ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSIS OF ALPHA-1-ANTITRPSIN DEFICIENCY BY DNA ANALYSIS OF CHILDREN WITH LIVER DISEASE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2、Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3、Heliane Guerra SERRA4、Carmen Sílvia BERTUZZO5、Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾背景 – アルファ1アンチトリプシン欠損症は常染色体に共優先で伝わる遺伝子疾患である。 α-1-アンチトリプシン欠損症は、主に肺と肝臓に影響を与え、後者では新生児胆汁うっ滞、慢性肝炎、肝硬変に至ることがある。 α-1-アンチトリプシン欠乏症の正確な診断は、生化学的あるいは分子生物学的な分析によって行われる。 目的 – この研究の目的は、α-1-アンチトリプシン欠損症が疑われ、この疾患の実験的および臨床的特徴を示した12人の小児において、DNA分析を用いてその有無を調べることである。 患者と方法 – 血清中のα-1-アンチトリプシン濃度が正常より低く、かつ/または原因がはっきりしない肝疾患を有する生後3カ月から19歳までの12人の患者を調査した。 α-1-アンチトリプシン遺伝子の変異対立遺伝子SとZが12人の子供で調査された。 α-1-アンチトリプシン遺伝子の構成は、ポリメラーゼ連鎖反応によるゲノム増幅と制限酵素Xmnl（S対立遺伝子）およびTaq 1（Z対立遺伝子）による消化によって解析された。 結果 – 12人中7人は原因不明の慢性肝疾患、他の5人は血清中のα-1-アンチトリプシン濃度が低く、新生児胆汁うっ滞および/または原因不明の慢性肝疾患と診断された。 結論 – これらの結果は、α-1-アンチトリプシン欠損症は、原因不明の慢性肝疾患および/または低α-1-アンチトリプシンレベルの小児において比較的頻繁に見られる（41.6%）ことを示した。 正しい診断は、効果的な臨床フォローアップや遺伝カウンセリングのために重要である。

HEADINGS ¾α-1-antitrypsin deficiency. 分子生物学的診断。 肝生検。

INTRODUCTION α-1-アンチトリプシン（A1AT）は主に肝細胞で産生される52kDaの糖タンパク質で、1日に2gが血流中に放出される(36)。 A1ATの主な機能は、肺のエラスチン繊維を加水分解するセリンプロテアーゼである好中球性エラスターゼの作用を阻害することである(38)。 A1ATをコードする遺伝子に変異があると、抑制能を持たないタンパク質が生成され、肝細胞の封入体中にA1ATが蓄積し、正常な血清中の濃度が低下する(4)。 この欠損は、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症として反映される(9)。 また、肝細胞における変異型A1ATの蓄積は、新生児胆汁うっ滞、慢性肝障害、肝硬変を引き起こす可能性がある(33, 34)。

A1AT遺伝子は多型で共優性であり、14番染色体の長腕（14q 31-32.3）に位置している(20, 29)。 血清のpH4（陽極）とpH5（陰極）の間のポリアクリルアミドゲルの等電点電気泳動から、この遺伝子には75の対立遺伝子（等電点によりA〜Zと命名）が報告されている。 一般的な変異体はゲルの中央に移動するため、M（”middle”）ファミリーに属する。 1963年にLAURELLとERIKSSONによって報告された欠損型は陰極に移動し、Zと名づけられた(21)。 この多型の「遺伝子座」は、一般にPi（プロテアーゼ阻害剤）系と呼ばれている。 ほとんどの変異体は、正常な量と質のA1ATを産生する(7, 8, 25)。 しかし、変異体SやZのような一部の対立遺伝子は、白人集団のように多型頻度を獲得して欠損状態となり、タンパク質の生産が全くないnull対立遺伝子の例も報告されている(10)。

S対立遺伝子は、遺伝子のエクソンIIIにおいてアデニンがチアミンに置換され、264位のグルタミン酸がバリンに交換され、その結果不安定なタンパク質構造を形成する(10、11、19)。 Z対立遺伝子は、遺伝子のエクソンVにおいて、342位のグアニンがアデニンに置換されており、肝細胞小胞体の内側粗面上に集まるタンパク質が形成される(6)。 欠損症の診断は、通常、血清中の蛋白質量を定量し、等電点電気泳動により電気泳動プロファイルを測定することにより行われる(23, 37)。 より正確な診断にはDNAを用いた遺伝子解析が必要である(12, 14, 26)。

本研究の目的は、この欠損症が疑われ、本疾患の実験的および臨床的特徴を示した患者において、SおよびZ対立遺伝子保有者を同定することであった。

PATIENTS AND METHODS

患者 1988年2月から1997年8月までの間に、多くの患者が肝疾患を調べるためにカンピーナス州立大学小児胃腸科サービスに紹介された。 このうち確定診断のつかない患者は12名であった（ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、ウィルソン病は陰性）。 これらの患者には、A1ATの分子生物学的解析を行った。

1 ¾ 研究プロトコル

2 – 肝生検

経皮肝生検はMOWAT（24）の記載に従い、4時間以上絶食し、静脈分解とプロトロンビン活性が正常な患者に局所麻酔で実施した。 得られた断片は直ちに10％ホルマリンに入れ、ヘマトキシリン・エオジン、マッソン・トリクロミック、プルシアンブルー、銀含浸による網状繊維の処理・染色を行った。 特殊染色はPAS（periodic acid-Schiff）を使用し、その後ジアスターゼで処理することで得られた。 ジアスターゼ使用後も好酸球様の細胞質顆粒が残存していることから、A1AT欠損症は陽性と判断した。

3 – 分子解析

A1ATの変異対立遺伝子SとZを調べるために、WOODHEADらの方法と同様に末梢血白血球からDNA抽出を行った(39).

RESULTS

調査した12人の子供のうち5人はZホモ接合体（ZZ）であり、2人はS対立遺伝子とZでない別の対立遺伝子（*S）を持っていた。 表1は，採血時の年齢と，その後の解析の判断に用いた適応症である。 患者のうち3人は慢性肝疾患の初発症状として新生児胆汁うっ滞を呈した。

表2にALT，AP，gGT，A1ATの血清レベル，分子検査と肝生検の結果を示した。

ZZ遺伝子型の5人は血清A1AT値が低下し，肝生検では肝硬変（1人），新生児肝炎（2人），間葉系胆管の欠如（1人），慢性肝炎（1人）が認められた。 この最後の症例（FSP）では、HEによる染色後に大動脈周囲の肝細胞に好酸球様の細胞質顆粒が認められ、PAS陽性とジアスターゼ抵抗性で後方視的に確認された（図1）。 新生児胆汁うっ滞の2例（EKBAとRHBP）はそれぞれ10週齢と13週齢の時に肝生検を受け、好酸球性PAS陽性、ジアスターゼ抵抗性の球を認めた。

図2および図3は、それぞれSおよびZ対立遺伝子の増幅および消化の結果を示したものである。

DISCUSSION

α-1-antitrypsin deficiency は小児の肝障害を引き起こす最も一般的な遺伝子疾患の一つで、肝移植を要する最も多い遺伝子疾患である(17, 28)． A1AT欠損症は、北米や北欧では1600-2000人の新生児のうち1人が罹患すると言われていますが(28, 31)、この欠損症を持つ人口のうち肝疾患を発症するのは10-15％にすぎません(32, 33)。 1988年にSVEGERが発表した研究(33)によると、新生児期にPIZZ表現型を持つ患者の11％が黄疸性肝炎を発症している。 この研究では、A1AT欠損症と診断された3名の患者に新生児期の胆汁うっ滞が見られ、そのうち2名は欠損症の確定診断がつく前に、胆汁うっ滞は特発性と判断されたようである。 文献に報告されている特発性新生児肝炎の5〜10％は、A1AT欠損症が原因である(3)。

調査したこの欠損症の患者5名では、A1ATの血清濃度が正常下限値以下であった。 しかし、この検査で病気の診断が絶対的に確定されたわけではなかった。 A1ATは急性炎症期のタンパク質であるため、その合成は炎症性/感染性状態、新生物、妊娠、エストロゲンやコルチコステロイドを用いた治療中に増加する(16, 22)。 A1ATの血清レベルの低下は、新生児の呼吸困難症候群、肝不全の末期、嚢胞性線維症、タンパク質の損失が大きい状況下で起こる(15)。 理論的には肝疾患を引き起こす可能性のあるSZ遺伝子型の血清レベルは、通常正常である。

新生児胆汁うっ滞がある場合、基本的に肝外胆道閉鎖症との鑑別診断が必要である。 病歴から診断できる症例は83％であり(1)、診断の精度を上げるためには特定の検査が必要である。 その中でも肝生検は非常に重要な検査です。 A1AT欠損症の肝生検で見られる病理組織学的変化は、特発性新生児肝炎や肝外胆道閉鎖症で見られるものと同じである可能性がある(24)。 ジアスターゼ消化後に強いPAS陽性を示す主に肝周囲の肝細胞内グロビュールの存在は、A1AT欠損症の有用な指標である(13, 18, 27)。 しかし、生後12週以前にこれらの球を同定することは困難である(35)。 今回、患者EKBAは10週齢の肝臓組織で上記の特徴を持つグロビュールを認めた。 JCI（13週齢）にはそのようなグロビュールは見られなかった。 これらの結果から、12週齢以前に得られた肝断片において、球状体の存在を特殊染色で調べる必要があるが、陰性であってもA1AT欠損症の可能性を排除することはできないと思われる。 なお、本研究ではより精度の高いDNA解析が可能であったため、生化学的な解析は行わなかった。

A1AT欠損症は、原因不明の肝疾患を持つ小児に比較的多くみられる。 この診断が過小評価されているのは、おそらく不正確な診断方法が用いられているためである。 分子生物学的解析により、より正確な診断が可能となり、また、原因不明の肝疾患患者の遺伝カウンセリングに有用であると考えられる。

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular emriança com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – アルファ-1アンチトリプシンの欠損は、自己支配的な形で伝えられる遺伝性疾患である。 主な臨床症状として、肺がん、肝がんが挙げられます。 これらの症状は、新生児期の大腸炎、劇症肝炎または肝硬変として表現されます。 確定診断は、α-1-アンチトリプシンの生化学的解析または分子生物学的解析によって行われる。 目的 – アルファ-1アンチトリプシンの欠損を疑う12名の子供たちを対象に、確定診断のためのDNA分析による欠損の有無、およびアルファ-1アンチトリプシンの欠損と臨床的・検査的特徴との関連性を調査することです。 背景と方法 – α-1-アンチトリプシン遺伝子の変異対立遺伝子SとZについて、生後3ヶ月から19歳までの12名の患者を対象に調査した。 ブラジル、カンピーナス大学の小児消化器科外来で、血清α-1-アンチトリプシン値が正常値より低い、および/または、明確な病因のない肝疾患を呈した患者を対象とした。 DNAの解析は、酵素Xmnl（S対立遺伝子）とTaq l（Z対立遺伝子）の制限部位を作る改良型ポリメラーゼ連鎖反応遺伝子増幅法を用いて行った。 結果 – 紹介された12名の患者のうち、7名は病因が明らかでない慢性肝疾患であり、他の5名は血清α-1-アンチトリプシン量が低く、新生児胆嚢症および／または病因不明の慢性肝疾患との診断がなされていた。 この12人の患者のうち、5人はホモ接合体Z（ZZ）、2人はZとは異なる別の対立遺伝子を伴うS（*S）を持っていた。 結論 – これらの結果は、A1AT欠乏症は、病因が明確でない慢性肝疾患および/または血清A1AT量が低い（41.6％）を呈する小児において比較的頻繁に起こる病因であることを示している。 欠損の確実な診断の重要性は、患者の臨床的なフォローアップのためだけでなく、遺伝カウンセリングの観点からも正当化される。

DESCRITORS ¾α-1-アンチトリプシン欠損症。 分子生物学的な診断。 肝生検。

1. Alagille D. 生後3ヶ月の胆汁うっ滞症。 Prog Liver Dis 1979;6:471-85。

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene.With a rapid rapid radio-based analysis. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. α-1-アンチトリプシン欠乏症の分子的基礎。 Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD.（クリスタルRG、ブラントリーML、ハバードRC、キュリエルDT、ステイツDJ、ホームズMD）。 α1-アンチトリプシン遺伝子とその変異。 臨床的な影響と治療のための戦略。 胸部1989;95:196-208。

11. Curiel D、Brantly M、Curiel E、Crystal RG。 α-1-アンチトリプシンヌルマタワ遺伝子によるα-1-アンチトリプシン欠乏症。 α-1-アンチトリプシン遺伝子がα-1-アンチトリプシンを産生できなくなる挿入変異。 J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. α1-アンチトリプシン欠損症の迅速なDNA分析：変異遺伝子配列の増幅のための改良法の適用。 を参照。

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopathological features of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency（ドイチュJ、ベッカーH、オーベックL、アルファ1アンチトリプシン欠損症における肝疾患の病理組織学的特徴）。 Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. α1-アンチトリプシン遺伝子の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法：出生前診断への応用。 Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serum enzyme inhibitor concentrations in the respiratory distress syndrome（呼吸困難症候群における血清酵素阻害剤濃度）. を “li “といいます。

18. Ishak KG. 遺伝性代謝疾患における肝形態。 Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. 分子ハイブリダイゼーションによるα1-アンチトリプシン遺伝子と配列関連遺伝子のヒトクロモソーム14へのアサインメント。 Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. α-1-アンチトリプシン欠乏症における血清の電気泳動α-1-グロブリンパターン． Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. ラウレル CB, クランダー S, トレル J. ストロゲンとプロゲスチンの複合避妊薬の投与が個々の血漿蛋白質のレベルに及ぼす影響。 Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. α1-アンチトリプシン：分子とPiシステム。 アクタ・ペディアトル 1994;393 Suppl:1-4.

26. 岡山 肇、Curiel DT、Brantly ML、Holmes MD、Crystal RG. ヒトゲノムの変異をアレル特異的増幅法により非放射性で迅速に検出する。 J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. α1-アンチトリプシン欠乏症の臨床症状． Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S and Z do gene da alfa-1-antitripsina em grupo portadores de doença pulmonica cro nica .

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. α-1-アンチトリプシン欠乏症。 直接集団スクリーニングにより決定されたセントルイス地域における高い有病率。 Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6。

32. Sveger T. 20万人の乳児のスクリーニングによって検出されたα1-アンチトリプシン欠乏症の肝臓疾患。 N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. このような場合、「痒いところに手が届く」という言葉があります。

35. Talbot IC, Mowat AP. 乳児期の肝疾患。 組織学的特徴およびα1-アンチトリプシン表現型との関係。 J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. ヒト血漿中プロテイナーゼインヒビター。 を嚆矢とする。

37. ヴァン・スティーンベルゲン W. α1-アンチトリプシン欠損症：概説. を使用しています。

38. Wewers MD、Casolaro MA、Sellers SE、Swayze SC、McPhaul KM、Wittes JT、Crystal RG. 肺気腫に伴う補充療法欠乏症。 N Engl J Med 1987;316:1055-62.

1999年3月11日に受理されました。
Aprovado em 6/11/2000.

* Study conducted by the Departments of Pediatrics, Medical Genetics, Anatomical Pathology and Clinical Pathology of Faculty of Medical Sciences (FCM), State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.The Studyは、ブラジル国立カンピーナス大学の小児科、遺伝学、解剖病理学、臨床病理学部門が実施した。

1 大学院生。 FCM/UNICAMP、小児科。

2 助教授。 FCM/UNICAMP、臨床病理学教室。

3 助教授。 FCM/UNICAMP・解剖学的病理学教室。

4 UNICAMP、博士（生物学研究所、遺伝学）。

5 助教授。 FCM/UNICAMP、医学遺伝学教室。

6 アシスタントプロフェッサー。 FCM/UNICAMP、小児科。