Materials

Duloxetine (DLX) van zuivere kwaliteit werd genereus als geschenkmonsters verstrekt door Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) kwaliteiten 100 M, 4CM, en 15 M CR werden genereus ter beschikking gesteld door Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, India. Alle andere laboratoriumchemicaliën en reagentia die in de studie werden gebruikt, waren van analytische reagenskwaliteit. Tijdens het onderzoek werd dubbel gedestilleerd water gebruikt. Polyethyleenglycol 400 werd gekocht bij S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, India. Dinatriumwaterstoffosfaat, kaliumdiwaterstoffosfaat en natriumhydroxide werden gekocht bij CDH Ltd., New Delhi, India. Ethanol, absoluut, werd verkregen van Changshu Yangyuan Chemical, China. n-Octanol werd gekocht van E-Merck (India) Ltd., Mumbai, India. Dialysemembraan150 werd gekocht bij Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai. Alle materialen en poeders werden onder vacuüm bij kamertemperatuur bewaard.

Apparatuur

UV-spectra werden opgenomen op Perkin Elmer lambda 15 UV/zichtbaar spectrofotometer in het UV/zichtbaar bereik van 190 tot 600 nm. Franz-diffusiecelassemblage werd aangeschaft bij Permegear, Inc., USA. Infraroodspectrofotometer FT-IR-8300 werd verkregen van Perkin Elmer PE RX 1 FTIR-spectrofotometer. Differentiële scanning calorimetrie (DSC) spectra werden verkregen met DSC model Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Onderzoekscentrifuge was van REMI Equipments, Mumbai, India. pH-meter CyberScan pH 510 werd aangeschaft bij Eutech Instruments, India.

Preformuleringsstudies

Bereiding van fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7.4

0,19 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 2,38 g dinatriumwaterstoforthofosfaat, en 8,0 g NaCl werd opgelost in gedestilleerd water, en het volume werd met gedestilleerd water aangevuld tot 1000 ml. De pH van de buffer werd aangepast tot 7,4.

Kwantificering van duloxetine hydrochloride

Het gehalte aan duloxetine werd geanalyseerd door UV-spectrofotometrische analyse in fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4. Scanning van de stockoplossing werd uitgevoerd in het UV-bereik van 190 tot 400 nm. De λ max werd verkregen bij een golflengte van 289 nm. Stockoplossing A (250 μ/ml) van duloxetinehydrochloride werd bereid door 0,0250 g van het geneesmiddel op te lossen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) tot 100 ml. Verder werden seriële verdunningen variërend van 1 μg/ml tot 100 μg/ml duloxetine bereid door verdunning van voorraadoplossingen A en B met fosfaatbuffer (pH 7,4). De extinctiewaarden van de verdunningen werden genoteerd bij λ max van DLX, d.w.z, 289 nm tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) als blanco, en de kalibratiekromme werd uitgezet.

Fysisch-chemische karakterisering van duloxetinehydrochloride

Bepaling van het smeltpunt

Een kleine hoeveelheid duloxetinehydrochloride werd in een capillair gebracht (aan één uiteinde gesmolten) en in een smeltpuntapparaat geplaatst, en de smelttemperatuur werd genoteerd. Hiertoe werden drie afzonderlijke metingen verricht, waarvan de gemiddelde waarde werd verkregen.

Bepaling van de verdelingscoëfficiënt

De verdelingscoëfficiënt van duloxetine hydrochloride werd bepaald in octanol-water systeem (Wells 2002). De twee fasen werden in een v/v-verhouding van 1:1 genomen en onderling verzadigd in een waterbadschudapparaat bij 37 °C, waarna de twee fasen werden gescheiden. Tien milligram van het geneesmiddel werd toegevoegd aan een mengsel van 20 ml voorverzadigde organische fase en 20 ml voorverzadigd water en gedurende 10 minuten geschud. De kolven werden vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C bewaard onder herhaaldelijk schudden. Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd om de waterige en niet-waterige fasen te scheiden. De twee fasen werden apart spectrofotometrisch geanalyseerd op duloxetine. De verdelingscoëfficiënt van het geneesmiddel “K o/w” werd vervolgens berekend uit de verhouding van de concentratie van het geneesmiddel in octanol en in de waterige fase.

Drug-polymeer interactiestudies

Fourier-transform-infrarood spectroscopie

Fourier-transform-infrarood spectroscopie (FTIR) werd gebruikt om het zuivere geneesmiddel DLX, het fysische mengsel van DLX en HPMC (15 CR, 100 M, en 4 M), en de met geneesmiddel geladen transdermale patches te analyseren met behulp van KBr pellets methode. Alle monsters werden gescand van 400 tot 4000 cm-1.

Differentiële scanning calorimetrie

Mogelijke interacties tussen het geneesmiddel en het gebruikte polymeer werden geanalyseerd aan de hand van DSC-thermogrammen van het zuivere geneesmiddel duloxetinehydrochloride en de formulering (HPMC + geneesmiddel), verkregen met het DSC-model Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Alle monsters werden verzegeld in aluminium pannen met vlakke bodem en verwarmd over een temperatuurbereik van 25 tot 300 °C bij een stijging van 5 °C/min.

Fabricage van transdermale patches

Transdermale films met duloxetine hydrochloride werden gegoten op glasplaatjes door middel van oplosmiddelverdamping met verschillende kwaliteiten (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) van HPMC in aanwezigheid en afwezigheid van een weekmaker. In alle gevallen werd PEG 400 (5%) als weekmaker gebruikt. Tabel 1 toont de formules en samenstelling voor de verschillende soorten geformuleerde patches. Duloxetinehydrochloride (60 mg) werd opgelost in het oplosmiddelenmengsel water-methanol (7:3). De medicijnmatrix werd bereid door verschillende concentraties (1% en 1,5% w/v) HPMC in hetzelfde oplosmiddelsysteem op te lossen. De oplossing werd gedurende 24 uur ongemoeid gelaten. Vervolgens werd de oplossing met behulp van een injectiespuit en een naald in een glazen ring met een diameter van 5,0 cm op het glasoppervlak gegoten. Het oplosmiddel liet men gedurende 6 uur verdampen in een thermostatisch geregelde oven bij 60 °C. De patches werden vóór gebruik gedurende 7 dagen in een luchtdichte houder onder omgevingsomstandigheden bewaard.

Tabel 1 Formule en samenstelling van geformuleerde transdermale systemen van duloxetine HCl

Evaluatie van transdermale patches

Physische verschijning

Alle bereide patches werden visueel geïnspecteerd op kleur, helderheid, flexibiliteit en gladheid.

Dikte van de pleister

De dikte van de met geneesmiddel beladen pleisters werd gemeten met behulp van een schroefmaat-micrometer op drie verschillende punten op de pleisters. Gemiddelde waarden en standaardafwijkingswaarden van de drie metingen werden berekend voor elke met geneesmiddel beladen patch.

Gelijkmatigheid van gewicht

De patches werden onderworpen aan een gewichtsvariatietest door alle patches te wegen op een digitale weegmachine. De bepalingen werden voor elke formulering in drievoud uitgevoerd. Het gemiddelde gewicht en de standaardafwijking werden dan berekend.

Flatheidsonderzoek

Flatheidsonderzoek werd uitgevoerd om te beoordelen of de bereide transdermale patches een glad oppervlak bezitten en niet zullen vernauwen met de tijd. Drie longitudinale stroken werden op drie verschillende plaatsen uit de film gesneden. De lengte van elke strook werd gemeten en de variatie in lengte als gevolg van niet-uniformiteit in vlakheid werd bepaald door het percentage vernauwing te bepalen, waarbij 0% vernauwing overeenkomt met 100% vlakheid. De procentuele vernauwing werd verkregen als (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Hier is l 1 de aanvankelijke lengte van elke strook en l 2 de uiteindelijke lengte van elke strook.

Vouwduur

Deze test werd uitgevoerd om de efficiëntie van het plastificeermiddel en de sterkte van de met verschillende polymeren bereide patch te controleren. Het vouwgetal wordt gedefinieerd als het aantal vouwen dat nodig is om een polymere pleister te breken. Het vouwgetal is met de hand gemeten door een klein strookje van de folie (2 × 2 cm) herhaaldelijk op dezelfde plaats te vouwen totdat het brak. Het aantal keren dat de pleister op dezelfde plaats kon worden gevouwen zonder te breken/scheuren gaf de waarde van het vouwgetal. Drie patches van elk type werden genomen voor de test.

Percentage vochtabsorptie/waterdampabsorptie

De procentuele vochtabsorptietest werd uitgevoerd om de fysische stabiliteit en integriteit van de films in hoge vochtige omstandigheden te controleren. De bereide films (3,14 cm2) werden afzonderlijk nauwkeurig gewogen en blootgesteld aan 85 ± 5% relatieve vochtigheid in een exsiccator met 100 ml verzadigde kaliumchloride-oplossing bij kamertemperatuur. Gedurende deze periode werden de films met regelmatige tussenpozen van 24, 48 en 72 uur gewogen. Het vochtigheidspercentage werd bepaald aan de hand van de volgende formule:

Vochtigheidspercentage

Deze test werd ook uitgevoerd om de integriteit van de films onder droge omstandigheden te controleren. De afzonderlijke transdermale films (met gespecificeerd oppervlak) werden in een exsiccator met gesmolten watervrij calciumchloride bij kamertemperatuur bewaard. Gedurende deze periode werden de films gewogen met regelmatige tussenpozen van 24, 48 en 72 uur. Het vochtgehalte werd bepaald met behulp van de volgende formule:

Waterdamptransmissie

Waterdamptransmissiesnelheid (WVTR) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid vocht die wordt doorgelaten door een oppervlakte-eenheid van de film in een tijdseenheid. Glazen flesjes met een gelijk volume en gelijke diameter werden gebruikt als transmissiecellen. De cellen werden goed gewassen en gedroogd in een oven. Vervolgens werd ongeveer 1 g watervrij gesmolten calciumchloride in elk flesje gedaan, en de pleister werd met behulp van een plakbandje over de rand van het flesje bevestigd. Deze flesjes werden vervolgens gewogen en in exsiccatoren geplaatst met een verzadigde kaliumchloride-oplossing om de relatieve vochtigheid op 84% te houden. De cellen werden uit de exsiccatoren gehaald en na de 1e, 2e, 3e, 4e, 5e, 6e en 7e dag gewogen. De waterdampdoorlatendheid werd als volgt bepaald:

$$ W.V.T. = WL/S $$

Waarbij W het gewicht van de doorgelaten waterdamp is, L de dikte van de pleister en S de belichte oppervlakte in vierkante centimeter.

Oppervlak pH

Patches werden in contact gehouden met 0,5 ml dubbel gedestilleerd water gedurende 1 uur in glazen buizen en mochten opzwellen. Een gecombineerde glaselektrode werd in de buurt van het oppervlak van de patch gebracht en pH-metingen werden uitgevoerd na een equilibratieperiode van 1 min.

Bepaling van het gehalte aan geneesmiddelen

Uit elk type formulering werden stukjes van 2 × 2 gesneden en in 100 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 gebracht. De inhoud werd gedurende 2 uur magnetisch geroerd. De oplossing werd vervolgens gefiltreerd door Whatman-filtreerpapier (0,45 μ) en naar behoren verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4. De oplossing werd vervolgens geanalyseerd op absorptie bij 289 nm met placebo-patch als blanco. Uit de absorptiewaarden werd het geneesmiddelgehalte bepaald.

In vitro geneesmiddelafgifte

Franz-diffusiecel werd gebruikt voor de in vitro karakterisering van transdermale formuleringen. Dit is een betrouwbare methode voor de voorspelling van het geneesmiddelentransport over de huid van topische formuleringen. Het receptorcompartiment van de diffusiecel werd gevuld met 30,0 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), en in vitro studies van de geneesmiddelafgifte werden uitgevoerd met synthetisch cellofaanmembraan. De bereide formuleringen werden aangebracht op het membraan in het donorcompartiment en gelijkmatig verdeeld over het cellofaanmembraan. De assemblage werd constant op 37,0 ± 2,0 °C bij 50 rpm gehouden. Monsters (aliquots van 1,0 ml) werden vervolgens met geschikte tijdsintervallen (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 en 24 uur) genomen en aangevuld met een hoeveelheid medium om het receptorfasevolume op 30 ml te houden. De monsters werden spectrofotometrisch geanalyseerd bij 289 nm.

Drugpermeatie/ex vivo studies

Drugpermeatiestudies werden uitgevoerd met de huid van mannelijke Wistar-ratten. De ratten werden opgeofferd door dislocatie van de ruggengraat. De huidmonsters werden gesneden, verwijderd en gewassen met normale zoutoplossing. Aanhangend vet en bindweefsel werden verwijderd met een stompe tang. De huid werd gedurende 6 uur in een normale zoutoplossing bewaard. De haren van de huid van de rat werden zorgvuldig geschoren om perifere schade te vermijden. Het receptorcompartiment van de Franz-diffusiecel werd gevuld met 30 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4). De bereide formuleringen werden aangebracht op de huid van de rat in het donorcompartiment. De temperatuur van het geheel werd constant op 37 ± 2 °C gehouden en de roersnelheid werd op 50 rpm geregeld. Monsters (aliquots van 5 ml) werden met geschikte tijdsintervallen (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 en 24 uur) genomen en vervangen door dezelfde hoeveelheid medium om het volume van de receptorfase op 30 ml te houden. De monsters werden spectrofotometrisch geanalyseerd bij λ max van 289 nm.

Studies naar huidirritatie

Ethische goedkeuring voor de behandeling van proefdieren werd verkregen van het Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Panjab University, Chandigarh, en de studies werden uitgevoerd volgens het goedgekeurde protocol.

De albino Wistar ratten werden gehuisvest in kooien, met vrije overmaat aan standaard laboratoriumdieet en water. De dorsale abdominale huid van de ratten werd zorgvuldig geschoren, waarbij perifere schade werd vermeden, vóór 24 uur van het uitvoeren van de studie. De transdermale patch werd op de naakte huid aangebracht en bedekt met een niet-sensibiliserende microporeuze tape. Een 0,8% v/v waterige oplossing van formaline werd aangebracht als standaard huidirritant. De dieren kregen elke dag een nieuwe patch, tot 7 dagen. De formulering werd na 7 dagen verwijderd; de erytheemscore werd genoteerd en vergeleken met de standaard. De score van erytheem werd afgelezen en genoteerd volgens de Draize scoring methode (Draize et al. 1944) als score 0 voor geen erytheem, score 1 voor zeer licht erytheem (lichtroze), score 2 voor goed gedefinieerd erytheem (donkerroze), score 3 voor matig tot ernstig erytheem (lichtrood), en score 4 voor ernstig erytheem (donkerrood).

Gegevensanalyse

Voor het n-de monster is V s het volume van het teruggetrokken monster, V t het totale volume van het receptormedium, C c de gecorrigeerde concentratie, C u de niet-gecorrigeerde concentratie van het n-de monster, en C i de niet-gecorrigeerde concentratie. Verder werd de gecorrigeerde concentratie gebruikt om de waarden van de hoeveelheid vrijgekomen geneesmiddel en het percentage vrijgekomen geneesmiddel op elk bemonsteringstijdstip te berekenen, samen met de afgiftesnelheid van het geneesmiddel.

De permeabiliteitscoëfficiënt is de snelheid van de passage van het geneesmiddel door het membraan/de huid in μg/cm2/h. De permeabiliteitscoëfficiënt werd berekend uit de helling van de grafiek van het percentage getransporteerd geneesmiddel versus de tijd als P = helling × V d/S

Hierbij is V d het volume van de donoroplossing in milliliter, en S de oppervlakte van het weefsel in vierkante centimeter.

De flux (J-waarde) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid materiaal die in een tijdseenheid door een barrière met een eenheidsdoorsnede stroomt. Het wordt berekend door: