Isolation of Extended-Spectrum β-lactamase- (ESBL-) Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from Patients with Community-Onset Urinary Tract Infections in Jimma University Specialized Hospital, Southwest Ethiopia

Abstract

Achtergrond. Klebsiella pneumoniae en Escherichia coli zijn de belangrijkste extended-spectrum β-lactamase- (ESBL-) producerende organismen die in toenemende mate geïsoleerd worden als oorzaak van gecompliceerde urineweginfecties en blijven een belangrijke oorzaak van falen van therapie met cefalosporines en hebben ernstige gevolgen voor infectiecontrole. Doelstelling. Het beoordelen van de prevalentie en antibiotica resistentie patronen van ESBL-producerende Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae van community-onset urineweginfecties in Jimma University Specialized hospital, Southwest Ethiopia, 2016. Methodologie. Een ziekenhuisgebaseerde cross-sectionele studie werd uitgevoerd, en een totaal van 342 urinemonsters werden gekweekt op MacConkey agar voor de detectie van etiologische agentia. Er werden double-disk synergy (DDS) methoden gebruikt voor de detectie van ESBL-producerende stammen. Een schijf amoxicilline + clavulaanzuur (20/10 µg) werd in het midden van de Mueller-Hinton agarplaat geplaatst, en cefotaxime (30 µg) en ceftazidime (30 µg) werden op een afstand van 20 mm (hart op hart) van de schijf amoxicilline + clavulaanzuur geplaatst. Een versterkte remmingszone van een van de cefalosporineschijven aan de kant tegenover amoxicilline + clavulaanzuur werd beschouwd als ESBL-producent. Resultaten. In de huidige studie werden ESBL-producerende fenotypes gedetecteerd in 23% (n = 17) van de urine-isolaten, waarvan Escherichia coli goed was voor 76,5% (n = 13) en K. pneumoniae voor 23,5% (n = 4). ESBL-producerende fenotypes vertoonden hoge resistentie tegen cefotaxime (100%), ceftriaxon (100%), en ceftazidime (70,6%), terwijl zowel ESBL-producerende als niet-ESBL-producerende isolaten lage resistentie vertoonden tegen amikacine (9,5%), en geen resistentie werd gezien met imipenem. In de analyse van risicofactoren bleken eerder antibioticagebruik meer dan twee cycli in het voorgaande jaar (odds ratio (OR), 6,238; 95% betrouwbaarheidsinterval (CI), 1,257-30,957; p = 0,025) en recidiverende UTI meer dan twee cycli in de laatste 6 maanden of meer dan drie cycli in het laatste jaar (OR, 7,356; 95% CI, 1,429-37,867; p = 0,017) significant geassocieerd te zijn met de ESBL-producerende groepen. Conclusie. Extended-spectrum β-lactamases- (ESBL-)producerende stammen werden gedetecteerd in urinewegisolaten. Multiresistentie tegen derde-generatie cefalosporines, aminoglycosiden, fluorochinolonen, trimethoprim-sulfamethoxazol en tetracyclines komt vaker voor bij ESBL-producenten. Het opsporen en rapporteren van ESBL-producerende organismen is dus van het grootste belang bij de klinische besluitvorming.

1. Inleiding

Drugresistente microben van allerlei aard kunnen zich ongemerkt verplaatsen onder mensen en dieren, van het ene land naar het andere. Sinds de 21e eeuw wordt gedacht dat de opkomst van ESBL-bacteriën (extended-spectrum β-lactamase) een toenemend risico inhoudt van overdracht van resistente stammen bij mens en dier. Dit is een zorgwekkend wereldwijd volksgezondheidsprobleem, aangezien infecties die door dergelijke enzymproducerende organismen worden veroorzaakt, gepaard gaan met een hogere morbiditeit en mortaliteit en een grotere fiscale last. Het probleem is duidelijk ernstig in ontwikkelingslanden, waar de studies over dit onderwerp, de beschikbaarheid van geneesmiddelen en het juiste gebruik ervan beperkt waren en het resistentiepercentage hoog was.

ESBL-producerende organismen zijn in staat penicilline, breed-spectrum cefalosporines en monobactamines te hydrolyseren, maar zij hebben geen invloed op de cefamycines of carbapenems, en hun activiteit wordt geremd door clavulaanzuur. Bovendien vertonen ESBL-producerende organismen vaak resistentie tegen andere antimicrobiële klassen zoals fluorochinolonen, aminoglycosiden en trimethoprim-sulfamethoxazol ten gevolge van geassocieerde resistentiemechanismen, die zowel chromosomaal als plasmide-gecodeerd kunnen zijn. Aangenomen werd dat het wijdverbreide gebruik van cefalosporines van de derde generatie de belangrijkste oorzaak was van mutaties in deze enzymen die leidden tot het ontstaan van plasmide-gecodeerde ESBL’s. Deze ESBL’s werden overgedragen tussen bacteriën door plasmiden, die op hun beurt werden verspreid door klonale verspreiding tussen ziekenhuizen en landen door de mobiliteit van patiënten .

De aanwezigheid van ESBL’s bemoeilijkt de antibioticaselectie, vooral bij patiënten met ernstige infecties, zoals bacteriëmie. De reden hiervoor is dat ESBL-producerende bacteriën, ook die welke in de gemeenschap ontstaan, vaak multiresistent zijn tegen verschillende antibiotica; een interessant kenmerk van isolaten die CTX-M produceren (CTX staat voor cefotaximases en M voor München) is de coresistentie tegen de fluorochinolonen. Type CTX-M ESBL’s is beschreven als een enzym dat bij voorkeur cefotaxime hydrolyseert boven ceftazidime en ook cefepime met hoge efficiëntie hydrolyseert.

De verspreiding en de last van ESBL-producerende bacteriën zijn groter in ontwikkelingslanden. Uit een recent onderzoek is gebleken dat de gezamenlijke prevalentie van zorginfecties in een omgeving met beperkte middelen (15,5%) twee keer zo hoog was als de gemiddelde prevalentie in Europa (7,1%). Enkele plausibele redenen voor dit verschil zijn de volgende omstandigheden die in lage-inkomenslanden heersen: overvolle ziekenhuizen, uitgebreidere zelfbehandeling en gebruik van antimicrobiële stoffen zonder recept, slechtere hygiëne in het algemeen en in het bijzonder in ziekenhuizen, en minder doeltreffende infectiebestrijding.

In vergelijking met de rest van de wereld is er over het algemeen een gebrek aan uitgebreide gegevens over ESBL-producerende Enterobacteriaceae in Afrikaanse landen. De werkelijke situatie van antibioticaresistentie is ook niet duidelijk omdat zowel ESBL-producerende als niet-ESBL-producerende organismen niet routinematig worden gekweekt en hun resistentie tegen antibiotica niet kan worden getest. Daarom werd deze studie uitgevoerd om de prevalentie en het antimicrobiële resistentie patroon van ESBL-producerende Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae te bepalen, geïsoleerd uit gemeenschap-ontstaan UTI patiënten in Jimma University Specialized Hospital, Zuidwest Ethiopië.

2. Materialen en Methoden

2.1. Studiegebied en Periode

De studie werd uitgevoerd in Jimma University Specialized Hospital (JUSH) in Jimma stad van maart tot juni, 2016. Jimma University specialized hospital ligt ten zuidwesten van Addis Abeba, de hoofdstad van Ethiopië, en is momenteel het enige meer dan 300-bedden tellende opleidingsziekenhuis in het zuidwestelijke deel van het land.

2.2. Study Design and Study Participants

Een cross-sectionele studie werd uitgevoerd om de prevalentie en het antimicrobiële resistentiepatroon van ESBL-producerende E. coli en K. pneumoniae onder community-onset UTI-infecties in Jimma University Specialized Hospital (JUSH), Zuidwest-Ethiopië, te evalueren. Alle poliklinische patiënten met een leeftijd van ≥15 jaar die verdacht werden van symptomen van urineweginfecties zoals klinisch gediagnosticeerd binnen 48 uur na opname en degenen die van poliklinische afdelingen kwamen voor laboratoriumdiagnostiek van urine, werden als studiedeelnemers genomen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten of voogden van de patiënt voordat de gegevens werden verzameld. De patiënten die verdacht werden van symptomen van UTI werden geïdentificeerd door met de artsen te communiceren, aangezien hij/zij “UTI” op de aanvraagformulieren voor het laboratorium zette als identificatienummer voor de patiënten die verdacht werden van UTI, zoals klinisch gediagnosticeerd, en die naar het laboratorium werden gevraagd voor urine-onderzoek. Patiënten die in de afgelopen 2 weken antibiotica kregen, werden uitgesloten.

2.3. Definities

Community-onset infecties worden gedefinieerd als infecties die binnen 48 uur na ziekenhuisopname ontstaan of die zich in de poliklinische setting presenteren. Dergelijke infecties kunnen in twee groepen worden verdeeld. De eerste groep wordt geassocieerd met instellingen voor gezondheidszorg en omvat patiënten die intraveneuze behandeling of gespecialiseerde zorg krijgen, patiënten die een hemodialysebehandeling of antineoplastische chemotherapie hebben gekregen, patiënten die in de voorafgaande 30 dagen een ziekenhuiskliniek hebben bezocht, patiënten die in de voorafgaande 90 dagen twee dagen in een centrum voor acute zorg zijn opgenomen, en bewoners van verpleeghuizen of centra voor langdurige zorg. De tweede groep vertegenwoordigt werkelijk community-acquired infecties bij patiënten die niet aan de bovengenoemde criteria voldoen.

2.4. Gegevensverzameling

2.4.1. Sociodemografische en klinische gegevens

Sociodemografische en andere klinische gegevens zoals leeftijd, geslacht, eerder antibioticagebruik meer dan twee cycli per jaar, eerdere intraveneuze therapie thuis of in een kliniek en herhaalde polikliniekbezoeken aan het ziekenhuis in de afgelopen 30 dagen, eerdere ziekenhuisopname in een centrum voor acute zorg 2 of meer dagen in de afgelopen 90 dagen, vorige invasieve procedures van de urinewegen, vorige wondverzorging door gespecialiseerde verpleging of familie binnen de 30 dagen, aanwezigheid van diabetes mellitus, en terugkerende infecties van de urinewegen werden verzameld door middel van een face-to-face interview van de patiënt of voogd van de patiënt met behulp van een goed gestructureerde vragenlijst vóór de laboratorium monster collectie.

2.4.2. Laboratoriumgegevensverzameling

Er werden in totaal 342 midstream urinemonsters verzameld met een steriele, wijdmondige, en lekvrije houder. Een 10 µl (0,01 ml) goed gemengd urinemonster werd geënt in MacConkey agar (Oxoid, UK) en gedurende 24 uur bij 37°C geïncubeerd. Het kolonietelling met ten minste 105 CFU/ml voor enkele midstream urine werd genomen als positieve urine cultuur zoals eerder beschreven . Alle isolaten werden vooraf gescreend op hun koloniemorfologie, pigmentproductie (roze tot kleurloze platte of mucoïde kolonies), en Gram-kleuringstechnieken (Gram-negatieve staven, niet-sporend, en niet-gekapseld). De isolaten werden verder geïdentificeerd aan de hand van de beweeglijkheid en andere relevante biochemische tests. Zo werd een isolaat als E. coli beschouwd wanneer het indool- (donkerroze ring) en methylrood-positief was, citraat-negatief (geen verandering of groen gebleven) en ureum-negatief, gas- en zuurproducerend, en beweeglijk, en als K. pneumoniae wanneer het indool- en methylrood-negatief was, citraat-positief, ureum traagproducerend, en niet beweeglijk. In geval van vertraging werden de geïsoleerde bacteriën bij 2-8°C in de voedingsbouillon gehouden gedurende niet meer dan 24 uur tot de antimicrobiële gevoeligheidstest werd uitgevoerd.

2.5. ESBL-detectiemethoden

ESBL-producerende E. coli en K. pneumonia werden eerst gescreend op ESBL-productie met de fenotypische methode en zullen vervolgens worden bevestigd met de fenotypische bevestigingstest volgens de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2014 .

2.5.1. Fenotypische screening op ESBL-productie

De ESBL-screeningtest werd uitgevoerd door de standaard diskdiffusiemethode met ceftazidime (30 µg), cefotaxime (30 µg), en ceftriaxon (30 µg) (Oxoid, UK). Er werden meer dan één antibioticaschijfje gebruikt voor screening om de gevoeligheid van de detectie van ESBL’s te verbeteren, zoals aanbevolen door de CLSI-richtsnoeren 2014 . Vers gegroeide kolonies werden gesuspendeerd in normale zoutoplossing, en de troebelheid van de suspensie werd bijgesteld op 0,5 McFarland’s standaard. Deze suspensie werd met steriele wattenstaafjes op Mueller-Hinton agar (Oxoid, UK) geënt, waarna de drie bovengenoemde antibioticaschijven met een tussenruimte van 20 mm werden geplaatst en bij 35 ± 2°C gedurende 16-18 uur werden geïncubeerd. De isolaten met verminderde gevoeligheid voor cefotaxime (zonediameter van ≤27 mm), ceftazidime (zonediameter van ≤22 mm), en ceftriaxon (zonediameter van ≤25 mm) rond de schijven werden verdacht als ESBLs-producenten .

2.5.2. Fenotypische bevestiging van ESBL-producenten

Bevestiging van vermoedelijke ESBL-producenten werd gedaan door gebruik te maken van de double-disk approximation of double-disk synergy (DDS) methode op Mueller-Hinton agar, zoals aanbevolen door CLSI richtlijnen 2014 . Een schijf amoxicilline + clavulaanzuur (20/10 µg) werd in het midden van de Mueller-Hinton agarplaat geplaatst, en vervolgens werden cefotaxime (30 µg) en ceftazidime (30 µg) op een afstand van 20 mm (hart op hart) van de amoxicilline + clavulaanzuurschijf op dezelfde plaat geplaatst. De plaat werd gedurende 24 uur bij 37oC geïncubeerd en onderzocht op een vergroting of uitbreiding van de remmingszone van het oxyimino-β-lactam door de synergie van het clavulanaat in de amoxicilline-clavulanaatschijf die als positief voor ESBL-productie werd geïnterpreteerd.

2.6. Antimicrobiële gevoeligheidstests

De antimicrobiële gevoeligheidstests werden uitgevoerd met behulp van Kirby-Bauer disc-diffusietechniek op Mueller-Hinton agar volgens de CLSI-richtlijnen 2014 voor de volgende antimicrobiële schijven: amoxicilline/clavulaanzuur (20/10 µg), cefotaxime (30 µg), ceftriaxon (30 µg), ceftazidime (30 µ g), ampicilline (10 µg), cefalothine (30 µg), ciprofloxacin (5 µg), nalidixinezuur (30 µg), norfloxacin (10 µg), gentamycine (10 µg), amikacin (30 µg), tetracycline (30 µg), trimethoprim-sulfamethoxazol (1.25/23,75 µg), imipenem (30 µg), en chlooramfenicol (30 µg) (Oxoid; UK). De selectie van antimicrobiële middelen is afhankelijk van de beschikbaarheid en aanbevelingen van CLSI 2014 . Na overnacht incubatie van de Mueller-Hinton agarplaat met antimicrobiële schijven bij 37°C werd de remmingszone gemeten met behulp van een liniaal en geïnterpreteerd door vergelijking met de Kirby-Bauer grafiek. Controlestammen (K. pneumoniae ATCC 700603 en Escherichia coli ATCC 25922) werden gebruikt om de kwaliteit van de antibioticaschijven te controleren tijdens de antimicrobiële gevoeligheidstests en tijdens ESBL-detectiemethoden.

Multidrugresistentie (MDR) wordt gedefinieerd als resistentie tegen drie of meer klassen antibiotica.

2.7. Analyse van de gegevens

De gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS versie 16.0. Het verschil in categorische variabelen en gevoeligheidspatroon tussen ESBL-producerende en niet-ESBL-producerende groepen werd statistisch geanalyseerd met behulp van chi-kwadraat (Fisher’s exact) test. Odds ratio’s (OR’s) en hun 95%-betrouwbaarheidsintervallen (CI’s) werden berekend, en de waarde <0,05 werd als statistisch significant beschouwd. De bevindingen werden gepresenteerd in tabellen.

3. Resultaten

3.1. Klinische specimens en teruggevonden isolaten

In de huidige studie werden ongeveer 74 (21,6%) van de urinemonsters als positieve urinekweek bevestigd, waarvan 63 (85,1%) E. coli waren en 11 (14,9%) K. pneumoniae. Van de 74 positieve urinekweken werden er 17 (23,0%) positief bevonden voor ESBL-productie. E. coli is verantwoordelijk voor een groot aantal urine-isolaten en een hoger percentage ESBL-productie (13 (76,5%)) dan K. pneumoniae (4 (23,5%)). De meeste bacteriële isolaten en een groter aandeel ESBL-producerende stammen werden geïsoleerd bij vrouwen (12 (70,6%)) dan bij mannen (5 (29,4%)). De gemiddelde leeftijd van de patiënten bij wie ESBL-producenten werden aangetroffen, was 35,07 jaar (±13,30 SD). Van het totaal aantal ESBL-producenten waren er 9 (52.9%) werden geïsoleerd bij patiënten ouder dan 50 jaar (tabel 1).

Patiënten in de ESBL-groep werden verder verdeeld in gezondheidszorg-geassocieerde en community-acquired groepen, en 9 (52,9%) van de ESBL-isolaten werden geïsoleerd van personen die geen geschiedenis van gezondheidszorgcontact hebben (community-acquired), met een hoger aandeel van E. coli, 8 (61,5%) (tabel 1).

3.2. Risicofactoren voor isolaties van ESBL-producerende stammen

In de huidige studie werden verschillende soorten mogelijke risicofactoren geanalyseerd, maar alleen antibioticagebruik van meer dan twee cycli in het voorgaande jaar (OR = 6,238; 95% CI = 1,257-30,957; p = 0.025) en recidiverende UTI meer dan twee cycli in de laatste 6 maanden of meer dan drie cycli in het laatste jaar (OR = 7,356; 95% CI = 1,429-37,867; p = 0,017) werden geïdentificeerd als een onafhankelijke risicofactor voor de verwerving van ESBL-producerende stammen (tabel 2).