ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSIS VAN ALPHA-1-ANTITRYPSINE DEFICIENCY DOOR DNA-ANALYSE BIJ KINDEREN MET LIVER DISEASE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 en Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Achtergrond – Alfa-1-antitrypsinedeficiëntie is een genetische aandoening die in een co-dominante, autosomale vorm wordt overgedragen. Alpha-1-antitrypsinedeficiëntie tast vooral de longen en de lever aan, wat in het laatste geval leidt tot neonatale cholestase, chronische hepatitis of levercirrose. Een precieze diagnose van Alpha-1-antitrypsinedeficiëntie kan verkregen worden door biochemische of moleculaire analyse. Doelstelling – Het doel van deze studie was om met behulp van DNA-analyse de aanwezigheid van een alfa-1-antitrypsinedeficiëntie te onderzoeken bij 12 kinderen die verdacht werden van het hebben van deze deficiëntie en die laboratorium- en klinische kenmerken van de ziekte vertoonden. Patiënten en Methoden – Twaalf patiënten, in de leeftijd van 3 maanden tot 19 jaar, die serum alfa-1-antitrypsine-spiegels hadden die lager waren dan normaal en/of een leveraandoening met een niet nader omschreven etiologie hadden, werden onderzocht. De mutant allelen S en Z van het alfa-1-antitrypsine gen werden onderzocht bij de 12 kinderen. De organisatie van het alfa-1-antitrypsine gen werd geanalyseerd door amplificatie van het genoom door middel van de polymerase kettingreactie en ontsluiting met de restrictie-enzymen Xmnl (S allel) en Taq 1 (Z allel). Resultaten – Zeven van de 12 patiënten hadden chronische leverziekte van onbepaalde etiologie en de andere vijf patiënten hadden lage serumspiegels van alfa-1-antitrypsine en een diagnose van neonatale cholestase en/of chronische leverziekte van onbepaalde etiologie. Vijf van de 12 patiënten waren homozygoot voor het Z allel (ZZ) en twee hadden het S allel met een ander allel (*S) verschillend van Z. Conclusie – Deze resultaten tonen aan dat alfa-1-antitrypsine deficiëntie relatief frequent voorkomt bij kinderen met chronische leverziekte van onbepaalde etiologie en/of lage alfa-1-antitrypsine spiegels (41,6%). Een juiste diagnose is belangrijk voor een effectieve klinische follow-up en voor genetische counseling.

HEADINGS ¾ Alpha-1-antitrypsine deficiëntie. Moleculaire diagnose. Leverbiopsie.

INTRODUCTIE

Alfa-1-antitrypsine (A1AT) is een glycoproteïne van 52 kDa die hoofdzakelijk wordt geproduceerd door hepatocyten die 2 g van dit eiwit, per dag, afgeven in de bloedstroom(36). De belangrijkste functie van A1AT is het remmen van de werking van neutrofiele elastase, een serine protease die elastine vezels in de longen hydrolyseert(38). Mutaties in het gen dat codeert voor A1AT produceren een eiwit zonder remmende capaciteit en kunnen leiden tot de accumulatie van A1AT in inclusie lichaampjes in hepatocyten, waardoor de normale serumspiegels van dit eiwit dalen(4). Deze deficiëntie uit zich in longemfyseem, chronische bronchitis of bronchiëctasie(9). De accumulatie van gemuteerd A1AT in hepatocyten kan ook leiden tot neonatale cholestase, chronische hepatopathie of cirrose(33, 34).

Het A1AT-gen is sterk polymorf, co-dominant en bevindt zich op de langere arm van chromosoom 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Vijfenzeventig allelen (aangeduid als A-Z overeenkomstig hun isoeletrische punten) zijn beschreven voor dit gen op basis van iso-elektrische focussering van serum tussen pH 4 (anode) en pH 5 (kathode) in polyacrylamide gels. De gangbare varianten migreren naar het midden van de gel en behoren daarom tot de M (“midden”) familie. Een deficiënte variant, oorspronkelijk beschreven door LAURELL en ERIKSSON in 1963(21), migreert naar de kathode en wordt aangeduid als Z. Een andere variant, die langzaam in de gel beweegt, wordt aangeduid als S(5). Deze polymorfe “locus” is algemeen bekend als het Pi (protease inhibitor) systeem. De meeste varianten produceren A1AT van normale hoeveelheid en kwaliteit(7, 8, 25). Echter, sommige allelen zoals de varianten S en Z zijn geassocieerd met een deficiënte conditie die polymorfe frequenties bereikt als Kaukasische populaties en gevallen van een null allel waarin eiwit productie totaal afwezig is zijn gerapporteerd(10).

Het S allel resulteert uit de substitutie van adenine door thiamine in exon III van het gen, wat leidt tot de vervanging van glutaminezuur op positie 264 door valine en de daaruit voortvloeiende vorming van een onstabiele eiwitstructuur(10, 11, 19). Het Z-allel is het gevolg van de vervanging van guanine op positie 342 door adenine in exon V van het gen en leidt tot de vorming van een eiwit dat zich verzamelt op de binnenste ruwe oppervlakte van het endoplasmatisch reticulum van de hepatocyt(6). De diagnose van een deficiënte toestand wordt gewoonlijk gesteld na kwantificering van de serumspiegels van het eiwit samen met een elektroforetisch profiel na iso-electrische focussering(23, 37). Een nauwkeuriger diagnose vereist gen-analyse met behulp van DNA-gebaseerde technieken(12, 14, 26).

Het doel van deze studie was om S en Z allel dragers te identificeren bij patiënten die verdacht werden van het hebben van deze deficiëntie en die laboratorium en klinische kenmerken van deze ziekte vertoonden.

PATIËNTEN EN METHODEN

Patiënten

In de periode van februari 1988 tot augustus 1997 werd een groot aantal patiënten verwezen naar de Pediatrische Gastroenterologische Dienst, Staatsuniversiteit van Campinas, Campinas, SP, Brazilië, om leverziekten te onderzoeken. Van dit aantal vertoonden slechts 12 patiënten geen definitieve diagnose (negatieve resultaten voor virale hepatitis, auto-immune hepatitis en de ziekte van Wilson). Deze patiënten werden onderworpen aan een moleculaire analyse van A1AT.

Methodes

1 ¾ Studieprotocol

2 – Leverbiopsie

Percutane leverbiopsies werden verkregen zoals beschreven door MOWAT(24) met behulp van lokale anesthesie bij patiënten die minstens 4 uur gevast hadden, met venoclyse en normale protrombine activiteit. Het verkregen fragment werd onmiddellijk in 10% formaline geplaatst en vervolgens bewerkt en gekleurd met hematoxyline-eosine, trichromie van Masson, Pruisisch blauw en zilver impregnatie van de reticulum vezels. Een speciale kleuring werd verkregen met PAS (Periodic acid-Schiff) gevolgd door behandeling met diastase. De persistentie van eosinofiel lijkende cytoplasmakorrels, zelfs na gebruik van diastase, werd als positief voor A1AT-deficiëntie beschouwd.

3 – Moleculaire analyse

Om de mutante allelen S en Z van het A1AT te onderzoeken, werd een DNA-extractie van perifere bloedleukocyten uitgevoerd volgens de methode beschreven door WOODHEAD et al.(39).

RESULTATEN

Vijf van de 12 bestudeerde kinderen waren Z homozygoot (ZZ) terwijl twee van de kinderen het S allel hadden samen met een ander allel dat niet Z was (*S). Tabel 1 toont de leeftijd van de patiënt op het moment van de bloedafname en de indicatie op basis waarvan werd besloten voor verdere analyse. Drie van de patiënten vertoonden neonatale cholestase als een eerste manifestatie van chronische hepatopathie.

Tabel 2 toont de serumspiegels van ALT, AP, gGT, A1AT alsook de resultaten van de moleculaire studie en de leverbiopsie.

De vijf patiënten met het ZZ-genotype hadden verlaagde serum A1AT-spiegels en de leverbiopsie toonde cirrose (één), neonatale hepatitis (twee), een pauciteit van interlobulaire galwegen (één) en chronische hepatitis (één). In dit laatste geval (FSP) werden eosinofiel lijkende cytoplasmakorrels gezien in periportale hepatocyten na kleuring met HE en posterior bevestigd door PAS-positiviteit en diastase-resistentie (figuur 1). De twee patiënten met neonatale cholestase (EKBA en RHBP) ondergingen een leverbiopsie toen ze respectievelijk 10 weken en 13 weken oud waren, en vertoonden eosinofiele PAS-positieve, diastase-resistente bolletjes.

Figuren 2 en 3 tonen de resultaten van de amplificatie en de digestie van de S- en Z-allelen, respectievelijk.

DISCUSSIE

Alpha-1-antitrypsine-deficiëntie is een van de meest voorkomende genetische aandoeningen die leidt tot leverziekte bij kinderen en het is de meest voorkomende genetische ziekte waarvoor levertransplantatie nodig is(17, 28). A1AT deficiëntie treft 1 op de 1600-2000 pasgeborenen in Noord-Amerika en Noord-Europa(28, 31), maar slechts 10-15% van de bevolking met deze deficiëntie ontwikkelt leverziekten(32, 33). Volgens een studie gepubliceerd door SVEGER in 1988(33), ontwikkelen 11% van de patiënten met het PIZZ fenotype tijdens de neonatale periode icterische hepatitis. In deze studie hadden drie patiënten met een A1AT-deficiëntie neonatale cholestase en bij twee van hen werd, voordat een definitieve diagnose van de deficiëntie was vastgesteld, de cholestase als idiopathisch beschouwd. Vijf tot 10 procent van de gevallen van idiopathische neonatale hepatitis die in de literatuur worden gemeld, worden veroorzaakt door een A1AT-deficiëntie(3).

Bij vijf onderzochte patiënten met deze deficiëntie waren de serumspiegels van A1AT onder de normale ondergrens. Deze test bevestigde echter niet absoluut de diagnose van de ziekte. Aangezien A1AT een eiwit is van de acute ontstekingsfase, neemt de synthese ervan toe in inflammatoire/infectieuze omstandigheden, neoplasie, zwangerschap en tijdens therapie met oestrogenen en corticosteroïden(16, 22). Een verlaging van de serumspiegels van A1AT treedt op bij het ademhalingsangst syndroom van pasgeborenen, in de terminale fase van leverfalen, bij cystische fibrose en in situaties waarin er een groot eiwitverlies is(15). De serumspiegels in SZ genotypes, die theoretisch tot leverziekten zouden kunnen leiden, zijn gewoonlijk normaal.

Wanneer neonatale cholestase aanwezig is, is het fundamenteel noodzakelijk een differentiële diagnose te stellen met extrahepatische biliaire atresie. De klinische anamnese maakt een adequate diagnose mogelijk in 83% van de gevallen(1) en er zijn specifieke onderzoeken nodig om de nauwkeurigheid van de diagnose te verbeteren. Van deze onderzoeken is de leverbiopsie van groot belang. De histopathologische veranderingen die gezien worden in de leverbiopsie van patiënten met A1AT deficiëntie kunnen dezelfde zijn als die waargenomen bij idiopathische neonatale hepatitis of in gevallen van extrahepatische biliaire atresie(24). De aanwezigheid van overwegend periportale, intrahepatocysteuze globulen die sterk PAS-positief zijn na diastase digestie is een nuttige aanwijzing voor A1AT deficiëntie(13, 18, 27). Het is echter moeilijk om deze bolletjes te identificeren vóór de 12e week na de geboorte(35). In deze studie had patiënt EKBA bolletjes met de bovenstaande kenmerken in leverweefsel op de leeftijd van 10 weken. Bij patiënt JCI (13 weken oud) werden dergelijke bolletjes niet gezien. Deze resultaten suggereren dat de aanwezigheid van globules moet worden onderzocht met een speciale kleuring in leverfragmenten die vóór de leeftijd van 12 weken zijn verkregen, hoewel een negatief resultaat de mogelijkheid van A1AT-deficiëntie niet uitsluit. Biochemische analyse werd in deze studie niet gebruikt omdat DNA-analyse, die nauwkeuriger is, mogelijk was.

Een A1AT-deficiëntie komt relatief vaak voor bij kinderen met een leveraandoening van ongedefinieerde etiologie. Deze diagnose wordt onderschat, waarschijnlijk omdat onnauwkeurige diagnostische methoden worden gebruikt. Moleculaire analyse levert een preciezere diagnose op en kan ook nuttig zijn voor de genetische counseling van patiënten met leverziekte van onbekende etiologie.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. De belangrijkste klinische verschijnselen zijn acometimento pulmonar e hepático. Dit laatste manifesteert zich als colestase neonatale, hepatite crônica of cirrose. De definitieve diagnose wordt gesteld door biochemische analyse van alfa-1-antitrypsine of moleculaire analyse. Doelstelling – Onderzoek, in een groep van 12 kinderen met een vermoeden van deficiência van alfa-1-antitripsina, naar de aanwezigheid van deficiência door middel van DNA-analyses voor een definitieve diagnose en naar de relatie tussen alfa-1-antitripsine-deficiência en de klinische en laboratoriumkenmerken die men aantreft. Casuïstiek en Methoden – Mutant allelen S en Z van het alfa-1-antitrypsine gen werden onderzocht bij 12 patiënten met leeftijden variërend van 3 maanden tot 19 jaar, verwezen door de polikliniek voor kindergastro-enterologie van de Universidade Estadual de Campinas, SP, Brazilië, voor het presenteren van serum alfa-1-antitrypsine niveaus lager dan normaal en/of leverziekte zonder gedefinieerde etiologie. De DNA-analyse werd uitgevoerd met de gemodificeerde polymerase-kettingreactie-genamplificatiemethode die restrictieplaatsen creëert voor de enzymen Xmnl (S-allel) en Taq l (Z-allel). Resultaten – Van de 12 verwezen patiënten hadden 7 chronische leverziekte zonder gedefinieerde etiologie en de andere 5 hadden lage serum alfa-1-antitrypsine doses vergezeld van een diagnose van neonatale cholestase en/of chronische leverziekte van onbekende etiologie. In deze groep van 12 patiënten werden vijf homozygote Z (ZZ) patiënten waargenomen en twee droegen het S allel vergezeld van een ander allel, verschillend van Z (*S). Conclusie – Deze resultaten tonen aan dat A1AT-deficiëntie een relatief frequente etiologie is bij kinderen die zich presenteren met chronische leverziekte zonder gedefinieerde etiologie en/of lage serum A1AT-dosering (41,6%). Het belang van een zekere diagnose van de deficiëntie is gerechtvaardigd, niet alleen voor de klinische follow-up van de patiënt, maar ook in termen van genetische counseling.

DESCRITOREN ¾ Alpha-1-antitrypsine deficiëntie. Moleculaire diagnose. Lever biopsie.

1. Alagille D. Cholestasis in de eerste drie maanden van het leven. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Moleculaire basis van alfa-1-antitrypsine-deficiëntie. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumulatie van PiZ alfa-1-antitrypsine veroorzaakt leverschade in transgene muizen. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. DNA restrictie fragmenten geassocieerd met alfa 1-antitrypsine wijzen op een enkele oorsprong voor deficiëntie allel PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Het alfa 1-antitrypsine gen en zijn mutaties. Clinical consequences and strategies for therapy. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Alpha-1-antitrypsine deficiëntie veroorzaakt door het alpha-1-antitrypsine Nullmattawa gen. Een insertiemutatie die het gen voor alfa-1-antitrypsine ongeschikt maakt voor de productie van alfa-1-antitrypsine. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Rapid DNA analysis of alpha 1-antitrypsin deficiency: application of an improved method for amplifying mutated gene sequence. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopathological features of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturing gradient gel electrophoresis of the alpha 1-antitrypsin gene: application to prenatal diagnosis. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serum enzyme inhibitor concentrations in the respiratory distress syndrome. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatic morphology in inherited metabolic diseases. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Assignment of the alpha 1-antitrypsin gene and a sequence-related gene to human chromossome 14 by molecular hybridization. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effect of administration of a combined strogen-progestin contraceptive on the level of individual plasma proteins. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alpha 1-antitrypsine: moleculair en het Pi-systeem. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Rapid nonradioactive detection of mutations in the human genome by allele-specific amplification. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Klinische manifestaties van alfa 1-antitrypsine-deficiëntie. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gen da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alpha-1-antitrypsine deficiëntie. High prevalence in the St. Louis area determined by direct population screening. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency detected by screening of 200,000 infants. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Leverziekte bij zuigelingen. Histological features and relationship to alpha 1-antitrypsin phenotype. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Human plasma proteinase inhibitors. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alpha 1-antitrypsine deficiëntie: een overzicht. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Replacement therapy deficiency associated with emphysema. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studie uitgevoerd door de afdelingen Pediatrie, Medische Genetica, Anatomische Pathologie en Klinische Pathologie van de Faculteit der Medische Wetenschappen (FCM), Staatsuniversiteit van Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazilië.

1 Postdoctoraal student. Afdeling Kindergeneeskunde, FCM/UNICAMP.

2 Assistent Professor. Afdeling Klinische Pathologie, FCM/UNICAMP.

3 Assistent Professor. Afdeling Anatomische Pathologie, FCM/UNICAMP.

4 Doctoraat in de Genetica (Instituut voor Biologie), UNICAMP.

5 Assistent Professor. Afdeling Medische Genetica, FCM/UNICAMP.

6 Assistent hoogleraar. Afdeling Kindergeneeskunde, FCM/UNICAMP.