免疫細胞化学の方法、技術およびプロトコル

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抗体が抗原に自由にアクセスできるように、細胞を固定し透過させる必要があります。 一般に、細胞の固定強度と固定時間は、厚く、構造的に複雑な組織切片に比べてかなり短くなります。 免疫細胞化学の場合、サンプル調製は基本的に標的細胞をスライドに固定することである。 完璧な固定は、抗原を固定する一方で、本物の細胞および細胞下の構造を保持し、すべての細胞および細胞下のコンパートメントへの抗体のアクセスを妨げることがないようにする。 幅広い種類の固定剤が一般的に使用されており、検査する抗原の性質や使用する抗体の特性によって、正しい方法を選択することができます。 固定化方法は一般的に、有機溶媒と架橋試薬の2種類に分類されます。 アルコール、アセトンなどの有機溶媒は脂質を除去し、細胞を脱水させるとともに、細胞構造上のタンパク質を沈殿させる。 架橋試薬（パラホルムアルデヒドなど）は、通常は遊離アミノ基を介して分子間に橋をかけ、結合した抗原のネットワークを形成する。 架橋剤は有機溶媒よりも細胞構造を保持しやすいですが、一部の細胞成分の抗原性を低下させる可能性があり、抗体が試料にアクセスできるように透過化ステップを追加する必要があります。 どちらの方法でも固定するとタンパク質抗原が変性する可能性があり、このため変性したタンパク質に対して調製した抗体の方が細胞染色に有用な場合がある。 異なる固定方法について説明する。 用途に応じて適切な固定方法を選択する必要があります。 アセトン固定

  • -20℃のアセトン中で5-10分間固定する。

  • アセトン固定後の透過処理は不要。

2．メタノール固定

  • -20℃メタノール中で5-10分固定する。

  • メタノール固定後は透過処理不要。

3. エタノール固定

  • 冷えた95%エタノール、5%氷酢酸で5～10分間固定します。

4. Methanol-Acetone Fixation

  • 冷却したメタノールで-20℃、10分間固定する。

  • 余分なメタノールを除去する。

  • 冷却したアセトンで-20℃、1分間透過させる。 Methanol-Acetone Mix Fixation

    • 1:1 methanol and acetone mixture.

    • 新しい混合物を作り、-20℃で5〜10分間細胞を固定する。

    6. メタノール-エタノール混合固定

    • 1:1 メタノール-エタノール混合溶液。

    7. ホルマリン固定

    • 10%中性緩衝ホルマリンで5-10分固定します。

    • PBSで簡単にリンスしてください。

    • 0.5% Triton X-100で10分間透過処理します。

    8. Paraformaldehyde-Triton Fixation

    • 3-4% paraformaldehydeで10-20分間固定します。

    • PBSで簡単にリンスします。

    • 0.5% Triton X-100で10分間過敏化させます。 パラホルムアルデヒド・メタノール固定

      • 4%パラホルムアルデヒドで10-20分固定。

      • PBSで軽くリンス。

      • 冷却メタノールで-20℃、5-10分透過させる。

        • 8:30-10:30に終了。