Doxycycline Is Anti-Inflammatory and Inhibits Staphylococcal Exotoxin-Induced Cytokines and Chemokines

Staphylococcal toxic shock syndrome toxine 1 (TSST-1) en de structureel verwante exotoxinen zijn bacteriële exotoxinen die zich direct binden aan major histocompatibility complex klasse II moleculen op antigeen-presenterende cellen (1, 5, 8, 18, 23) en T-cellen activeren die specifieke Vβ-elementen tot expressie brengen (7). Deze toxinen worden superantigenen genoemd vanwege hun vermogen om polyklonaal grote populaties T-cellen te stimuleren (1, 4, 7, 14). Staphylococcus exotoxinen (SE) zijn dus krachtige activatoren van het immuunsysteem en veroorzaken een verscheidenheid van ziekten bij de mens, waaronder voedselvergiftiging, toxische shock en auto-immuunziekten (1, 2, 6, 12, 14, 22). Hun interacties met cellen van het immuunsysteem resulteren in een massale productie van ontstekingsbevorderende cytokines en chemokines (1, 4, 15, 17). De cytokines tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), interleukine-1 (IL-1) en gamma-interferon (IFN-γ) zijn belangrijke mediatoren bij door superantigenen geïnduceerde toxische shock (1, 21). Zowel TNF-α als IL-1 hebben krachtige immunostimulerende activiteiten en werken synergetisch met IFN-γ om immuunreacties te versterken en weefselschade te bevorderen (16). Bijgevolg zijn deze cytokinen pathogeen bij hoge concentraties in vivo en zijn ze verantwoordelijk voor koorts en toxische shock veroorzaakt door SE (13, 14, 18, 19).

Doxycycline is een breedspectrum antibioticum dat op grote schaal wordt gebruikt voor infecties veroorzaakt door zowel gram-negatieve als gram-positieve micro-organismen. Het werkt als een bacteriostatisch middel en is zeer effectief tegen veel micro-organismen, waaronder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis, en Yersinia pestis. Doxycycline behoort tot de familie van de tetracycline-antibiotica, waarvan is aangetoond dat de leden onafhankelijk van hun antimicrobiële werking nog andere biologische werkingen hebben (10). Doxycycline remt forbol-12-myristaat-13-acetaat-gemedieerde matrixmetalloproteïnase 8 (MMP-8) en MMP-9 in menselijke endotheelcellen (11). Doxycycline vermindert ook de afbraak van elastine en vermindert de MMP activiteit in een model van aneurismale ziekte (3). Meer recent werd aangetoond dat doxycycline de productie van IL-1β remt in met lipopolysaccharide behandelde hoornvliesepitheelculturen in een mate die vergelijkbaar is met die welke wordt bereikt met corticosteroïden (25). In vivo beschermde doxycycline muizen tegen dodelijke endotoxemie door de cytokine- en nitraatsecretie in het bloed te verlagen (20). Deze studie werd ondernomen om het modulerende effect van doxycycline op stafylokokken superantigen-geïnduceerde T-celactivering en cytokineproductie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) te bepalen.

Menselijke PBMC werden geïsoleerd door Ficoll-Hypaque dichtheidsgradiëntcentrifugatie van gehepariniseerd bloed van normale menselijke donoren. PBMC (106/ml) werden gekweekt bij 37°C in 24-wells-platen met RPMI 1640-medium en 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum. De cellen werden gedurende 16 uur geïncubeerd met SEB (200 ng/ml) of TSST-1 (200 ng/ml), waarna de supernatanten werden geoogst en geanalyseerd op IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α en MIP-1β. Cytokines en chemokines werden gemeten door een enzyme-linked immunosorbent assay met cytokine- of chemokine-specifieke antilichamen volgens de instructies van de fabrikant (15, 17). Humane recombinante cytokines en chemokines (20 tot 1.000 pg/ml) werden gebruikt als standaarden voor kalibratie op elke plaat. De detectiegrens van elke assay was 20 pg/ml. De cytokine- en chemokinegegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde waarde ± de standaardafwijking (SD) van in duplo genomen monsters. Doxycycline, indien aanwezig, werd gelijktijdig met de stimulerende stof toegevoegd. De cytotoxiciteit werd gemeten door het vrijkomen van lactaatdehydrogenase (LDH) uit het cytosol in het kweeksupernatans. LDH werd gekwantificeerd met behulp van een colorimetrische cytotoxiciteit assay kit (Boehringer Mannheim) volgens de instructies van de fabrikant. De maximale hoeveelheid vrij te geven LDH (100%) werd verkregen door de cellen te lyseren met 1% Triton X-100. De T-celproliferatie werd bepaald met PBMC (105/well), die in drievoud werden uitgezet met SEB of TSST-1 (200 ng/ml), met of zonder doxycycline, gedurende 48 uur bij 37°C in 96-well microtiterplaten. Cellen werden gepulst met 1 μCi thymidine (New England Nuclear, Boston, Mass.) per well gedurende de laatste 5 uur van de cultuur zoals eerder beschreven (15). Cellen werden geoogst op glasvezelfilters, en opgenomen thymidine werd gemeten door vloeibare scintillatie. Alle gegevens werden geanalyseerd op significante verschillen door Student’s t-test met Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Verschillen tussen doxycycline-behandelde en onbehandelde controlegroepen werden als significant beschouwd als P <0.05.

Op basis van het rapport dat doxycycline lipopolysaccharide-geïnduceerde IL-1 in epitheelcellen blokkeerde en dodelijke endotoxemie in vivo (20, 25) verhinderde, testten we de hypothese dat dit antibioticum directe effecten op SE-geïnduceerde cytokinen zou kunnen hebben. Zoals aangetoond in Fig. 1, remde doxycycline dosisafhankelijk de productie van de cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α, en IFN-γ en de chemokines MCP-1, MIP-1α, en MIP-1β door PBMC geïncubeerd met SEB. Een soortgelijke dosis-afhankelijke vermindering van cytokines en chemokines door doxycycline werd ook waargenomen voor TSST-1 gestimuleerde PBMC (gegevens niet weergegeven). Het remmende effect van doxycycline op SEB- of TSST-1-gemedieerde cytokines en chemokines verkregen met PBMC van zeven normale donors is samengevat in Fig. 2. De productie van MCP-1 en IFN-γ werd volledig geblokkeerd door 50 μM doxycycline. Deze concentratie doxycycline verminderde IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α, en MIP-1β tot respectievelijk 15 tot 22%, 37 tot 41%, 21 tot 25%, 10 tot 15%, en 59 tot 61% van die van onbehandelde, SEB- of TSST-gestimuleerde cellen. TNF-β, indien aanwezig, werd ook geremd tot 25% van dat van onbehandelde, met SEB gestimuleerde cellen. Doxycycline was bij deze concentratie niet cytotoxisch voor PBMC, zoals gemeten door de uitsluiting van trypanblauw en het ontbreken van lactaatdehydrogenase-afgifte uit behandelde cellen. Volledige remming van deze cytokines en chemokines werd waargenomen bij hoge doses doxycycline (>0,1 mM). Vergelijkbare dosis-respons remming door doxycycline werd waargenomen bij lagere concentraties SEB (1 en 10 ng/ml) (gegevens niet weergegeven).

Omdat superantigenen ook T-cel proliferatie veroorzaken, werd het effect van doxycycline op SE-geïnduceerde T-cel proliferatie onderzocht. Figuur 3 toont aan dat doxycycline de SEB- en TSST-1-gestimuleerde T-celproliferatie op een dosisafhankelijke manier remde, waarbij 98% remming werd bereikt bij 0,05 mM.

Deze studie toonde aan dat doxycycline de superantigeen-gemedieerde productie van cytokinen en chemokinen door menselijke PBMC’s in vitro effectief remde. T-cel proliferatie geïnduceerd door staphylococcal superantigenen werd ook volledig onderdrukt. Downregulatie van proinflammatoire cytokines en chemokines door doxycycline in SEB- en TSST-1 gestimuleerde PBMC suggereerde dat doxycycline de pathofysiologie van toxische shock kan beïnvloeden. Deze bevindingen breiden de waarnemingen van andere onderzoekers uit van de immunomodulerende effecten van doxycycline naast zijn antimicrobiële activiteiten.

Meerdere moleculaire mechanismen, zowel transcriptioneel als posttranscriptioneel, kunnen betrokken zijn bij de anti-inflammatoire effecten van doxycycline (11, 26). De onderdrukking van pro-inflammatoire cytokinen kan de downregulatie van de PKC-route door doxycycline impliceren, zoals gesuggereerd door een studie van de effecten op granuloomvorming (26). De gerapporteerde remmende dosis doxycycline (10 tot 15 μM) die collagenase, gelatinase en andere metalloproteïnasen in vitro vermindert (10, 11) is vergelijkbaar met die gebruikt in deze studie en is vele malen hoger dan die waargenomen in menselijk serum na orale toediening van 200 mg per dag (10, 24). Klinische studies tonen echter aan dat deze dosis voldoende was om de collagenase en gelatinase activiteiten in menselijke osteoartritische kraakbeenextracten ex vivo te verminderen (24). Van een subantimicrobiële dosis doxycycline (20 mg tweemaal daags) is aangetoond dat deze de collagenaseactiviteit in gingivavloeistof remt (9). Bovendien bleek uit in vivo studies van experimentele endotoxemie ook dat doxycycline en andere tetracyclines effectief zijn in het down-reguleren van ontstekingsbevorderende cytokines en het voorkomen van shock (20).

In conclusie, de hier gepresenteerde resultaten geven aan dat doxycycline pro-inflammatoire cytokines en chemokines down-reguleert, wat suggereert dat het mogelijk nuttig is voor de behandeling van superantigen-geïnduceerde toxische shock. In een klinische setting waarin de gastheer wordt blootgesteld aan meerdere biologische agentia, waaronder zowel bacteriën als bacteriële exotoxinen, biedt het gebruik van doxycycline het extra voordeel dat het zowel antimicrobiële als anti-inflammatoire effecten heeft.