Methoden, technieken en protocollen voor immunocytochemie

ICC Main Page > Celfixatie

Om de vrije toegang van het antilichaam tot zijn antigeen te verzekeren, moeten de cellen worden gefixeerd en permeabiliseerd. In het algemeen zijn de fixatiesterktes en -tijden voor cellen aanzienlijk korter dan voor de dikkere, structureel complexe weefselsecties. Voor immunocytochemie bestaat de voorbereiding van het monster hoofdzakelijk in het fixeren van de doelcellen op het objectglaasje. Een perfecte fixatie zou de antigenen immobiliseren, terwijl de authentieke cellulaire en subcellulaire architectuur behouden blijft en de antilichamen ongehinderd toegang krijgen tot alle cellen en subcellulaire compartimenten. Een breed gamma van fixeermiddelen wordt courant gebruikt en de juiste keuze van methode zal afhangen van de aard van het te onderzoeken antigeen en van de eigenschappen van het gebruikte antilichaam. Fixatiemethoden kunnen in het algemeen in twee klassen worden ingedeeld: organische oplosmiddelen en cross-linking reagentia. Organische oplosmiddelen zoals alcoholen en aceton verwijderen lipiden en drogen de cellen uit, terwijl de eiwitten op de celarchitectuur worden neergeslagen. Cross-linking reagentia (zoals paraformaldehyde) vormen intermoleculaire bruggen, gewoonlijk via vrije aminogroepen, waardoor een netwerk van gekoppelde antigenen ontstaat. Cross-linkers behouden de celstructuur beter dan organische solventen, maar kunnen de antigeniciteit van sommige celcomponenten verminderen en vereisen de toevoeging van een permeabilisatiestap om het antilichaam toegang tot het specimen te geven. Fixatie met beide methoden kan eiwitantigenen denatureren, en daarom kunnen antilichamen die tegen gedenatureerde eiwitten zijn bereid, nuttiger zijn voor celkleuring. Er worden verschillende fixatiemethoden beschreven. De geschikte fixatiemethode moet worden gekozen in overeenstemming met de relevante toepassing.

1. Acetonfixatie

  • Fixeer cellen in -20°C aceton gedurende 5-10 minuten.

  • Geen permeabilisatiestap nodig na acetonfixatie.

2. Methanolfixatie

  • Fixeer cellen in -20°C methanol gedurende 5-10 minuten.

  • Geen permeabilisatiestap nodig na fixatie met methanol.

3. Ethanolfixatie

  • Fixeer cellen in gekoelde 95% ethanol, 5% ijsazijn gedurende 5-10 minuten.

4. Methanol-Aceton Fixatie

  • Fixeer in gekoelde methanol, 10 minuten bij -20 °C.

  • Verwijder overtollige methanol.

  • Permeabiliseren met gekoelde aceton gedurende 1 minuut bij -20 °C.

5. Fixatie met methanol-acetonmengsel

  • 1:1 methanol- en acetonmengsel.

  • Maak het mengsel vers en fixeer de cellen gedurende 5-10 minuten bij -20 °C.

6. Fixatie met een mengsel van methanol en ethanol

  • 1:1 mengsel van methanol en ethanol.

  • Maak het mengsel vers en fixeer de cellen bij -20 C gedurende 5-10 minuten.

7. Formalinefixatie

  • Fixeer de cellen in 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 5-10 minuten.

  • Spoel kort met PBS.

  • Permeabiliseren met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten.

8. Paraformaldehyde-Triton Fixatie

  • Fixeer in 3-4% paraformaldehyde gedurende 10-20 minuten.

  • Kort spoelen met PBS.

  • Permeabiliseren met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten.

9. Paraformaldehyde-Methanol Fixatie

  • Fixeer in 4% paraformaldehyde gedurende 10-20 minuten.

  • Spoel kort met PBS.

  • Permeabiliseer met gekoelde methanol gedurende 5-10 minuten bij -20 °C.