Isolation of Extended-Spectrum β-lactamase-(ESBL-) Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from Patients with Community-Onset Urinary Tract Infections in Jimma University Specialized Hospital, Southwest Ethiopia

Abstract

Background。 Klebsiella pneumoniaeとEscherichia coliは，複雑性尿路感染症の原因として分離されることが多くなった主要な広域β-ラクタマーゼ（ESBL）産生菌であり，セファロスポリンの治療失敗の原因として重要であり，感染管理に重大な影響を与える。 目的 2016 年、エチオピア南西部の Jimma University Specialized 病院における市中発症の尿路感染症からの ESBL 産生大腸菌および Klebsiella pneumoniae の有病率と抗生物質耐性パターンを評価すること。 方法論 病院ベースの横断研究を実施し、合計 342 件の尿サンプルを MacConkey 寒天で培養し、病因物質の検出を行った。 ESBL産生株の検出にはダブルディスクシナジー（DDS）法を使用した。 Mueller-Hinton寒天培地の中央にamoxicillin + clavulanic acid（20/10 μg）のディスクを置き，amoxicillin + clavulanic acidディスクから20 mm（中心から中心）の距離にcefotaxime（30 μg）およびceptazidime（30 μg）を配置し，amoxicillin + clavulanic acidディスクとcefotaximeディスクを比較した． アモキシシリン＋クラブラン酸に面した側のいずれかのセファロスポリンディスクの阻止域を増強し，ESBL産生菌と判定した。 結果 本研究では，尿中分離株の23％（n＝17）からESBL産生表現型が検出され，そのうちEscherichia coliは76.5％（n＝13），K. pneumoniaeは23.5％（n＝4）であった。 ESBL産生型はcefotaxime（100％），ceftriaxone（100％），ceftazidime（70.6％）に高い耐性を示し，ESBL産生型・非産生型ともにamikacin（9.5％）に低い耐性を示し，imipenemには耐性がなかった。 危険因子解析では，前年度に2回以上の抗生物質使用歴（オッズ比（OR），6.238；95％信頼区間（CI），1.257-30.957；p＝0.025）および過去6カ月間に2回以上または過去1年間に3回以上のUTI再発歴（OR, 7.356；95％ CI, 1.429-37.867；p＝0.017 ）とESBL産生群の関連性が有意であることが明らかとなった。 結論 尿路分離株からExtended-spectrum β-lactamases-（ESBL-）産生株が検出された。 ESBL産生菌では，第3世代セファロスポリン系薬剤，アミノ配糖体，フルオロキノロン系薬剤，トリメトプリム・スルファメトキサゾール，テトラサイクリンに対する多剤耐性の発現が多く認められた。 したがって，ESBL産生菌の検出と報告は，臨床的な意思決定において最も重要である

1. はじめに

あらゆる種類の薬剤耐性菌は、人や動物の間で、ある国から別の国へ、気づかないうちに移動していることがある。 21世紀以降，Extended-spectrum β-lactamase- (ESBL-) 産生菌の出現により，ヒトや動物に耐性株が伝播するリスクが高まっていると考えられる。 このような酵素産生菌による感染症は、罹患率や死亡率が高く、財政負担も大きいため、世界的な公衆衛生問題として憂慮されている。 この問題は、このテーマに関する研究、薬剤の入手、適切な使用が制限され、耐性率が高い発展途上国において明らかに深刻である。

ESBL 産生菌はペニシリン、広域セファロスポリン、モノバクタムを加水分解できるが、セファマイシンやカルバペネムは効かず、クラブラン酸でその活性が阻害される。 さらに、ESBL産生菌は、フルオロキノロン系、アミノ配糖体、トリメトプリム・スルファメトキサゾールなどの他の抗菌薬に対しても、染色体あるいはプラスミドにコードされた耐性機構により耐性を示すことが多い ……。 第三世代セファロスポリンの普及は、これらの酵素の変異を引き起こし、プラスミドにコードされたESBLsの出現につながる主要な原因であると考えられている。 これらのESBLsはプラスミドによって細菌間で伝達され、さらに患者の移動によって病院間や国間でクローン分布して広がった。

ESBLsの存在は、特に菌血症などの重症感染症患者において抗生物質の選択を複雑にしている。 その理由は、市中由来を含むESBL産生菌は様々な抗生物質に対して多剤耐性であることが多いからである。CTX-M（CTXはcefotaximases、MはMunichの略）を産生する分離株の興味深い特徴は、フルオロキノロン系薬に対するコアレジスタンスを有することである。 CTX-M型ESBLはceftazidimeよりもcefotaximeを優先的に加水分解する酵素であり，cefepimeも高効率で加水分解すると報告されている。

ESBL産生菌は途上国でより多く拡散し負担となっている。 最近のレビューによると、資源に乏しい環境における医療関連感染のプール有病率（15.5％）は、欧州の平均有病率（7.1％）の2倍であることが明らかになった。 この差の理由として、低所得国において一般的である、混雑した病院、より広範な自己治療と非処方抗菌薬の使用、一般的および特に病院におけるより悪い衛生、およびより効果的ではない感染制御などが考えられる。 また，ESBL産生菌だけでなく非ESBL産生菌も日常的に培養されておらず，抗生物質に対する耐性が検査できないため，抗生物質耐性の実態も明らかでない。 そこで本研究では，エチオピア南西部のJimma University Specialized Hospitalで市中発症のUTI患者から分離されたESBL産生菌Escherichia coliおよびKlebsiella pneumoniaeの陽性率と抗菌薬耐性パターンを明らかにした。 材料と方法

2.1. 研究地域と期間

本研究は、2016年3月から6月までジンマ町のジンマ大学専門病院（JUSH）で実施した。 Jimma大学専門病院はエチオピアの首都Addis Ababaの南西に位置し、現在、同国南西部では唯一の300床以上の教育病院である

2.2. 研究デザインと研究参加者

エチオピア南西部のJimma University Specialized Hospital（JUSH）において、市中発症の尿路感染症におけるESBL産生大腸菌と肺炎球菌の陽性率と抗菌薬耐性パターンを評価するために横断研究を実施した。 年齢15歳以上で，入院後48時間以内に臨床診断により尿路感染症の症状が疑われた外来患者および尿検査診断のために外来を受診した患者を研究参加者とした。 データ収集前に患者または患者の保護者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 UTIの症状が疑われる患者については，医師が検査依頼書に「UTI」と記載し，臨床診断でUTIが疑われ尿検査を依頼された患者の識別番号として医師と連絡を取りながら識別した． 過去2週間以内に抗生物質を投与された患者は除外した

2.3. 定義

Community-onset infectionsは、入院後48時間以内に発症した感染症、または外来で発症した感染症と定義した。 このような感染症は2つのグループに分けることができる。 第一のグループは医療機関に関連するもので、点滴治療や特殊な治療を受けている患者、血液透析治療や抗悪性腫瘍化学療法を受けている患者、過去30日以内に病院の診療所に通院した患者、過去90日以内に急性期病院に2日入院した患者、老人ホームや長期介護施設の居住者が含まれる。 第二のグループは、上記の基準を満たさない患者における真の市中感染症である

2.4. データ収集＜4162＞＜1465＞2.4.1. 社会人口統計学的および臨床データ

年齢、性別、年間2サイクル以上の抗生物質の使用歴、過去30日間に自宅またはいずれかの診療所での点滴治療歴、病院での外来受診の繰り返し、90日間に急性期病院での入院歴2日以上などの社会人口統計および他の臨床データ。 尿路の侵襲的処置の経験、30日以内に専門看護師または家族による創傷治療の経験、糖尿病の有無、再発性尿路感染症について、検査項目採取前に患者またはその保護者に、十分に構成された質問票を用いて対面面接により収集した。

2.4.2. 実験室データ収集

合計342の中流尿サンプルを、無菌で口の広い、漏れのない容器で採取した。 よく混和した10 µl (0.01 ml) の尿サンプルをMacConkey agar (Oxoid, UK) に接種し、37℃で24時間培養を行った。 中流域の単回尿のコロニー数が105 CFU/ml以上を陽性尿培養とした． 分離された菌は，コロニー形態，色素産生（ピンクから無色の扁平または粘液状のコロニー），グラム染色法（グラム陰性桿菌，ノンスポーリング，ノンカプセル）により予備的なスクリーニングを行った． 分離菌の同定は、運動性などの生化学的検査により行われた。 例えば、インドール（濃いピンクのリング）とメチルレッド陽性、クエン酸陰性（変化なしまたは緑色のまま）と尿素陰性、ガスと酸の産生、運動性のものを大腸菌とし、インドールとメチルレッド陰性、クエン酸陽性、尿素遅発、非運動性のものをK. pneumoniaeと判定した。 また，分離が遅れた場合は，抗菌薬感受性試験を行うまで，栄養ブロス中で2〜8℃，24時間以内に保存した

2.5. ESBL検出法

ESBL産生大腸菌および肺炎球菌は、まず表現型法でスクリーニングし、Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines 2014に従って表現型確認試験で確認する。

2.5.1. ESBL産生の表現型スクリーニング

ESBLスクリーニング試験は、セフタジジム（30μg）、セフォタキシム（30μg）、セフトリアキソン（30μg）（Oxoid、英国）を用いて標準ディスク拡散法により実施した。 CLSIガイドライン2014で推奨されているESBLs検出感度を向上させるために，スクリーニングには複数の抗生物質ディスクを使用した． 生育したコロニーを通常生理食塩水に懸濁し，懸濁液の濁度を0.5マクファーランド標準に調整した。 この懸濁液を滅菌綿棒を用いてMueller-Hinton寒天培地（Oxoid, UK）に接種し，上記3種類の抗生物質ディスクをすべて20 mmの間隔で配置し，35±2℃で16～18時間培養を行った。 ディスクの周囲でcefotaxime（ゾーン径≦27 mm）、ceftazidime（ゾーン径≦22 mm）、ceftriaxone（ゾーン径≦25 mm）に対して感受性が低下した分離株をESBLs産生菌と疑った .

2.5.2. ESBLs産生菌の表現型確認

CLSIガイドライン2014で推奨されているMueller-Hinton寒天を用いたダブルディスク近似法またはダブルディスクシナジー（DDS）法により、ESBLs産生菌の疑いのある菌の確認を行った 。 Mueller-Hinton寒天培地の中央にアモキシシリン＋クラブラン酸（20/10 µg）のディスクを置き，次にセフォタキシム（30 µg）およびセフタジジム（30 µg）を同じプレート上のアモキシシリン＋クラブラン酸ディスクから20 mm（中心から中心）の距離で配置した。 このプレートを37℃で24時間培養し，amoxicillin-clavulanateディスクのclavulanateとの相乗効果によるoximino-β-lactamの阻害域の増強・拡大を検討し，ESBL産生陽性と判定した

2.6.1. 抗菌薬感受性試験

以下の抗菌薬ディスクについて、CLSIガイドライン2014に従い、ミューラーヒントン寒天培地でカービーバウアーディスク拡散法を用いて抗菌薬感受性試験を実施した。 アモキシシリン／クラブラン酸（20／10μg）、セフォタキシム（30μg）、セフトリアキソン（30μg）、セフタジジム（30μg）、アンピシリン（10μg）、セファロスチン（30μg）。 シプロフロキサシン（5μg）、ナリジクス酸（30μg）、ノルフロキサシン（10μg）、ゲンタマイシン（10μg）、アミカシン（30μg）、テトラサイクリン（30μg）、トリメトプリム・サルファメトキサゾル（1.25/23.75μg）、イミペネム（30μg）、クロラムフェニコール（30μg）（Oxoid; UK）である。 抗菌剤の選択は、入手可能性とCLSI 2014の勧告に依存する。 ミューラーヒントン寒天培地プレートに抗菌ディスクを入れて37℃で一晩培養後、定規を用いて阻止帯を測定し、カービーバウアーチャートと比較することで解釈した。 対照株（K. pneumoniae ATCC 700603およびEscherichia coli ATCC 25922）は、抗菌薬感受性試験中およびESBL検出法中の抗生物質ディスクの品質を監視するために使用された

多剤耐性（MDR）は3種類以上の抗生物質に耐性と定義されています。 データ分析

データはSPSSバージョン16.0を使用して分析した。 ESBL産生群と非産生群のカテゴリー変数と感受性パターンの差はカイ二乗（フィッシャーの正確さ）検定を用いて統計学的に解析した。 オッズ比（OR）とその95％信頼区間（CI）を算出し，＜4668＞0.05を統計的に有意とみなした。 結果は表で示した

3. 結果

3.1. 臨床検体と回収された分離菌

今回、尿培養陽性と確認された検体は約74（21.6%）で、そのうち63（85.1%）は大腸菌、11（14.9%）は肺炎桿菌であった。 尿培養陽性74例のうち，17例（23.0％）がESBL産生陽性であることが確認された。 大腸菌は，K. pneumoniae（4株，23.5％）よりも多く分離され，ESBL産生率も13（76.5％）であった。 また，男性（5株，29.4％）よりも女性（12株，70.6％）からの分離が多く，ESBL産生株の割合が高かった。 ESBL産生菌が検出された患者の平均年齢は35.07歳（±13.30 SD）であった。 ESBL産生菌のうち9株（52.9%）が50歳以上の患者から分離されました（表1）。

3.3. ESBL産生株と非産生株の耐性プロファイル

今回の研究では、ESBL産生株は第三世代セファロスポリン系だけでなく、試験した他の抗菌薬に対しても高い耐性を示した（p = 0.001）。 セフォタキシム，セフトリアキソン，セフタジジムに対する耐性率は，それぞれ100％，100％，70.6％であった。 ESBL産生株と非産生株はいずれもアンピシリンに耐性を示した（表3）。

表3

3.4. 医療関連株と市中感染株の耐性プロファイル

本研究の結果、医療関連感染歴のある患者からの分離株と純粋な市中感染からの分離株は、試験したほとんどの抗菌薬に対して耐性プロファイルに差がなかった（）（Table 4）。

表4

3.5. E. coliとK. pneumoniaeの多剤耐性パターン

本研究では，ESBL産生株では多剤耐性（≧3抗生物質クラス）パターンがより多く見られた． ESBL産生菌の82.4％はco-trimoxazoleとtetracyclineに交差耐性を示し，tetracycline，fluoroquinolones，co-trimoxazole，aminoglycoside，chloramphenicolに加えβ-lactam系の薬剤に52.9％が耐性を有していた。 ESBL表現型と非βラクタム系抗菌薬5種類，6種類，7種類の共存率は，それぞれ11（64.7％），9（51.9％），4（23.5％）であった（表5）。

4.考察

最近まで、ESBL産生菌は院内感染または医療関連病原体とみなされていた。 病院やその他の医療施設に通常入院していた患者に影響を与えるものと考えられていた。 しかし近年，ESBL産生腸内細菌科細菌は病院から市中へと移行し，また医療機関との接触がない市中患者からも検出されるようになってきた。 一方，本研究で認められたESBL産生者の割合は，サウジアラビア（42.38％）およびタンザニア（45.2％）の既報と比較して低値であった． その理由は，外来患者からの単回検体のみを対象としたためと考えられた。 また，ESBL産生菌の維持には病院内の環境が大きく関与していることが示唆された． さらに，サウジアラビアの他の地域でも入院患者の糞便中ESBL産生率が高いことから，病院から分離された菌はESBL産生菌となる可能性が高いと考えられた。

本研究ではESBLタイピングや菌種同定のための最新の分子手法は行わなかったが，尿中分離株は大腸菌が多く，ESBL産生数も肺炎桿菌23.5％に比べ76.5％多く占めている． この結果は，同地域で行われた先行研究（外来患者からのESBL産生菌4種のうち3種（75％）が大腸菌であった）と相関していた。 イスラエルで行われた別の研究でも、外来患者からのESBL産生株は大腸菌（57.8％）がより高い陽性率を示した。

ESBLの増加を説明する地域由来の要因は多くの調査で観察されているが、我々の環境では直接または間接的に病院での曝露のないヒトの糞便コロニー調査数が少なく、正確に確認することは困難である。 したがって，腸管は抗生物質耐性の発現や耐性菌の出現に重要な役割を果たしており，脆弱な患者においてはその後の尿路感染症の原因菌となる可能性がある． カメルーンでの最近の報告では、ESBLs産生菌の糞便担持率は16％で、その大部分（80％以上）は大腸菌であった。またサウジアラビアでは12.7％がESBLs産生菌で、そのうち95.6％は大腸菌、4.4％は肺炎桿菌（KPMG）が分離された。 したがって，市中感染型尿路結石で入院した患者では，治療を開始する前にESBL産生菌のリスク要因を考慮する必要がある。

本研究では，ESBL産生菌は医療機関との接触歴がない人（市中感染型）からの分離が52.9％と多く，大腸菌が61.5％と高率であった。 この結果は，ESBL産生大腸菌の64％が市中感染，36％が医療関連尿路結石であったスイスでの既報や，68％が市中感染，32％が医療関連結石であったスペインでの報告と一致した。 本研究では，前年度に2回以上の抗生物質使用（OR = 6.238; 95% CI = 1.257-30.957）および過去6カ月間に2回以上，または過去1年間に3回以上のUTI再発（OR = 7.356; 95% CI = 1.429-37.867; ）はESBL産生菌の発現または獲得に関する独立危険因子として特定された。 この結果は、イスラエルでの先行研究とも相関している。 本研究では，ESBL産生菌の82.4％がSXTやテトラサイクリンなどの異なる抗生物質ファミリーに対する多剤耐性を示した． この結果は，タンザニアやギニアビサウのような発展途上国における他の研究とも関連しており，地域社会におけるほぼすべてのESBL産生大腸菌が多剤耐性であった。

これらの菌株の多剤耐性は、ESBLがプラスミドを介した酵素であり、プラスミド、トランスポゾン、インテグロンによって多剤耐性遺伝子を持ち、また同種でなくても他の細菌に容易に移行すること、多剤耐性の細菌が病院に広く分布し、地域からもますます分離されていることで説明できるかもしれない。 この事実は，カナダやスペインで行われた最近の調査でも，市中からのESBL産生菌，特にCTX-M型産生菌がSXT，テトラサイクリン，ゲンタマイシン，シプロフロキサシンにコアレス性を示すという驚くべき傾向を示している． また，ESBL産生菌は第3世代セファロスポリン系抗生物質のみならず，他の非β-ラクタム系抗生物質に対しても高い耐性を示すことが示唆された． このことは，β-ラクタマーゼ陰性株が他の機序でアンピシリンに耐性を示す可能性があることと相関していた。 一方，amikacinには高い感受性が認められ，imipenemには耐性が認められなかった。 本地域の先行研究でも，amikacinに対する感受性の高さが指摘されていた。 本研究では耐性株のMIC測定は行わなかったが，医療機関感染症と市中感染症の耐性パターンを比較検討した結果，両者の耐性パターンに差は認められなかった（図1）。 医療機関に関連する感染症由来株と真の市中感染症由来株の耐性パターンが類似していることは、地域社会や医療機関、特に民間医療機関において、処方されていない抗生物質が頻繁に使用・誤用され、耐性株が医療機関から地域社会に時折拡散することに関連していると思われる。 したがって、この知見は、医療環境および地域社会における抗生物質の合理的な使用を促進するために、医療政策立案者の注意を喚起するものである

5. 結論＜3046＞＜7244＞本研究で得られたデータは，ESBL陽性の表現型が病院や他の医療施設に通常入院していた患者だけでなく，地域住民の患者にも広く見られたことを示している。 また，アミノ配糖体，フルオロキノロン，コトリモキサゾール，テトラサイクリンなど他のクラスの抗菌薬に対する耐性もESBLs陽性表現型に多くみられた。 ESBL産生菌獲得の独立した危険因子として，前年度に2回以上の抗生物質使用と尿路結石の再発が同定された． このことから，医療現場における抗生物質の適正使用の推進と，耐性パターンの変化を監視するためのサーベイランス調査に注目する必要がある． 研究の限界

種の同定やESBLタイピングの特徴づけ、耐性株のMIC決定などの高度な分子手法は利用できないため実施しなかった

データの利用

我々の知見を裏付けるデータはすべて原稿内に取り込んだ。 7458>

Ethical Approval

倫理的承認はJimma University Institutional Review Boardから得た

Consent

研究情報は研究参加者に対して現地語で提供された。 研究参加者全員から、実験データを収集する前に、研究の目的について説明し、書面によるインフォームド・コンセントを得た。 7458＞＜4339＞利益相反＜3046＞＜7244＞著者らは利益相反がないことを宣言した。＜7458＞＜4339＞著者らの貢献＜3046＞＜7244＞MA、GT、AAが研究計画に参加、検査分析を担当し、原稿を書き、最終版を承認した。 7458>

謝辞

Jimma University, Institute of Healthの物質的支援に感謝したい。 また、本研究に参加してくれたすべての研究参加者、検体採取や患者情報の提供を円滑に行うためにサポートしてくれたJUSHのスタッフに感謝する

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