Is Anti-Hepatitis C Virus Antibody Level an Appropriate Marker to Preclude the Need of Supplemental Testing?

Abstract

Objectives: 本研究では，抗HCV反応性検体のS/Co比が，我々の研究集団において追加検査の必要性を回避するための基準として使用できるかどうかを明らかにすることを目的とした． 方法 中国の8施設から得られた901例の抗HCV陽性血清の分析を行った。 抗HCV抗体検出のスクリーニングアッセイとして，Ortho VITROS抗HCVアッセイとMonolisa Plus抗HCV version 2を使用した． 確認されたHCV感染状態を検証するために，組換え免疫ブロット法（RIBA）およびHCV RNAの定量試験を実施した． 結果 Receiver operating characteristic curve解析により，S/Co比≦3.0の真陽性サンプルの41.5％（114/275）が見逃され，RT-PCRとRIBAをそれぞれ補助検査として用いた場合，陰性的中率は63.9％と87.06％であることが示された． RT-PCRのみでは，RIBAで陽性と判定された者の29.8％（90/302）が見逃された。 結論 化学発光免疫測定法による超低抗HCV値（S/Co ≤3.0）は，我々の研究集団において補足検査の必要性を排除する適切なマーカーではないと判断された． HCV抗原を用いた二次抗体測定法を追加検査法として採用するスクリーニング戦略をさらに検討する必要がある． 補足検査法としてのイムノブロットアッセイは、依然として必要である。

© 2016 S. Karger AG, Basel

はじめに

Hepatitis C virus (HCV) is the causative agent of the contagious liver disease hepatitis C. The virus can cause acute and chronic liveritis infection, thus present an enormous health burden. C型肝炎の慢性感染者の多くは、肝硬変や肝細胞がんを発症するリスクが高く、深刻な死亡率や罹患率をもたらしています。 抗HCV抗体の検出には、酵素免疫測定法と化学発光免疫測定法（CIA）の2つのスクリーニング免疫測定法が主に用いられています。 CIAは酵素免疫測定法に比べて特異性が高いが、偽陽性を示すことがある。 したがって、これらのスクリーニングアッセイの特異性は、補助的なアッセイを使用して検証することが重要です。 抗HCVスクリーニング検査が陽性であることを確認するために、遺伝子組み換えイムノブロット法（RIBA）またはHCV RNAポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が推奨されています。 2013年、RIBAの廃止に伴い、米国疾病対策予防センター（CDC）は、最初の抗HCVスクリーニング検査で陽性結果が出た場合は、HCV RNAの検出のための核酸検査（NAT）のみを行うことを推奨しています。 Vermeerschらによって発表されたアルゴリズムによると、抗HCVスクリーニングの第二ラウンドは、確認のための代替の補足的な検査方法を提供する。

CDCによって発表されたガイドラインは、抗HCV濃度に対するシグナル対カットオフ（S/Co）比のレベルを2003年に抗HCV検査に関する検査室アルゴリズムに組み込んだ。 VITROS抗HCVアッセイ（Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, N.J., USA）によるS/Co比≧8.0の試料は、抗HCV抗体陽性と見なされる。 これまでの研究で、受信者動作特性（ROC）曲線解析により、抗HCV検査に適したS/Co比を予測すると、<3.0または4.5という非常に低い抗HCV S/Co 比は高い診断感度と陰性的中率（NPV）と関連し、HCV感染のリスクがないため追加の検査は必要ないことを示しています。 しかし、Ortho VITROS抗HCVアッセイで測定された高い抗HCV S/Co比≧20.0は、ウイルス血症の正確な血清マーカーであった 。 これらの研究では、抗HCV値が高いサンプルは、さらにHCV RNA検査によってウイルス血症の状態を評価した。 このような戦略では，抗HCV濃度の指標として抗HCV S/Co比を用いることで，補足的な検査を必要とする人の数をある程度抑えることができる。

したがって，本研究の目的は，反応性検体のS/Co比が補足検査の必要性を回避する根拠として使用できるか，また二次抗HCV検査がHCV検出の補足または確認に代わる選択肢となるかどうかを調べることであった． また、HCV RNAの結果が陰性である場合、最初のスクリーニングアッセイで得られた抗HCVの偽陽性結果にRIBAが対処できるかどうかを評価した。

材料と方法

倫理声明

本研究は、患者の残余試料を使用したものであった。 国立臨床検査センター倫理委員会の承認を得て、ヘルシンキ宣言の理念を遵守し、これらの患者試料を使用した。 なお、本研究では詳細な患者情報を収集する必要がなく、匿名でのデータ解析が行われたため、参加者から書面によるインフォームドコンセントは得られていない。

サンプル

本研究で使用した患者血清サンプルは、中国の寧夏医科大学総合病院、北京大学人民病院、南京軍区司令部福州総合病院、上海瑞金病院、上東省病院、南京軍区総合病院、青島大学医学院付属東病院、福建血液センターから収集されたものです。 すべての血清試料は，VITROS ECi CIA（Ortho Clinical Diagnostics）を用いてHCVに対する抗体の存在を評価した． S/Co比は自動化装置から直接記録された。 S/Co比が1.0以上の試料は、製造者の推奨に基づいて反応性と定義された。

スクリーニング検査

National Center for Clinical Laboratoriesに出荷された血清サンプルは、まずVITROS ECi CIAを用いて再検査されました。 VITROS ECi CIAで陰性であった血清は、CDCガイドラインに従って、抗HCV陰性とみなされた。 その後，血清はMonolisa Plus anti-HCV version 2（Monolisa Plus; Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France）で検査し，製造元の指示に従ってS/Co比が1.0以上の検体を反応性とみなした． これら2つのスクリーニングアッセイは異なるメーカーの抗原を使用している。

確認アッセイ

ECi CIAの結果が陽性（S/Co比≧1）のすべての血清試料について，確認試験としてRoche COBAS AmpliPrep/COBASTaqMan HCV Test（Roche Diagnostics, Branchburg, N.J., USA）を使用して定量HCV NATが実施された。 定量的HCV NATの感度（検出下限値）は15 IU HCV RNA/mlであった． 検査と結果の解釈は製造元の説明書に従って行われた． 第3世代のRIBA（RIBA HCV 3.0; Ortho Clinical Diagnostics）を用いて，HCV組み換えタンパク質C100（NS4），C33c（NS3），C22p（コア），NS5を検出し，検体の状態を把握した． 結果は、製造元の推奨に従って解釈されました。 2本以上のバンドが反応した場合は陽性、1本しか反応しなかった場合は不確定、反応しなかった場合は陰性とした。

定義と統計解析

HCV RNAが陽性の個人はウイルス血症とみなされた。 RIBAの結果が陽性でHCV RNAが陰性のサンプルは、真の抗体陽性、非ウイルス血症と記録された。 抗HCVスクリーニング検査で反応性があるがHCV RNAが陰性でRIBAの結果が陰性または不確定なサンプルは偽陽性と分類した。

ROC カーブは、HCV RNAと第3世代のRIBAテストをそれぞれゴールドスタンダードとして、感度対1-特異度をプロットして作成した。 S/Co比が3.0，8.0，20.0のときのHCVウイルス血症とRIBA状態を予測する診断感度，診断特異度，陽性適中率（PPV），NPV，それぞれの正確な95％CIを既出の方法に従い決定した． 最適なS/Co比は、ROC曲線と関連データの分析から同定された。 ROC解析にはGraphpad Prism 6を用いた。

結果

合計1,017検体を国立臨床検査センターに発送し、CIAをスクリーニングアッセイとして抗HCV抗体の再検査を行った結果、901検体が反応（S/Co ≥1）であった。 すべての反応性検体（S/Co≧1）に対して，定量的HCV NAT検査および第3世代RIBAによる検査も実施した． HCV RNA検査結果が＜3196＞15 IU/ml（定量可能な線形範囲以下）であった検体は、RIBAの結果、35.8％（63/176）が＜3196＞15 IU/mlのHCV RNA検出値を示し、RIBA陽性となったことから「HCV RNA反応性」と判定されました。 この901検体のうち、13検体は検体量不足のためHCV RNA検査が実施されなかったが、586検体（65.0%）および302検体（33.5%）でそれぞれHCV RNA陽性および陰性の確認結果が得られている。 さらに、901検体中、RIBA追加検査により、577検体（64.0%）、126検体（14.0%）、198検体（22.0%）が陽性、陰性、不定と判定された。 表1に示すように、HCV RNA陽性586検体のうち483検体（82.4%）がRIBAで陽性となり、HCV RNA陰性302検体のうち90検体（29.8%）がRIBAで陽性と判定された。 6356>

PCRテストのROCカーブを解析して抗HCV抗体検出のCIA結果に基づいたカットオフレベルを決定した． PCRテストのROC曲線（図1）および関連する診断感度、診断特異度、PPVに基づき、先行研究で示されたように、S/Co比20.0は最適ではないと判断された 。 HCV RNAの診断感度，診断特異度，PPV，NPVはそれぞれ63.82，88.89，91.67，56.20％であった（表2）． また，S/Co比3.0および8.0におけるHCV viremiaの予測に対する診断感度，診断特異度，PPV，NPVおよびそれぞれの95%CIを求めた（表2）． HCV曝露診断のために，CIAの結果に基づく異なるカットオフ値に対するRIBAテストのROCカーブを解析した． RIBAのROC曲線（図2）と関連データから、S/Co比20.0は、RIBAによるHCV抗体確認の診断感度、診断特異度、PPV、NPVがそれぞれ69.84, 97.84, 97.75, 70.75%に相当することがわかった(table 3)。 表2および表3から、スクリーニングされた抗HCV陽性検体のS/Co比が20以上であれば、8.0などの他のS/Co比と比較して、ウイルス血症とHCV曝露の識別がより良好であることが示される。

S/Co比3.0と8.0での異なるカットオフ値に対するHCV曝露予測における診断感度、診断特異度、PPV、およびNPV、ならびにそれぞれの95％CIは、表3に示すとおりである。 real-time PCR（RT-PCR）（図1）とRIBA（図2）の両方のROC曲線から、S/Co比3.0は診断感度100％を提供する最高値ではないことが確認された。 表1に示すように、S/Co比が<3.0の275人中99人（36％）がウイルス血症の被験者であり、15人がウイルス血症のないHCV曝露を示すことが明らかになった。 また，S/Co比が<3.0であっても，HCV viremiaとHCV exposureの両方が陰性とは限らないことが示された．

S/Co 比 20.0 は先行研究では最適カットオフとされていないが，本研究では S/Co 比≥20.0 は高抗体と分類された． S/Co ratioが3.0から19.99の試料は低レベルとした。 S/Co比が1.0から2.99の超低抗体については、HCV感染のリスクがないことを示す過去の研究に基づいて選択した。 901検体中、411検体（45.62％）、213検体（23.64％）、277検体（30.74％）にこの3種類の抗体が認められました（図3）。 サンプル量不足のためHCV RNA検査を実施しなかった13検体を除き、高抗体濃度の検体では91.4%（374/409）、低抗体濃度の検体では55.4%（113/204）、超低抗体濃度の検体では36.0%（99/275）でHCVウイルス血が確認された（fig. 4）。 抗HCV抗体価が高いサンプル（S/Co比≧20.0；91.4%）と抗体価が低いグループおよび非常に低いグループ（S/Co比1.0〜19.99；44.3%；p < 0.001，χ2 test）ではウイルス複製頻度に有意差がみられた． 本研究では，ウイルス血症のある586人が，ウイルス血症のない血清学的にHCVが確認された人（90サンプル）よりも高い抗体レベル（平均S/Co比: 19.23, 95% CI: 18.4-20.1, p < 0.05) を示した． また，ウイルス血症を伴わないC型肝炎の偽陽性と定義され，RIBAの結果が陰性または不確定であった212検体では，平均S/Co比2.94（95％CI：2.51-3.37）が認められた

HCV RNA検査を実施したCIA陽性血清888例（S/Co ≥1）のMonolisa Plus検査結果を表4に示します。 RT-PCRおよびRIBAによる確認と比較して，モノリサ・プラス検査の感度と特異度はそれぞれ81.8％と85.8％であった． PPVおよびNPVはそれぞれ94.85および59.67%であった． 血清学的にHCVが確認され，かつウイルス血症を伴わない90検体において，モノリサ・プラスを補助検査として用いた場合，16検体（17.8%）で見逃しがあった． RIBAが陰性または不確定でウイルス血症のないC型肝炎が偽陽性と定義された212名において，モノリサ・プラス検査で抗HCV抗体が偽陽性と検出されたのは31検体（14.6%）であった．

考察

我々の研究ではS/Co比<3という極めて低い抗HCV抗体レベルが示されることになった。0は、VITROS抗HCVアッセイによって決定されるが、抗HCV偽陽性を識別しなかった。したがって、このグループは、補足検査の必要性を防止できる正確なマーカーとは言えない。 S/Co比が>20の場合、真陽性の検出率が高いため、RIBAまたは二次HCV抗体測定による抗HCV確認検査は必要ない（PPV：97.75%）

Lai らは、PCRまたはRIBAをゴールドスタンダードとして、VITROS抗HCV測定法によるS/Co比3.0が診断感度100%とNPV 100%の関連最高値となったと報告している。 S/Co比が<3.0の検体では，RIBAおよびPCR検査で陽性となるものはなかった． したがって，S/Co比<3.0の患者検体については，補足的な検査は必要ないことが示唆された． 同様に，ContrerasらとOethingerらも，非常に低いC型肝炎抗体レベルは偽陽性であることを示し，そのため補足的な検査を避けることができた． これらの研究でC型肝炎抗体レベルが非常に低い検体は、S/Co比がそれぞれ4.5と5.0と指定された。 本研究では，ウイルス血症がなく，RIBAの結果が陰性または不確定なC型肝炎の偽陽性者（n＝212）の平均S/Co比は，2.94（95％CI：2.51-3.37）であった． しかし、CIA対RT-PCR（図2）およびCIA対RIBA（図3）のROC曲線は、PCRまたはRIBAをゴールドスタンダードとして用いた場合、S/Co比3.0は診断感度またはNPV100%とは関連しないことを示している。 我々の集団では、カットオフS/Co比3.0は、S/Co ≦3.0 (table 1) のCIA陽性サンプルの41.5% (114/275) を、RNA陽性 (n = 99) またはRIBA陽性 (n = 15) で検出できないことになる。 したがって、抗HCV抗体価が非常に低く、CIAによるS/Co比が≦3である患者については、依然として補足的な検査が必要であることを推奨する。 また，以前の研究では，S/Co比＜3196＞20.0では1.8％しかウイルス感染していなかったが，同じS/Co比の検体では23.9％（212/888）がウイルスに感染していることが示された． したがって，抗体価が低い検体を含むすべての検体に対してHCV RNA検査による補足検査を実施することは，費用対効果が低い（表5）．

興味深いことに、本研究のROC曲線分析では、先行研究で示唆されているようにS/Co比20.0は最適なカットオフではないことが示されている 。 この知見の違いは，以下の3つの理由に起因すると考えられる。 第一に、先行研究では、RT-PCR検査で陽性と判定された検体はすべてRIBAでも陽性であると仮定していた。 本研究では、RT-PCR検査で陽性のサンプルの6.14%（6/586）および11.4%（67/586）が、それぞれRIBA検査で陰性および不確定な結果を示すことが実証された。 第二に、研究集団が異なっていた。 Laiらは、退役軍人の集団における結果に基づいて、HCV検査のアルゴリズムを提案した。 Oethingerらは、献血者検体を用いて研究を行った。 しかし、我々の研究の母集団は、肝臓病クリニック患者（14％、127/901）、他の疾患クリニック患者（83％、748/901）、献血者（3％、26/901）の3グループであった。 各研究集団における抗HCV抗体の陽性率の違いが，最適なS/Co比のカットオフ値の違いの原因になっている可能性がある． 第三に、優勢なHCVサブタイプの分布は地域によって異なる。例えば、中国ではHCV-1bと2aが最も一般的なサブタイプである 。 このことは、ビトロスの抗HCVアッセイの結果が研究間で異なる原因となっている可能性がある。89%）は，Laiらの報告値（それぞれ58.8%，81%）より高かったものの，Contrerasらの報告値（96.6%，93.7%）より低く，S/Co比20.0でのビトロスアンチHCVアッセイによるHCVウイルス血症の予測は困難であった． その結果，S/Co比が20.0以上でありながらHCVウイルス血症を有する集団の割合は，LaiらとContrerasらの研究集団の割合の間にあることが明らかになった． S/Co比8.0での診断感度（75.77％）およびNPV（62.83％）は，先行2研究の同等結果よりもはるかに低く，このことは，S/Co比8.0以上の集団のうち，HCVウイルス血症を有する人の割合がより高いことを示唆している＜6356＞ ＜2353＞ 本研究では，586人が高い抗体価を持っていた（平均 S/Co 比 19.23，95％ CI：18.4-20.1 ）ことが示された． また，CIAに基づきS/Co比≧20.0のHCV RNAを検査した409検体のうち，374検体がHCV RNA陽性（91.4％）であったことを明らかにした。 このRNA陽性率は、これまでの研究で報告されているものとは異なるものであった。 81% , 90% , 93% , 81% , >60%であった． S/Co比が20.0以上でHCV RNAが陰性であった34検体のうち，33検体がRIBA陽性，1検体がRIBA不定値であった． 容量不足のためHCV RNAの検査を行わなかった2検体のうち、1検体がRIBA陽性、もう1検体がRIBA不定となった。 真陽性率は99.5％以上（408/410）であった。 また，モノリサ・プラステストでは，S/Co比≧20.0のサンプルの99.8%（409/410）が反応性であった。

ROC曲線解析により，RT-PCRによるウイルス血症とRIBAによる抗HCV抗体の有無を予測する診断特異度とPPV値は高く，S/Co比20.0以上はHCV曝露を強く示唆していることがわかった． したがって、少なくとも我々の研究集団については、S/Co比≧20.0の検体は、RIBA検査や二次免疫測定検査を追加で行わないことを推奨する。 このような高いS/Co比の検体は、抗HCV RIBAの結果が98％以上で陽性であることが確認されているため、このような検査は不要であろう。

日常臨床検査室における2種類の酵素免疫測定法を用いたHCV抗体検査の戦略が検証され、第2酵素免疫測定法の確認の感度と特異度はそれぞれ98.15と98.33%であった ……。 CDCは最近、HCV RIBAを中止した結果、HCV RNAの結果が陰性の場合、HCV感染症の診断に使用した最初の抗体測定法とは異なる2番目のHCV抗体測定法で検査することを推奨している 。 本研究では，検体もモノリサ・プラスで検査した． その結果，血清学的にHCVが確認され，かつウイルス血症を伴わないサンプルの17.8％（16/90）がモノリサ・プラスを補助的検査法として用いた場合に見逃された． 免疫不全は慢性HCV感染者における抗HCV結果が偽陰性になる共通の原因であるかもしれない． 私たちが以前に行った献血者の研究では，NATに加えて2種類のスクリーニングアッセイを用いても，一部の抗HCV陽性検体を見逃すことがあり，感度100％を達成しウイルス感染を回避する適切な組み合わせはない可能性が示唆された . 本研究では，モノリサ・プラスで14.6％（31/212）の検体が偽陽性と判定された． この結果から，1次検査とは異なるHCV抗原を用いた2次検査を補助的なスクリーニング方法として採用する戦略は，我々の集団における正確なHCVスクリーニングの優れた戦略ではないことが示された。

したがって，高コスト，専門機器と有資格者の要件，実行時間の延長，結果の不確定性など多くのデメリットはあるものの，特に偽陰性の抗HCV結果を示す非ウイルス性個人に対して補助検査としての免疫ブロット法が必要であることがわかった。 以前の研究では、フランスで認可されている5種類の抗HCVイムノブロットアッセイの感度を評価し、解釈の基準がより統一されているアッセイでは、結果のばらつきが少ないことを見出した。 RIBA HCV 3.0アッセイは既に販売されていないため、補足検査には他のイムノブロットアッセイを選択する必要がある。 VITROS抗HCVアッセイに基づくS/Co比が1.0～20.0の場合、適切な追加検査、すなわちウイルス性肝炎のない検体のイムノブロットアッセイを実施すべきである（表5）

S/Co 比による抗HCV結果の解釈および推奨する追加検査の種類は表5にまとめられている。 S/Co比が<20.0の場合、CIAに基づいて、HCV RNA検査も非ウイルス性C型肝炎または非C型肝炎の判別のための確認検査として行うべきである。検査対象者が過去6ヶ月以内にHCVに曝露された可能性があるか、HCV疾患の臨床証拠がある場合には、HCV RNA検査の反復またはHCV抗体のフォローアップ検査が推奨される。 ウイルス血症のない陽性検体の場合、補足検査としてのイムノブロッティングが依然として必要である。 CIAに基づき、S/Co比が≧20.0である場合、RT-PCRを行うことで、HCVウイルス血症の存在をさらに評価できる。

Acknowledgements

We appreciateingly all the listed institutions in Material and Methods for providing of samples.