Doxycyclineは抗炎症性でStaphylococcal Exotoxin-を抑制する。

ブドウ球菌毒素ショック症候群トキシン1 (TSST-1) および構造的に関連した外毒素は、抗原提示細胞上の主要組織適合複合体クラスII分子に直接結合し (1, 5, 8, 18, 23) 、特定の Vβ要素を発現する T細胞を活性化する細菌外毒素です (7)． これらの毒素は、T細胞の大きな集団をポリクローナルに刺激する能力があるため、超抗原と呼ばれている(1, 4, 7, 14)。 このように、ブドウ球菌外毒素（SE）は、免疫系の強力な活性化因子であり、食中毒、毒性ショック、自己免疫疾患など、ヒトに様々な疾患を引き起こす（1, 2, 6, 12, 14, 22）。 免疫系の細胞との相互作用により、炎症性サイトカインやケモカインが大量に産生される（1, 4, 15, 17）。 サイトカインのうち、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-1（IL-1）、γインターフェロン（IFN-γ）は超抗原による毒性ショックにおける重要なメディエーターである（1, 21）。 TNF-αとIL-1はともに強力な免疫賦活活性を持ち、IFN-γと相乗的に作用して免疫反応を増強し、組織傷害を促進する(16)。 その結果、これらのサイトカインは生体内で高濃度になると病原性を示し、SEによって引き起こされる発熱や毒性ショックの原因となる（13、14、18、19）。

Doxycyclineはグラム陰性およびグラム陽性の微生物による感染に広く用いられる広域スペクトル抗生物質である。 静菌剤として作用し、黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、炭疽菌、エルシニア・ペスティスなど多くの微生物に対して高い効果を発揮します。 ドキシサイクリンはテトラサイクリン系抗生物質に属し、その仲間は抗菌作用とは独立した他の生物学的作用を持つことが示されている(10)。 ドキシサイクリンは、ヒト内皮細胞において、phorbol-12-myristate-13-acetateを介したマトリックスメタロプロテアーゼ8 (MMP-8) およびMMP-9を阻害する(11)。 ドキシサイクリンはまた、動脈瘤疾患モデルにおいて、エラスチン分解を減少させ、MMP活性を低下させる(3)。 さらに最近、ドキシサイクリンはリポポリサッカライドで処理した角膜上皮の培養液のIL-1βの産生を、コルチコステロイドと同程度に抑制することが示された(25)。 In vivoでは、ドキシサイクリンは血中のサイトカインと硝酸塩の分泌を抑制することにより、マウスを致死的なエンドトキシン血症から保護した(20)。 本研究は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのブドウ球菌超抗原誘発T細胞活性化およびサイトカイン産生に対するドキシサイクリンの調節効果を調べるために行われた。

ヒトPBMCは正常ヒトドナーからのヘパリン化血液のフィコール-ハイペーク密度勾配遠心分離によって単離された。 PBMC（106/ml）は、RPMI1640培地と10％熱不活性化ウシ胎児血清を含む24ウェルプレートで37℃で培養された。 細胞はSEB（200 ng/ml）またはTSST-1（200 ng/ml）と16時間インキュベートし，上清を採取してIL-1β，TNF-α，IL-6，IFN-γ，MCP-1，MIP-1α，MIP-1βについて分析した． サイトカインおよびケモカインは、製造元の説明書に従って、サイトカインまたはケモカイン特異的抗体を用いた酵素結合免疫吸着法により測定した（15、17）。 各プレートでのキャリブレーションには、ヒト組換えサイトカインおよびケモカイン（20〜1,000 pg/ml）を標準物質として使用した。 各アッセイの検出限界は20 pg/mlであった。 サイトカインおよびケモカインのデータは、二重サンプルの平均値±標準偏差（SD）で表された。 ドキシサイクリンが存在する場合は、刺激剤と同時に添加した。 細胞毒性は、乳酸脱水素酵素（LDH）の細胞質から培養上清への放出によって測定された。 LDHは，比色細胞毒性測定キット（Boehringer Mannheim）を用いて，製造者の指示に従い定量した． 1％Triton X-100で細胞を溶解することにより、放出可能なLDHの最大量（100％）を得た。 T細胞増殖は、96ウェルマイクロタイタープレートに37℃で48時間、SEBまたはTSST-1（200ng/ml）、ドキシサイクリンありまたはなしで3重にプレーティングしたPBMC（105/ウェル）を用いてアッセイされた。 細胞は、先に述べたように、培養の最後の5時間の間、1ウェル当たり1μCiのチミジン（New England Nuclear, Boston, Mass）でパルスされた（15）。 細胞はガラス繊維フィルターに採取し、取り込まれたチミジンを液体シンチレーションで測定した。 すべてのデータは、Stata (Stata Corp., College Station, Tex.) を用いてStudentのt検定により有意差を分析した。 ドキシサイクリン処理群と未処理対照群との間の差は、Pが<0.05である場合に有意とみなされた。

ドキシサイクリンが上皮細胞におけるリポポリサッカライド誘発IL-1をブロックし、in vivoにおける致死的内毒素症を防止したという報告に基づいて（20、25）、この抗生物質はSE誘発サイトカインに直接効果を有するのではないかという仮説の検証を行なった。 図1に示すように、ドキシサイクリンは、SEBとインキュベートしたPBMCによるサイトカインIL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γおよびケモカインMCP-1、MIP-1α、MIP-1βの生成を用量依存的に阻害した。 ドキシサイクリンによるサイトカインおよびケモカインの同様の用量依存的な減少は、TSST-1刺激PBMCでも観察された（データは示さず）。 7人の正常ドナーのPBMCで得られたSEBまたはTSST-1を介したサイトカインおよびケモカインに対するドキシサイクリンの阻害効果を図2にまとめている。 MCP-1およびIFN-γの産生は、50μMのドキシサイクリンによって完全にブロックされた。 この濃度のドキシサイクリンは、IL-1βα、IL-6、TNF-1α、MIP-1βを、未処理、SEB-またはTSST刺激細胞のそれぞれ15〜22％、37〜41％、21〜25％、10〜15％、59〜61％まで減少させた。 TNF-βが存在する場合は，SEB刺激細胞の25%に抑制された。 ドキシサイクリンは，トリパンブルーの排除と処理細胞からの乳酸脱水素酵素放出の欠如によって測定されるように，この濃度ではPBMCに対して細胞毒性を示さなかった． これらのサイトカインおよびケモカインの完全な阻害は、ドキシサイクリンの高用量(>0.1 mM)で観察された。 ドキシサイクリンによる同様の用量反応阻害は、SEBの低濃度（1及び10ng/ml）でも観察された（データは示さず）

スーパー抗原もT細胞増殖を引き起こすので、SE誘発T細胞増殖に対するドキシサイクリンの効果が調査された。 図3は、ドキシサイクリンがSEB-及びTSST-1刺激T細胞増殖を用量依存的に阻害し、0.05mMで98％の阻害を達成したことを示している。

この研究は、ドキシサイクリンがin vitroにおけるヒトPBMCによるスーパー抗原が関与するサイトカイン及びケモカインの産出を有効に阻害することを実証した。 また、ブドウ球菌のスーパー抗原によって誘導されるT細胞増殖も完全に抑制された。 SEBおよびTSST-1刺激PBMCにおけるドキシサイクリンによる炎症性サイトカインおよびケモカインのダウンレギュレーションは，ドキシサイクリンがトキシックショックの病態生理に影響を与える可能性を示唆するものであった． これらの知見は、抗菌作用に加えてドキシサイクリンの免疫調節作用に関する他の研究者の観察を拡張するものである。

ドキシサイクリンの抗炎症作用には、転写および転写後の複数の分子メカニズムが関与していると考えられる（11, 26）。 炎症性サイトカインの抑制は、肉芽腫形成に対する効果に関する研究によって示唆されたように、ドキシサイクリンによるPKC経路のダウンレギュレーションが関与している可能性がある(26)。 in vitroでコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、その他のメタロプロテアーゼを減少させるドキシサイクリンの阻害量（10〜15μM）は、この研究で用いた量と同等であり、ヒト血清中に200mgを毎日経口投与した場合に観察される量より数倍高い（10, 24）。 しかし、臨床研究によれば、この用量はex vivoでのヒト変形性関節症軟骨抽出物のコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性を減少させるのに十分であった(24)。 ドキシサイクリンの抗菌下用量（20 mg 1日2回）は、歯肉液コラゲナーゼ活性を阻害することが示されている（9）。 さらに、実験的なエンドトキシン血症のin vivo研究でも、ドキシサイクリンと他のテトラサイクリン類が炎症性サイトカインをダウンレギュレートし、ショックを予防する効果があることがわかった（20）＜98＞＜1127＞以上の結果から、ドキシサイクリンは炎症性サイトカインとケモカインをダウンレギュレートし、超抗原誘発毒性ショックに対する治療の可能性を示している。 宿主が細菌および細菌外毒素の両方を含む複数の生物学的物質に曝露される臨床環境において、ドキシサイクリンの使用は、抗菌および抗炎症効果の両方を提供するという追加の利点を提供する。

様々な濃度のドキシサイクリンの存在下で、1ml当たり200ngのSEBで刺激したPBMCによるIL-1β及びIL-6（A）、TNF-α及びIFN-γ（B）、並びにMCP-1、MIP-1α及びMIP-1β（C）産生の用量反応阻害。 値は、3つの実験からの二重サンプルの平均±SDを表す。