、溶媒は230 nmで吸収される。 DNAの場合、OD260/280比が>1.8、OD260/230比が2〜2.2であれば純度とみなされる。 私たちの例示的なプラスミド調製物のOD 260/280および260/230比は、それぞれ1.89および2.22であった。 ゲル抽出したベクターやインサート DNA 断片は、制限酵素処理により純度が低下していることが確認され、そのような場合でもライゲーションは可能ですが、高純度の断片を使用することにより、より良い結果が期待できます。

各種ベクター（ウイルス発現・パッケージング、空バックボーン、蛍光タンパク質、誘導性ベクター、エピトープタグ、融合タンパク質、レポーター遺伝子、種特異的発現系、選択マーカー、プロモーター、shRNA発現、ゲノムエンジニアリング）の選択には以下のプラスミドリポジトリサイトが有用である：http://www.addgene.org/browse/.

大腸菌のクローニングベクター集は以下のサイトから入手可能：http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.1701>

Designing cloning primers based on defined criteria

PCRプライマーの設計は、GOIの開始コドン、停止コドンを確認すること。 フォワードプライマー（図3A）に、目的の制限酵素の配列（メーカーのホームページで入手可能）を探す。 GOIの前に位置する必要があります（図1B）。 いわゆる Kozak 配列は真核生物の mRNA に存在し、 翻訳の開始を向上させます。 真核生物では、Kozak配列（GCCACC）をATG開始コドンの前に付加することで、目的のタンパク質の翻訳と発現が増加するため、有益であるとされている。 そこで、制限酵素配列AgeIの直後で、ATG開始コドンの前にGCCACCを挿入した。 そして、ATG開始コドンから始まるGOIの最初の18〜30ヌクレオチドをフォワードプライマー配列に付加する。 この重なり合ったヌクレオチドが鋳型DNAに結合することで、アニーリング温度（Tm）が決定される。 後者は通常60℃より高い温度である。 ここでは、Phusion high-fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific)を使用する。 最適なTmの決定には、以下のサイトを利用できる：http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.

PCR クローニングに定められた基準に基づくプライマー設計をすること。 (A-B)フォワードプライマーとリバースプライマーの配列が描かれている。 コーディング鎖の末端はリバースプライマーの設計のために逆相補鎖の形式に変換される。 詳細は本文をご覧ください。

https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.

我々のフォワードプライマーのTmは66℃です。

あなたのGOIの停止コドンを含む最後の18〜30塩基をリバースプライマーの設計に選びます（図3B)。 この配列のTmは60℃以上で、forward primerのTmに近い値であることが望ましい。 私たちのリバースプライマーのオーバーラップ配列のTmは68℃であった。 次に、ストップコドンの直後に2番目の制限酵素サイト（この場合はSalI）の標的配列を追加する。 最後に、この組み立てた配列を逆相補配列に変換する。 リバースプライマーの配列は、以下のサイトを参考にすることができる：

http://reverse-complement.com/

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThisは、リバースプライマーがコーディング鎖と結合するため、その配列（5′→3′）がコーディング鎖の配列と逆相補的でなければならない（図1A）ので重要である。

Performing PCR using proofreading polymerases

PCR反応は標的配列の対数増幅に従うので、この過程の複製エラーはすべて増幅されることになる。 Taqポリメラーゼなどの非校正型DNAポリメラーゼのエラーレートは約8×10-6エラー/bp/PCRサイクルであるが、Phusionポリメラーゼなどの校正型酵素のエラーレートは4.4×10-7エラー/bp/PCRサイクルと報告されている。 その優れた忠実度と処理能力から、本実施例ではPhusion DNAポリメラーゼを使用した。 Phusionは、他のDNAポリメラーゼとは異なる温度要件を有していることに留意されたい。 PhusionのプライマーTmはBreslauer法に基づいて計算されており、Taqやpfuポリメラーゼを用いたTmより高い。 最適な結果を得るためには、酵素提供者のウェブサイトに記載されている情報に基づいてTmを計算する必要があります。 さらに、Phusionのスピードが速いため、通常、目的の配列の各kbを増幅するのに15〜30秒で十分である。

PCR後、産物はゲル上にロードする必要がある（図2D）。 対応するバンドを切断し、DNAを抽出する必要がある。 PCR産物には変異が含まれている可能性があるため、PCR産物の塩基配列を決定することが不可欠である。 いくつかのPCRクローニングキットが利用可能であり、そのいくつかを表2に示す。 我々は、pJET1.2/bluntクローニングベクター（Thermo Scientific、特許文献1）を使用した。 US 2009/0042249 A1, Genbank accession number EF694056.1）を用い、PCR産物を直鎖化したベクターにクローニングした。 このベクターには、ベクターが円形化した場合に活性化する致死遺伝子(eco47IR)が含まれている。 しかし、PCR産物を致死遺伝子内のクローニングサイトにクローニングすると、致死遺伝子は破壊され、形質転換時に細菌がコロニーを生育するようになる。 PCR産物を含まない円形化ベクターは毒性遺伝子を発現するため、細菌を死滅させ、コロニーの形成を妨げる。 その後、細菌クローンを培養し、プラスミドDNAを連続的に単離し、塩基配列を決定する。 単離したプラスミドの品質は、最適な塩基配列決定結果を得るために不可欠である。 plasmid mini-preparation kit (QIAGEN)を用いて、合計1.5 mlの培養菌からプラスミドDNAを分離した（収量6 μg DNA; OD 260/280 = 1.86; OD 260/230 = 2.17 ）。 PCR産物のシークエンスベクターへのクローニング、シークエンスベクターによる菌体へのトランスフェクションなど、PCRの全工程を1日で行うことが可能である。 翌日、細菌クローンを一晩培養してからシークエンスに回す。

Analysis of sequencing data

シークエンス企業は通常シークエンスデータをFASTAファイルで、さらにready nucleotide sequencesとしてメールで報告している。 配列の解析には、以下のサイトを利用できます：

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi ここでは、最初のサイトに焦点を当てます。 このウェブサイトのページで、”nucleotide blast “のオプションをクリックする（図4A）。 新しいウィンドウが開く。 デフォルトでは、”blastn”（ブラストヌクレオチド配列）オプションがマークされています（図4B）。 次に、”Align two or more sequences “の後ろのボックスにチェックを入れます。 これで2つのボックスが表示されます。 Enter Query Sequence” ボックス（上のボックス）には、PCRプライマー用に設計した制限部位に挟まれた目的の遺伝子の塩基配列を挿入する。 Enter Subject Sequence” ボックス（下のボックス）に、配列を入力するか、シーケンサから受け取った FASTA ファイルをアップロードする。 その後、ページ下部の “BLAST “ボタンをクリックします。 数秒後、別ページに結果が表示されます。 図4Cにアライメントデータの一部を示します。 解釈にあたっては、以下の点に注意する必要がある。 1) 同一ヌクレオチドの数（「Identities」項目に表示）が、目的の遺伝子のヌクレオチド数と同じであること。 この例では、tdTomato遺伝子のヌクレオチド数と制限酵素部位およびKozak配列のヌクレオチド数を合わせると、735個となる。 これは報告されている数と同じである（図4C）。 2) 配列の同一性（「同一性」の項目）は100%であることが望ましい。 配列の同一性は100％であるが、同一塩基の数が予想より少ない場合がある。 これは、最初のヌクレオチドが1つ以上欠落している場合に起こりうる。 すべての配列決定技術にはエラーレートがあることを忘れないでください。 サンガーシーケンスでは、このエラーレートは0.001%から1%の範囲であると報告されています。 ヌクレオチドの置換、欠失、挿入は、シークエンス結果を分析することで特定することができます。 したがって、配列の同一性が100%に達しない場合は、PCRのエラーと単純なシークエンスのエラーを区別するために、プラスミドを再シーケンスする必要がある。 3) ギャップ（「ギャップ」項目）は存在してはならない。 図4

NCBI BLASTプラットフォームによるPCR産物の塩基配列の解析。 (A) NCBI BLASTウェブページで、「nucleotide blast」オプションを選択する（楕円形の線で示す）。 (B) デフォルトで “blastn “オプションが表示される（丸印）。 Enter Query Sequence” と “Enter Subject Sequence” ボックスに、目的の遺伝子の配列（PCRプライマーにあらかじめ設計しておいた制限部位で挟まれている）とPCR産物を挿入する。 配列はFASTAファイルとしてアップロードすることも可能である。 (C) 最初の60塩基のヌクレオチドアライメントが表示されます。 配列解析に重要な2つの項目が楕円の線で示されている。

サンガー配列決定では1リードの平均長、すなわちリード長は少なくとも800から900ヌクレオチドである。 pJETベクターでは、完全な遺伝子をシーケンスするために、1つのforwardとreverse primerを使用する必要があります。 これらのプライマーは通常1800bpまでの遺伝子サイズをカバーすることができる。 もし、1800bpを超える場合は、800塩基ごとにプライマーを追加する必要がある。 また、塩基判定はプライマー直後ではなく、プライマーの45〜55塩基下流から始まるので、次のフォワードプライマーは遺伝子の始まりから約700塩基以降から設計する必要がある。 これらのプライマーを設計するために、以下を含む異なるウェブサイトを使用することができます：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design 長さが735 bpであるので、この例のPCR生成物のサイズはpJET配列決定プライマーの範囲に十分に収まっていました。

配列が確認されたクローンを選択した後、ベクターおよび挿入プラスミドをAgeIおよびSalI制限酵素により消化した（図5）。 その後、ゲル精製を行い、断片をライゲーションした。 ライゲーション混合物を用いてコンピテント大腸菌を形質転換すると、制限酵素でスクリーニングされたいくつかのクローンが得られた。 8つのクローンを評価したところ、すべてtdTomatoの挿入物を含んでいた（図6）。 大きいクローンを選ぶことが重要である。 サテライトクローンは正しいコンストラクトを持っていないかもしれない。 高速プラスミドミニ調製キット（Zymo Research社製）を用いて、0.6 mlの菌体懸濁液からプラスミドを抽出した。 収量および純度は、制限酵素ベースのスクリーニングに満足できるものであった（2.3 μg DNA; OD 260/280 = 1.82; OD 260/230 = 1.41）。 大規模なプラスミド精製のために、maxi-preparation kit（QIAGEN）を用いて450 mlの菌体培養からプラスミドを抽出した（収量787 μg DNA; OD 260/280 = 1.89; OD 260/230 = 2.22 ）。 1.5 mlおよび500 mlの細菌培養物からpBR322由来のプラスミドを分離した場合の予想収量は、それぞれ約2〜5μgおよび500〜4000μgのDNAである。

ベクトルと挿入プラスミド地図 A) PCR生成物を含むCloneJETプラスミドについて図解した図である。 プラスミドのクローニングサイトにPCR産物を挿入すると、毒性遺伝子eco47IRの完全性が破壊され、導入遺伝子陽性クローンの増殖が可能になる。 プラスミドをAgeIとSalI酵素で切断し、3kbと0.7kbの大きさの2つの断片を生成した。 0.7 kb の断片（tdTomato 遺伝子）をクローニングのための挿入物として使用した。 (B)ベクタープラスミドの説明図。 このプラスミドをAgeI酵素とSalI酵素で切断し、4.9 kbと0.7 kbの2つの断片を生成した。 4.9 kbの断片をクローニング用のベクターとして使用した。 AMP: Ampicillin resistance gene; PRE: posttranscriptional regulatory element; MPSV: myeloproliferative sarcoma virus promoter.

最終プラスミドを制限酵素でスクリーニングすること。 最終的なプラスミドの図解を示す。 スクリーニングのために、プラスミドをBsiwI酵素で切断し、4.8kbと0.8kbの大きさの2つの断片を生成した。 AMP: AMP: Ampicillin resistance gene; PRE: posttranscriptional regulatory element; MPSV: myeloproliferative sarcoma virus promoter.

プラスミドによっては、宿主細菌内で挿入、欠失、組換えなどを起こしやすくなっているものがあります。 このような場合、recA欠損大腸菌を使用することが有効である（表1）。 さらに、GOIが毒性を示す場合、低温（25〜30℃）で培養し、ABLE C株やABLE K株を使用することで問題を回避できる可能性がある。

ウイルスの生産と標的細胞の形質導入

クローニングした遺伝子のin vitro発現を調べるために、HEK293T細胞にtdTomato遺伝子、アルファレトロウイルスGag/Pol、および水疱口内炎ウイルス糖蛋白質（VSVG）エンベロープをコードするプラスミドをトランスフェクションさせた。 これらの細胞は、ヒト胚性腎臓に由来し、培養が容易で、トランスフェクションも容易に行える。 そのため、バイオテクノロジーや遺伝子治療において、ウイルス粒子の生成に広く利用されている。 HEK293T細胞は、1日おきに温めた培地を用いて分割する必要があります。 最適な結果を得るためには、100%コンフルエントにならないようにする必要があります。 良好なトランスフェクション効率を得るためには、これらの細胞を対数期にするために少なくとも1週間培養する必要がある。 24時間後の蛍光顕微鏡によるtdTomatoの発現から判断すると、トランスフェクション効率は22%であった（図7A-B）。 免疫療法研究のためにtdTomato遺伝子を発現するマウス白血病細胞株を生成するために、C1498白血病細胞を新鮮な採取したウイルスで形質転換した（形質転換36時間）。 トランスフェクションの4日後のイメージング研究（図7C）及びフローサイトメトリー分析（図7D）により、大部分の細胞でtdTomatoの発現が確認された。

クローニング遺伝子のインビトロ発現を評価すること。 (A, B) HEK293T細胞にGag/Pol, VSVG, tdTomatoプラスミドをトランスフェクションした。 tdTomato遺伝子の発現は、蛍光顕微鏡を用いて評価した。 蛍光画像は明視野画像と重ね合わせ、陽性導入細胞の識別を行った。 トランスフェクション効率は、24時間後のtdTomatoの発現量に基づいて決定した。 非トランスフェクションHEK293T細胞はコントロールとして使用した（青色ヒストグラム）。 (C, D) マウス白血病細胞株C1498に新鮮なウイルスを形質導入した。 4日後、トランスジーンの発現を蛍光顕微鏡（C）およびフローサイトメトリー（D）により評価した。 非導入C1498細胞はコントロールとして使用した（青色ヒストグラム）。 スケールバーは30μmを表す。

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