ORIGINAL PAPERS

Hepatitis B surface antigen detection using pooled sera.The Hepatitis B surface antigen detection (プールされた血清を用いたB型肝炎表面抗原の検出)。 コスト・ベネフィット分析

E. Fernández, L. Rodrigo1, S. García, S. Riestra1 and C. Blanco

Service of Biochemistry.（生化学研究室）。 ホスピタル・デ・カブエニェス。 Gijón. 1消化器病学教室。 ホスピタル・セントラル・デ・アストゥリアス。 オビエド。 Spain

Correspondence

ABSTRACT

目的：B型肝炎表面抗原（HBsAg）のスクリーニングに酵素免疫測定（EIA）を用いた5検体プーリング戦略の実行可能性と費用便益分析を行うことである。
材料と方法：プーリング法の感度と特異性を評価するために、40の陽性血清（弱いHBsAg陽性から強いHBsAg陽性まで）と250の陰性血清のそれぞれを、4つのHBsAg陰性血清とのプールでテストした。 HBsAg/adおよびHBsAg/ayの検出限界は，精製されたサブタイプのパネルからの血清を用いて評価された． 340人の妊婦のプールを用いて，実際の条件下での試験を実施した．
結果：本法の感度および特異度は100％であった。 単一条件およびプール条件下で検討した40検体のサンプル／カットオフ比の相関係数は0.792（p＜8166＞0.005）であった。 HBsAg/adおよびHBsAg/ayの検出レベルは，プール法で0.20 ng/mL，0.12 ng/mL，シングル法で0.34 ng/mL，0.29 ng/mLと低レベルであった． プール法では，陽性血清に混在する4つの血清の抗HBsが100 IU/Lまでの値では感度を失わない． 費用便益分析では，血清有病率が10％か1％かによって，プーリング法はHBsAg測定の費用をそれぞれ30％から75％まで節約できることが示された．
結論：プールされたHBsAg EIAは、単一のEIA検査よりも悪い結果は得られず、有病率が高い地域、中程度、低い地域において費用対効果が高く、有効な戦略であった。

キーワード B型肝炎表面抗原 血清のプーリング。 費用対効果分析。

Rodrigo L, Fernández E, García S, Riestra S, Blanco C. Hepatitis B surface antigen detection using pooled sera. コスト・ベネフィット分析。 Rev Esp Enferm Dig 2006; 98: 112-121。

はじめに

B型肝炎ウイルス（HBV）感染は、世界中で数百万人が罹患している病気である。 その主な貯蔵庫は、慢性HBVキャリアのものである。 全世界で約3億人がこのウイルスに感染していると推定されている(1)。 HBV感染の医学的結果は、患者の年齢や免疫状態などの要因によって変化し、予測不可能である。 HBVは、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌の病因としてよく知られています。

しかし、その感染率には大きな差があり、このため、高、中、低の三大感染地域が設定されています（2）。 ほとんどの先進国では、慢性HBVキャリアの有病率は2％未満であり、特に特定のリスクグループに属する成人（麻薬使用者、同性愛男性、乱交異性愛者、医療従事者）において感染伝播が起こっている（3）。 スペインでは、HBVキャリアの有病率は1.2％であり（4）、献血者、妊婦、自己輸血者におけるHBsAgの確認は必須である。

血清プーリング法は、効果を損なわずにコストを削減しようとするもので、主に途上国でヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対する抗体（5-14）や、C型肝炎ウイルス（HCV）の抗体検索に用いられている（15-19）。 本研究では、血清プーリング法がHBsAgの検出に適用できるかどうかを評価し、その感度を変更する要因を明らかにし、この診断法のコスト・ベネフィット分析を行うことを試みた。

材料と方法

HBsAg決定

HBsAg評価には、定性的第三世代微粒子Enzyme Immunoassay（EIA）であるImx HBsAg assay（Abbott Laboratories、Abbott Park、IL）が使用されました。 HBsAgの有無は、蛍光産物の生成率を、陰性キャリブレーター（N）率（HBsAgに反応しないヒト血漿）から算出されるカットオフ値と比較することで判断する。 Imx HBsAg アッセイでは、サンプル（S）率とネガティブキャリブレーター率の比率を算出する。 カットオフ値（S/N）は、単一血清EIAでは2として設定されました。

プーリング法は、プールに200mcLを加えることにより、すなわちプールを構成する5つの血清のそれぞれ40mcLの混合物を得ることにより行われます（希釈率1/5）。 カットオフ値は陰性サンプルの平均値に3標準偏差を加えた値であり、1である。したがって、S/N係数が＜8166＞カットオフ値であれば、この5人グループの中に非反応サンプルが存在すると考えられるが、S/Nプール＜4511＞カットオフ値は少なくとも一つの反応サンプルが存在することを示していると思われる。 この場合、反応性サンプルを特定するために、個々のサンプルを再試験する必要があります。 すべての検査は二重に行われます。

上記に従い、250の陰性血清からなる50プールでHBsAg評価を行い、特異性を評価しました。 感度を計算するために、サンプリングした一般集団と同じ濃度分布を持つ40の血清は、4つの陰性血清のプールで検査した。

HBsAg subtypes (ad and ay)

adおよびayのImx HBsAgの検出限界は精製HBsAgサブタイプのパネル（肝炎HBsAg感受性パネル、Abbott Laboratories）からの血清を使って評価された。 HBsAg/adおよびHBsAg/ayの濃度はそれぞれ0.13〜2.32 ng/mLおよび0.21〜2.24 ng/mLの範囲であった． 検出限界は，単一血清およびHBsAg陰性血清4本を含むプールで測定された．

抗HBs抗体の影響

プール検査で調べた血清中に抗HBs抗体の存在がHBsAgを中和し、本法の感度を阻害するかどうかを確かめるために、HBsAg/adおよびHBsAg/ayの濃度が既知の血清と抗HBs力価が既知の血清4本をプールする方法を適用した。

抗HBsの定量はAxSYm autoanalyzer (AxSYmTM AUSAB, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) を用いた微粒子酵素免疫測定法 (mEIA) で行った。 抗HBs力価の高い血清は、ワクチン接種後のHBVコントロールとB型肝炎から回復した患者から得た。

HBsAgスクリーニングにおけるプールテスト

プールテストの有効性を評価するために、HCV感染の有病率を推定するための我々の以前の研究で妊婦から得た1525血清試料で、採取後-20 ℃に保存した試料を用いて上記の方法での現場作業のシミュレーションが実施された。 この中から無作為にHBsAg陰性300検体とHBsAg陽性14検体を選択した。 227>

検査回数の削減

プールが陽性となった場合、HBsAg陽性の検体を特定するために、各成分を個別に再検査する必要がある。 したがって、陽性プールの数（すなわち、HBsAgの有病率）が多いほど、実行される検査数の減少は小さくなる。

これに基づき、HBsAgのプール血清スクリーニングが使用された場合の検査数の減少率は、最も好ましくない、ありえない条件（低有病率）、すなわち、どのプールにも一つ以上の陽性血清が存在しない場合に算出された。 例えば，HBsAgの有病率が2％の場合，20のプールで100の血清を分析すると，そのうち2つが陽性となる。 そこで、最初の20検体（20プール）に10検体（10血清の個別再検査）を追加し、合計30検体とする必要がある。 この例では、70%のコストを節約することができる。 費用便益分析を行うため、HBsAg検査の価格は1検体あたり3米ドルと見積もられた。 これは当院での市販キットの平均的な実勢価格に基づいている。

データはデータベースに集められ、後に統計パッケージSPSS for Windows, Release 10.0を使って分析した。 Spearmanのノンパラメトリック線形相関が採用された。 結果は平均値±SDで表される。 p < 0.05のレベルは、統計的に有意とみなされた。

結果

HBsAg陰性血清の50プールのいずれも陽性となり（S/Nプール> 1）、S/Nプールは以下の値が得られた。 0.767±0.076（0.67-0.88 の範囲）であった。 したがって，このサンプルでは，このプーリング法の特異度は100％であった． 一方，40のHBsAg陽性血清すべてをプールして測定した場合，S/N値は1以上であった（感度も100％であった）． これら40検体の単体とプールでのS/N比の相関係数は0.792（p＜8166＞0.05）であった。

高いHBsAg力価を有する検体のプールでは26ポイント6％が単体よりさらに大きなS/N比を有していた。 しかし、HBsAg力価が低いサンプル（S/Nシングル< 25、n = 12）の相関係数は、（図1）からわかるように、優れた（R = 0.9739, p < 0.05）でした。

単一法による検出限界は0.ad亜型では34 ng/mL、ay亜型では0.29 ng/mL、プーリング法ではそれぞれ0.20 ng/mL、0.12 ng/mLとより低いレベルの抗原が検出された。 HBsAg/adとHBsAg/ayの濃度が異なる血清にシングル法とプール法を適用した結果を示す（図2）。

プール中の抗HBs力価が100IU/L未満では、本法の感度が低下せず、抗HBs力価が10000IU/Lになっても、本法によりHBsAg濃度1.5 ng/mLの低い値を検出することが可能であった。 プーリング法を用いた場合のHBsAgサブタイプの検出限界に対する抗HBs濃度の違いの影響を示す（2回の測定の平均）（図3）。

妊婦の血清に対して実際の条件下で行われた調査では、プーリング法によってすべての分析試料が正しく分類された。 その結果、感度、特異度は100％であった。

HBsAgの血清有病率の上昇に伴い、プーリング法による検査数の減少の割合が減少していくことが確認された。 調査したサンプルのHBsAg有病率が10％と高い場合でも、少なくとも30％の節約に達することがわかる（図4）。

血清プーリング戦略の経済効果の分析から、達成できる節約額はHBsAg有病率と測定する数によって異なることがわかる。 したがって、我々のような有病率の低い国では、プーリング法はHBsAgの検査費用を削減する。 例えば、ある検査室でプーリング法を用いて1年間に2,500件の判定を行った場合、5,630米ドルの節約になり、年間20,000件の判定を行う非常に忙しい病院の場合、45,000米ドルに達すると推定される（表1）。

議論

プーリング法へのアプローチとして、感度を落とさないために、プールした各検査の希釈と反応混合物の最終量を維持し、そのために希釈剤を減らし、一部は追加血清で置き換える。 このように，個別化された検体では，標準法に対してカットオフ値を変更する必要はない． しかし、今回使用した方法は自動化されており、検体の希釈はオートアナライザーで行われた。 このため，各検体は他の4つの血清と混合される際に5分の1に希釈される． 特異度に関しては，プールの平均値がカットオフ値から3標準偏差強であったことに注目する必要がある． したがって、約1％の確率で偽陽性となることが予想される。 特異度はほぼ100％（99.9％）であるため、これは許容範囲であると考えられる。

単一検体とプール検体の相関は良好であるが、回帰線はS/N比3でX軸を切断している（対応するY値は1）。 これは、単一サンプル試験でS/N比が2と3の間にあるサンプルは、値が1以下となるため、プール試験で検出されないことを意味していると思われます。

HBsAg陽性血清の有病率が1％の場合、Liuら（19）が記述した数学モデルは、11血清のプールサイズに対して検査数の最大削減（80.5%）を達成した。 しかし，プーリングによる偽陽性率への影響から，特異性に問題が生じる可能性があると考えられる． 血清の混合により非特異的なタンパク質が増加し、背景色が濃くなる可能性がある。 本研究で選択したプールサイズは5であり、カットオフ値を2から1に変更しても、感度（偽陰性）および特異性（偽陽性）の損失は観察されなかった。 これらの知見は，HCVやHIV感染の研究にプーリング法を適用した他の研究者によって得られた知見と同様である（5-19）。 現在までに、HBV感染症の研究にpooling法を適用した研究は2件（20,21）しか報告されていない。 そのうちの1つ(20)では、10個のサンプルプールを検査することによってB型肝炎のルーチン妊婦スクリーニングを実施したところ、慢性キャリアが0.43％と低く、この方法は費用対効果が高く、血清有病率の低い地域では有効な戦略であるが、感度の低下は4.2％と推定されると結論付けている。 我々の研究では、HBsAgの慢性的キャリアの有病率が0.93％である妊婦にプーリング法を適用したところ、感度および特異度が100％であることが確認された。

私たちの環境では、HBsAgの2大亜型（adとay）の分布はそれぞれ約50％で、ayは非経口投与を行う薬物中毒者で頻度が高い（22）。 我々は、プーリング法によって、2つの主要なHBsAg亜型の測定に用いるイムノアッセイの感度が向上すること、すなわち検出限界が低下することを実証した。 HBsAg/adは0.20 ng/mL，HBsAg/ayは0.12 ng/mLと標準法よりさらに低濃度の検出が可能であることがわかった． プール検査で感度が向上することは，他の著者らによっても報告されており，驚くにはあたらない(16)． プール検査に使用するEIAキットの感度を評価することは重要であり、C型肝炎ウイルスに対する抗体の場合に実証されているように、すべてのキットがプールのスクリーニングに適しているとは限らないからである(23,24)

プール血清中に抗HBsが存在すると、この技術の感度が変化することがあるが、それはワクチン後のコントロール研究のサンプルに見られる、10000 IU/mL 以上の力価で顕著である；この状況で、HBsAgの測定は指示されてはいない。 実際、Cunninghanら(20)は、妊婦の血清で構成されたプールのわずか4.5％が7,500 IU/L以上の抗HBs力価を有していることを見いだした。 このプーリング法の感度の限界を念頭に置いて、彼らは、これも感度および特異度において100％前後であることを見出した。 今回の結果は、他の有病率の低い地域でも再現可能であるが、HBVの有病率の高い地域で事前に実証しておく必要がある。

Rabenauら（21）は、血漿プール中のHBsAgについて、我々と同様のEIAシステムを用いて、血清検査の安全性について研究した。 彼らの研究では、HBsAgの検出は、5時間培養後の低い抗HBs力価の存在に影響されていた。 しかし、免疫複合体の解離後、抗HBs抗体価が高い場合でも、プール中のHBsAgは検出可能であった。 我々の研究では、10,000 IU/Lより高い抗HBs力価では感度が著しく低下するだけであることを実証している。 これらの相違は、我々の場合、検体が事前にインキュベートされることなく検査されたことに起因していると思われる。 したがって、血清中の抗HBs抗体価およびEIAによる検体の前処理は、プーリング法の感度に影響を与える可能性があると考えられる。 WHOはHIV感染者の場合，有病率が2％以下であれば血清プーリング法の使用を推奨しており，最大5本の血清をプーリングするとしている(25)． これらの適応に従い、ほとんどの研究が血清有病率の低い地域でプーリング法を適用し、その使用を推奨している。 本研究では、HBsAgキャリアの有病率が高い集団においても、血清のプーリングが費用対効果に優れている可能性があることを実証した。 このことは、HBV感染の中・高蔓延地域に属する国々、すなわち一般に低開発国や発展途上国、すなわち検査に関わる経済的コストの削減がより必要とされている国々で、この手法を用いることができる可能性がある。 しかし、今回の結果を確認するためには、これらの地域でも同様の調査を実施する必要がある。 しかし、ケニアのようにHIV感染率が高い国（7.3％）では、HIV検出のためのプーリングの適用により、安全性を大きく損なうことなく62％の経済的節約が可能であることが既に示されている(14)。 HBVの低蔓延地域に属し、一般集団におけるHBsAgキャリアの頻度が1.2％であるスペインでは（4）、現在HBsAgのスクリーニングが必須であるすべてのグループ（献血者、自己輸血プログラムを受けている被験者、妊婦のスクリーニングなど）で使用できるだろう。

HBVの慢性保菌者を検出する技術を応用した費用対効果の研究により、血清有病率の低い集団で多数の判定を行った場合、経済的節約が大きく、その使用は感染率の高い地域や少数の判定を行う検査室でも費用対効果があることを実証することができた。 HBsAgの有病率の違いや年間検査数の違いによる経済的なコスト削減効果を示しました。

最近、血液製剤の輸血の安全性を高めるために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた献血者中のウイルス核酸検出の戦略を実践し始めた研究者がいる（26-29）。 経済的な問題や作業量の多さから個人でスクリーニングを行うことができないため、血清学的に陰性な血液をプールしておく方法がとられるようになった。 この方法は、比較的低コストで献血を系統的にスクリーニングすることにより、血液の安全性を高める可能性がある。 これらの方法を実践する上での大きな制約の一つは経済的なものであるため、本研究により、HBV、HCV、HIV感染のスクリーニングを2段階に分けて比較的低い経済コストで実施するための理論的根拠が得られると考えられる。 第一段階では、市販のEIAをドナー血清のプールに適用することができる。第二段階では、血清陰性のサンプルのプールにPCR技術を適用することにより、分析の安全性を高めることができるだろう。 2820＞我々は、プールされた血清へのEIAの適用が、血清有病率の低い地域における2つの主要なHBsAg亜型の検出において、感度と特異性の高い方法であると結論づけた。 感度は、プール血清中の抗HBs抗体価が非常に高い場合にのみ低下する。 プール法は、HBsAgキャリアの有病率が高い集団の研究に採用すれば、経済的な節約も可能な方法である。 これらの知見を確認するために、さらなる研究が必要であると考える。

謝辞

原稿の英訳を担当したDavid H. Wallace（the European Association of Science Editors and the Council of Biological Editorsのメンバー）に感謝する

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