Materials

Duloxetine (DLX) pure grade is gracious provided by Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India.Duloxetine (DULX) pure gradeはギフト試料としてルパン・ファーマスーティカルズから提供された。 ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）グレード100M、4CM、および15M CRは、Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Indiaから寛大に提供されたものである。 この研究で使用された他のすべての実験用化学薬品および試薬は、分析用試薬グレードのものである。 試験中、二重蒸留水を使用した。 ポリエチレングリコール400は、S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, Indiaから購入した。 リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、および水酸化ナトリウムは、CDH Ltd.、New Delhi、Indiaから購入した。 エタノール（絶対）は、Changshu Yangyuan Chemical, Chinaから入手した。 n-オクタノールは、E-Merck (India) Ltd., Mumbai, Indiaから入手した。 透析膜150は、Hi Media Laboratories Ltd.、Mumbaiから購入した。 すべての材料と粉末は、室温で真空下で保存した。

装置

UVスペクトルは、190から600 nmのUV/可視範囲でパーキンエルマーLambda 15 UV/可視分光光度計で記録された。 フランツ拡散セルアセンブリは、米国Permegear, Inc.から調達した。 赤外分光光度計FT-IR-8300は、Perkin Elmer PE RX 1 FTIR spectrophotometerから入手した。 示差走査熱量測定（DSC）スペクトルは、DSC model Q20 V24.2 Build 107（Universal V4.5A TA Instruments）を用いて得られた。 遠心分離機はREMI Equipments, Mumbai, Indiaから入手した。pHメーターCyberScan pH 510はEutech Instruments, Indiaから入手した。

処方研究

リン酸緩衝塩水pH 7の調製(Preformulation studies)4

リン酸二水素カリウム0.19g、オルトリン酸水素二ナトリウム2.38g、NaCl8.0gを蒸留水に溶解し、蒸留水で1000mlまで増量した。 緩衝液のpHは7.4に調整した。

デュロキセチン塩酸塩の定量

リン酸緩衝食塩水pH7.4でUV分光光度分析によりデュロキセチンの含有量を測定した。 原液のスキャンは、190～400nmの紫外域で行った。 λmaxは波長289 nmで得られた。 塩酸デュロキセチンの原液A（250μ/ml）は、本剤0.0250gをリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）に溶解し、100mlとしたものを調製した。 さらに、原液AおよびBをリン酸緩衝液（pH7.4）で希釈し、デュロキセチンの1μg/mlから100μg/mlまでの連続希釈液を調製した。 希釈液の吸光値は、DLXのλmax、すなわち。 289 nmの吸光度をブランクのリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）に対して記録し、検量線を作成した。

デュロキセチン塩酸塩の物理化学的特性

融点の測定

少量のデュロキセチン塩酸塩を毛細管（一端が溶けた）に取り、融点測定装置に設置し融点の記録を行った。

分配係数測定

デュロキセチン塩酸塩の分配係数は、オクタノール-水系で測定した（Wells 2002）。 2相を1:1 v/vの割合で取り、37℃のウォーターバスシェーカーで相互に飽和させ、2相を分離した。 10ミリグラムの薬物を、20 mlの予備飽和有機相と20 mlの予備飽和水の混合物に加え、10分間振盪した。 その後、フラスコを断続的に振盪しながら37℃で24時間保持した。 続いて、混合物を遠心分離して水相と非水相を分離した。 この2つの相を別々に分光光度計でデュロキセチンを分析した。 そして、オクタノールと水相中の薬物濃度の比から、薬物の分配係数「K o/w」を算出した。

薬物-ポリマー相互作用試験

Fourier-transform-infrared spectroscopy

KBrペレット法により純薬DLX、HPMC（15 CR、100 M、4 M）の混合物、および薬物が結合した経皮パッチの分析にFTIR（Fourier Translform-infrared spectroscopy）が使用された。 DSCモデルQ20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments)を用いて得られた塩酸デュロキセチンおよび製剤(HPMC + 薬物)のDSCサーモグラムから、薬物と利用したポリマー間の相互作用の可能性を分析した。

経皮パッチの作製

塩酸デュロキセチンを含む経皮フィルムを、可塑剤の有無にかかわらず、異なるグレードのHPMC (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) を用いて溶媒蒸発法でスライドグラス上にキャストした。 可塑剤としてPEG 400（5％）を使用した。 表1は、異なるタイプの製剤化されたパッチの処方と組成を示したものである。 塩酸デュロキセチン（60 mg）を水-メタノール溶媒混合物（7:3）に溶解させた。 薬物マトリックスは、同じ溶媒系に様々な濃度（1％および1.5％w/v）のHPMCを溶解することによって調製された。 この溶液を24時間放置した後，注射器と針の助けを借りて，ガラス表面に置かれた直径5.0cmのガラスリングに注いだ。 溶媒は60℃の恒温制御オーブンで6時間蒸発させた。

表1 デュロキセチン塩酸塩の処方と組成

経皮パッチの評価

物理的外観

作成したすべてのパッチは色、透明性、柔軟性および滑らかさを視覚的に点検した。

パッチの厚さ

薬物負荷パッチの厚さは、パッチの異なる3点でスクリューゲージ・マイクロメーターを使用して測定した。 3回の測定値の平均値と標準偏差を算出した。

重量の均一性

すべてのパッチをデジタル秤量器で秤量し、重量変動試験に供した。 測定は、各製剤について3回に分けて行いました。 平均重量と標準偏差を算出した。

平坦度試験

平坦度試験は、作成した経皮吸収パッチの表面が滑らかで、経時的に収縮しないことを評価するために実施した。 フィルムから縦方向に3カ所ずつ切り出した。 それぞれの長さを測定し、平坦度の不均一による長さのばらつきを、平坦度100%を0%としたときの収縮率で求めた。 収縮率は、（l1-l2）／l1×100として求めた。 ここで、l 1は各ストリップの初期長さ、l 2は各ストリップの最終長さです。

折り畳み耐久性

この試験は、可塑剤の効率と、異なるポリマーを使用して作成したパッチの強さを確認するために実施しました。 折り畳み耐久性は、任意のポリマーパッチを破るのに必要な折り畳み回数と定義されます。 折り曲げ耐性は，フィルムの小片（2×2 cm）を同じ場所で壊れるまで繰り返し折り曲げることにより，手動で測定した。 同じ箇所を何回折り曲げても折れたり割れたりしない回数を折り曲げ耐性とした。

吸湿率/水蒸気吸収率

高湿度下でのフィルムの物理的安定性と完全性を確認するため、吸湿率試験を行った。 調製したフィルム(3.14cm2)を個々に正確に計量し、室温で塩化カリウムの飽和溶液100mlを入れたデシケーター内で相対湿度85±5%に晒した。 この間、24時間、48時間、72時間の一定時間間隔でフィルムの重量を測定し、以下の式から吸湿率を求めた：

Percentage moisture content

この試験は、乾燥条件下でのフィルムの完全性を確認するためにも実施された。 個々の経皮フィルム（所定面積）を、溶融無水塩化カルシウムを含むデシケータ内に室温で保持した。 この間、24時間、48時間、72時間の一定時間間隔でフィルムの重量を測定し、次の式を用いて含水率を求めた：

Water vapor transmission

Water vapor transmission rate（WVTR）は単位時間にフィルムの単位面積を通過する水分量として定義される。 水蒸気透過率(WVTR)は、フィルムの単位面積を単位時間に透過する水分量と定義される。 セルは適切に洗浄し、オーブンで乾燥させた。 次に、各バイアルに約1gの無水溶融塩化カルシウムを入れ、粘着テープの助けを借りてバイアルのつばの上にパッチを固定した。 次に、これらのバイアルを秤量し、塩化カリウムの飽和溶液を含むデシケータに入れ、相対湿度を84%に維持した。 これらの細胞は、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目にデシケータから取り出して重量を測定した。 水蒸気透過率は次の式で求めた：

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

ここでWは透過した水蒸気の重量、Lはパッチ厚さ、Sは露出した表面積（平方センチメートル）である。

表面pH

パッチをガラス管内で0.5mlの倍蒸留水と1時間接触させ、膨潤させた。

薬物含量の測定

各製剤から2×2の大きさに切り出し、100mlのリン酸緩衝生理食塩水pH7.4溶液に入れ、pHを測定した。 この溶液をワットマン濾紙（0.45μ）で濾過し、リン酸緩衝生理食塩水pH7.4で適当に希釈した後、内容物を2時間磁気撹拌した。 次に、この溶液を、ブランクとしてプラセボパッチを用いて289nmにおけるその吸光度を分析した。 吸光度の値から、薬物含有量を決定しました。

In vitro drug release

Franz diffusion cellは、経皮製剤のin vitro特性評価に採用されています。 これは、外用製剤から皮膚を通過する薬物輸送を予測するための信頼性の高い方法である。 拡散セルの受容体区画に30.0 mlのリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）を満たし，合成セロファン膜を用いてin vitro薬物放出試験を実施した。 調製した製剤をドナーコンパートメントの膜上に塗布し、セロファン膜上に均一に広げた。 集合体は、37.0 ± 2.0 ℃、50 rpmで常に維持された。 その後、適当な時間間隔（0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 6, 12, 24時間）でサンプル（1.0 mlアリコート）を採取し、受容相体積を30 mlに維持する量の培地で補充した。 試料は289 nmで分光光度計により分析した。

Drug permeation/ex vivo studies

Drug permeation studiesはWistar雄ラットの皮膚を用いて実施した。 ラットは脊髄脱臼により犠牲にした。 皮膚試料を切断，除去し，生理食塩水で洗浄した。 付着している脂肪と結合組織は、鈍端鉗子を用いて除去した。 皮膚は6時間生理食塩水で保存した。ラットの皮膚から出た毛は、末梢を傷つけないように注意深く剃られた。 フランツ拡散セルの受容体区画を30mlのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)で満たした。 調製した製剤をドナーコンパートメントのラットの皮膚上に塗布した。 アセンブリの温度は37±2℃に常に維持され、攪拌速度は50rpmに制御された。 適当な時間間隔（0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18および24時間）でサンプル（5 mlアリコート）を採取し、同量の培地で置換して受容相容量を30 mlに維持した。 試料は289 nmのλmaxで分光光度計で分析した。

皮膚刺激性試験

実験動物の取り扱いに関する倫理的認可は、チャンディーガルのパンジャブ大学、機関動物倫理委員会（IAEC）から得て、試験は承認されたプロトコルに従って実施された。 試験開始24時間前に、ラットの腹部背面皮膚を末梢を傷つけないように注意深く剃毛した。 経皮吸収パッチをヌード皮膚に貼付し、非感作性マイクロポーラステープで覆った。 標準的な皮膚刺激物として0.8％v/vのホルマリン水溶液を塗布した。 7日間、毎日新しいパッチを貼付した。 7日後に製剤を除去し、紅斑のスコアを記録し、標準と比較した。 紅斑のスコアは、Draize scoring method (Draize et al. 1944) により、紅斑がない場合をスコア0、ごくわずかな紅斑（薄ピンク）をスコア1、明瞭な紅斑（濃いピンク）をスコア2、中程度から重度の紅斑（薄赤）をスコア3、重度の紅斑（濃い赤）をスコア4として読み取り、記録した。

データ解析

n番目のサンプルについて、V sはサンプルの引き出し量、V tは受容体の総量、C cは補正後の濃度、C uはn番目のサンプルの補正前の濃度、C iは補正前の濃度を示す。 さらに、補正濃度を用いて、薬物放出速度とともに、各サンプリング時刻における薬物放出量および薬物放出率の値を算出した。

透過係数とは、膜/皮膚を通過する薬物の速度をμg/cm2/hで表したものである。 透過係数は、P = slope × V d/S

ここで、V dはドナー溶液の体積（ミリリットル）、Sは組織の表面積（平方センチメートル）です。

フラックス（J値）は、単位時間内に単位断面の障壁を流れる物質の量と定義されます。 によって算出されます。

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