ORIGINAL PAPERS

Hepatitis B surface antigen detection using pooled sera. A cost-benefit analysis

E. Fernández, L. Rodrigo1, S. García, S. Riestra1 and C. Blanco

Dienst Biochemie. Ziekenhuis de Cabueñes. Gijón. 1Dienst Gastro-enterologie. Ziekenhuis Central de Asturias. Oviedo. Spanje

correspondentie

ABSTRACT

Doelstellingen: de haalbaarheid onderzoeken en een kosten-batenanalyse uitvoeren van een poolingstrategie van 5 monsters met behulp van een enzyme immunoassay (EIA) voor de screening van hepatitis B-oppervlakte-antigeen (HBsAg).
Materiaal en methoden: om de gevoeligheid en specificiteit van de pooling-methode te beoordelen, werden elk van de 40 positieve sera (van zwak tot sterk HBsAg-positief) en 250 negatieve sera getest in een pool met 4 HBsAg-negatieve sera. De aantoonbaarheidsgrens voor HBsAg/ad en HBsAg/ay werd geëvalueerd met gebruikmaking van sera van een panel van gezuiverde subtypes. Een studie onder reële omstandigheden werd uitgevoerd met gebruikmaking van pools van 340 zwangere vrouwen.
Resultaten: de gevoeligheid en specificiteit van deze techniek waren 100%. De correlatiecoëfficiënt tussen de monster/cutoff-ratio’s van 40 monsters onderzocht in enkelvoudige en in gepoolde omstandigheden was 0,792 (p < 0,005). De pooling-methode heeft lagere detectieniveaus voor HBsAg/ad en HBsAg/ay met respectievelijk 0,20 ng/mL en 0,12 ng/mL, en de enkelvoudige methode met respectievelijk 0,34 ng/mL en 0,29 ng/mL. De pooling-methode verliest geen gevoeligheid voor waarden tot 100 IE/L van anti-HB’s in de vier sera vermengd met een positief serum. De kosten-batenanalyse toonde aan dat de poolingmethode een besparing van 30% tot 75% van de kosten van de HBsAg-bepaling kon opleveren, naargelang de seroprevalentie respectievelijk 10% of 1% bedroeg.
Conclusies: de gepoolde HBsAg EIA leverde geen slechtere resultaten op dan de enkelvoudige EIA-test, en was een kosteneffectieve en valide strategie in gebieden met een hoge, gemiddelde of lage prevalentie.

Key woorden: Hepatitis B oppervlakte-antigeen. Samenvoegen van sera. Kosten-batenanalyse.

Rodrigo L, Fernández E, García S, Riestra S, Blanco C. Hepatitis B surface antigen detection using pooled sera. Een kosten-batenanalyse. Rev Esp Enferm Dig 2006; 98: 112-121.

Introductie

Hepatitis B virus (HBV) infectie is een ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft. Het belangrijkste reservoir is dat van chronische HBV-dragers. Naar schatting zijn ongeveer 300 miljoen mensen in de hele wereld met dit virus besmet (1). De medische gevolgen van HBV-infectie zijn zowel variabel als onvoorspelbaar, afhankelijk van factoren zoals de leeftijd van de patiënt en zijn immuunstatus. HBV is een algemeen erkend etiologisch agens voor chronische hepatitis, levercirrose, en hepatocellulair carcinoom.

Er bestaan echter grote verschillen in de prevalentie van de infectie, en dit heeft geleid tot de vaststelling van drie grote gebieden van hoge, gemiddelde, en lage endemiciteit (2). In de meeste ontwikkelde landen is de prevalentie van chronische HBV-dragers minder dan 2% en vindt de infectieoverdracht vooral plaats bij volwassenen die tot bepaalde risicogroepen behoren (drugsgebruikers, homoseksuele mannen, promiscue heteroseksuelen, gezondheidswerkers) (3). In Spanje werd een prevalentie van HBV-dragers van 1,2% vastgesteld (4) en de identificatie van HBsAg bij bloeddonors, zwangere vrouwen en personen die autotransfusieprogramma’s ondergaan, is verplicht.

De serumpoolingtechniek tracht de kosten te drukken zonder aan doeltreffendheid in te boeten en wordt vooral in ontwikkelingslanden gebruikt bij het zoeken naar antilichamen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) (5-14) en tegen het hepatitis C-virus (HCV) (15-19). De met deze methode verkregen resultaten zijn veelbelovend gebleken, aangezien zij de kosten van laboratoriumtests aanzienlijk hebben verminderd zonder hun gevoeligheid significant te verminderen.

De huidige studie tracht na te gaan of de serumpoolingtechniek toepasbaar is bij de opsporing van HBsAg om de factoren op te helderen die de gevoeligheid ervan kunnen wijzigen, en om een kosten-batenanalyse voor deze diagnosetechniek uit te voeren.

Materiaal en methoden

HBsAg-bepaling

De Imx HBsAg-assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), dat een kwalitatieve derde-generatie microdeeltjes Enzyme Immunoassay (EIA) is, werd gebruikt voor HBsAg-bepaling. De aan- of afwezigheid van HBsAg wordt bepaald door de mate van fluorescerende productvorming te vergelijken met een cutoff, die wordt berekend op basis van de negatieve calibrator (N) (menselijk plasma dat niet reactief is voor HBsAg). De Imx HBsAg-assay berekent een verhouding tussen de snelheid van het monster (S) en de negatieve kalibratiesnelheid. De afkapwaarde (S/N) werd vastgesteld op 2 voor de EIA met één serum.

De pooling-techniek wordt uitgevoerd door 200 mcL toe te voegen aan de pool, d.w.z. door een mengsel te verkrijgen van 40 mcL van elk van de 5 sera die samen de pool vormen (verdunning 1/5). De cutoff werd vastgesteld als het gemiddelde voor negatieve monsters plus 3 standaardafwijkingen, hetgeen dus een waarde oplevert van 1. Er wordt dus van uitgegaan dat in deze groep van 5 een niet-reactief monster aanwezig is wanneer de S/N-coëfficiënt < cutoff-waarde bedraagt, terwijl een S/N-pool > cutoff kan wijzen op de aanwezigheid van ten minste één reactief monster. In dat geval moeten de afzonderlijke monsters opnieuw worden getest om het reactieve monster (de reactieve monsters) te identificeren. Alle tests worden in duplo uitgevoerd.

In overeenstemming met het bovenstaande werd de specificiteit geëvalueerd door HBsAg-beoordeling in 50 pools van 250 negatieve sera. Om de gevoeligheid te berekenen, werden 40 sera met dezelfde concentratieverdeling als de algemene populatie waaruit zij werden bemonsterd, getest in een pool met 4 negatieve sera.

HBsAg-subtypes (ad en ay)

De aantoonbaarheidsgrens van Imx HBsAg voor ad en ay werd geëvalueerd met gebruikmaking van sera van een panel van gezuiverde HBsAg-subtypes (hepatitis HBsAg-gevoeligheidspanel, Abbott Laboratories). HBsAg/ad- en HBsAg/ay-concentraties varieerden van respectievelijk 0,13 tot 2,32 ng/mL en van 0,21 tot 2,24 ng/mL. De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald in enkelvoudige en in een pool met 4 HBsAg-negatieve sera.

Invloed van anti-HBs niveau

Om na te gaan of het bestaan van anti-HBs antilichamen in de met de gepoolde test bestudeerde sera HBsAg zou kunnen neutraliseren en de gevoeligheid van de techniek zou kunnen verstoren, pasten wij de methode toe van het samenvoegen van een serum met een bekende concentratie van HBsAg/ad en HBsAg/ay met vier sera met bekende titers van anti-HBs.

De kwantitatieve bepaling van anti-HBs werd uitgevoerd met een microparticle Enzyme Immunoassay (mEIA) methode met behulp van een AxSYm auto-analyzer (AxSYmTM AUSAB, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Sera met hoge anti-HBs titers werden verkregen van post-gevaccineerde HBV-controles en patiënten die hersteld zijn van hepatitis B.

Pool-test in screening van HBsAg

Om de validiteit van pool-testen te beoordelen, werd een simulatie van veldoperaties uitgevoerd met behulp van de bovenstaande methode op 1.525 serummonsters verkregen van zwangere vrouwen in een eerdere studie van ons om de prevalentie van HCV-infectie te schatten, en waarvan de monsters sinds de verzameling bij -20 ºC waren bewaard. Hieruit selecteerden wij willekeurig 300 negatieve HBsAg-monsters en 14 positieve HBsAg-monsters. De bepalingen werden uitgevoerd zonder voorafgaande kennis van de poulesamenstellingen.

Vermindering van het aantal tests

Wanneer een poule positief is, moet elk bestanddeel afzonderlijk opnieuw getest worden om het monster of de monsters te identificeren die HBsAg-positief zijn. Hoe groter dus het aantal positieve pools (d.w.z. de prevalentie van HBsAg), hoe kleiner de vermindering van het aantal uitgevoerde tests.

Op deze basis werd de procentuele vermindering van het aantal tests bij gebruik van gepoolde sera voor screening op HBsAg berekend onder de meest ongunstige en onwaarschijnlijke omstandigheden (lage prevalentie), d.w.z. wanneer niet meer dan één positief serum in een van de pools aanwezig was. Bijvoorbeeld, bij een HBsAg-seroprevalentie van 2% zullen, indien 100 sera in 20 pools worden geanalyseerd, 2 daarvan positief zijn. Er moeten dus 10 bepalingen (10 individueel hergeteste sera) worden toegevoegd aan de 20 oorspronkelijke bepalingen (20 pools), wat in totaal 30 bepalingen oplevert. In dit voorbeeld kan 70% van de kosten worden bespaard. Om een kosten-batenanalyse uit te voeren, werd de prijs van HBsAg-tests geraamd op 3 US dollar per monster. Dit is gebaseerd op de gemiddelde werkelijke prijs van de commerciële kit in ons ziekenhuis.

Statistische analyse

Gegevens werden verzameld in een database en later geanalyseerd met behulp van het statistisch pakket SPSS voor Windows, Release 10.0. De niet-parametrische lineaire correlatie van Spearman werd gebruikt. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Een niveau van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Geen van de 50 pools van HBsAg-negatieve sera was positief (S/N pool > 1), en de volgende waarden van S/N pool werden verkregen: 0,767 ± 0,076 (bereik 0,67-0,88). Met dit monster was de specificiteit van deze pooling-techniek dus 100%. Anderzijds leverden alle 40 HBsAg-positieve sera, wanneer ze in gepoolde vorm werden bepaald, S/N-waarden op die groter waren dan 1 (waarbij de gevoeligheid eveneens 100% bedroeg). De correlatiecoëfficiënt tussen de S/N-ratio’s voor deze 40 monsters zoals onderzocht in enkelvoudige en in gepoolde vorm was 0,792 (p < 0,05).

Zesentwintig komma zes procent van de pools met monsters met hoge HBsAg-titers hadden een S/N-ratio die zelfs groter was dan het enkelvoudige monster. De correlatiecoëfficiënt van monsters met lage HBsAg-titers (S/N single < 25, n = 12) was echter uitstekend (R = 0,9739, p < 0,05), zoals kan worden gezien (Fig. 1).

De aantoonbaarheidsgrens met behulp van de enkelvoudige methode was 0.34 ng/mL voor het ad-subtype en 0,29 ng/mL voor het ay-subtype, terwijl bij de pooling-methode lagere antigeenniveaus werden gedetecteerd: respectievelijk 0,20 ng/mL en 0,12 ng/mL. De resultaten van toepassing van de enkelvoudige en gepoolde technieken op sera met verschillende concentraties HBsAg/ad en HBsAg/ay worden getoond (Fig. 2).

Wanneer de anti-HBs titer in de pool minder dan 100 IU/L bedraagt, verliest de techniek zijn gevoeligheid niet; zelfs wanneer anti-HBs titers 10.000 IU/L bereiken, is de techniek nog steeds in staat HBsAg concentraties zo laag als 1,5 ng/mL aan te tonen. De invloed van de verschillende concentraties anti-HBs op de aantoonbaarheidsgrens voor HBsAg-subtypen bij gebruik van de pooling-methode worden gepresenteerd (gemiddelde van 2 bepalingen) (Fig. 3).

In het onderzoek dat onder reële omstandigheden werd uitgevoerd in de sera van zwangere vrouwen, resulteerde de pooling-methode in de juiste classificatie van alle geanalyseerde monsters. Bijgevolg bedroegen de sensitiviteit en de specificiteit 100%.

Er is een afname van het percentage van vermindering van het aantal tests dat met de pooling-methode wordt bereikt naarmate de seroprevalentie van HBsAg toeneemt. Men kan zien dat zelfs bij HBsAg-prevalenties van 10% in de onderzochte steekproef een minimale besparing van ten minste 30% wordt bereikt (fig. 4).

Uit de analyse van de economische voordelen van de serumpooling-strategie blijkt dat de bereikte besparingen afhangen van zowel de prevalentie van HBsAg als het aantal uit te voeren bepalingen. Voor landen met een lage prevalentie, zoals het onze, verlaagt de pooling-methode dus de testkosten voor HBsAg. Wij hebben bijvoorbeeld geschat dat bij 2.500 bepalingen die gedurende één jaar in een laboratorium worden verricht met gebruikmaking van de pooling-methode, de besparing 5.630 US dollar zal bedragen, en in het geval van een zeer druk ziekenhuis dat jaarlijks 20.000 bepalingen verricht, zal de besparing oplopen tot 45.000 US dollar (tabel I).

Discussie

Een benadering van de pooling-methode is de verdunning en het eindvolume van het reactiemengsel in elke gepoolde test te handhaven om de gevoeligheid niet te verliezen, waarvoor het verdunningsmiddel wordt verminderd en gedeeltelijk wordt vervangen door de extra sera. Op die manier is het niet nodig de afkapwaarde te wijzigen ten opzichte van de standaardmethode in geïndividualiseerde monsters. De in onze studie gebruikte methode was echter geautomatiseerd en de verdunning van de monsters werd uitgevoerd door een auto-analysator. Daarom vertoont elk monster een verdunning van 1 op 5 wanneer het wordt gemengd met de andere 4 sera. Daarom was het in onze studie nodig de afkapwaarde te wijzigen en het aantal sera in de pool te beperken om de gevoeligheid niet te verliezen.

Wat de specificiteit betreft, moet worden opgemerkt dat de gemiddelde waarde voor de pools slechts iets meer dan 3 standaardafwijkingen van de afkapwaarde bedroeg. In ongeveer 1% van de gevallen kan dus een vals-positief resultaat worden verwacht. Wij denken dat dit aanvaardbaar is, aangezien de specificiteit bijna 100% (99,9%) bedraagt. Een studie met een groter aantal negatieve monsters van een groot aantal verschillende personen zal nodig zijn om de ware specificiteit van deze test vast te stellen.

Hoewel de correlatie tussen testen met één monster en met een mengmonster goed is, snijdt de regressielijn de X-as af bij een S/N-verhouding van 3 (de overeenkomstige Y-waarde is 1). Dit kan betekenen dat elk monster met een signaal-ruisverhouding tussen 2 en 3 in de enkelvoudige monstertest een waarde onder 1 zou hebben en daarom in de gepoolde test niet zou worden gedetecteerd.

Voor een prevalentie van 1% HBsAg-positieve sera werd met een door Liu et al. (19) beschreven mathematisch model de maximale vermindering (80,5%) van het aantal tests bereikt voor een poolgrootte van 11 sera. Naar onze mening kan echter een probleem ontstaan met de specificiteit door het effect van pooling op het vals-positief percentage. Een toename van niet-specifieke proteïnen, als gevolg van de menging van sera, kan aanleiding geven tot een toename van de achtergrondkleur. Met de voor onze studie gekozen poolgrootte van 5, en de wijziging van de afkapwaarde van 2 naar 1, werden geen verliezen in gevoeligheid (vals-negatieven) of specificiteit (vals-positieven) waargenomen.

De resultaten van de huidige studie tonen aan dat de techniek van het poolen van sera voor de opsporing van HBsAg zeer gevoelig en specifiek is, en ook aanzienlijke economische besparingen mogelijk maakt. Deze bevindingen zijn vergelijkbaar met die welke werden verkregen door andere onderzoekers die de methode van pooling toepasten op de studie van HCV en HIV-infectie (5-19). Tot op heden zijn slechts twee studies (20,21) gerapporteerd over de toepassing van de pooling-methode bij de studie van HBV-infectie. In een van deze (20), uitgevoerd bij het uitvoeren van routinematige prenatale screening op hepatitis B door het testen van 10 monsterpools, vonden de auteurs een lage prevalentie van chronische dragers (0,43%), en concluderen dat dit een kosteneffectieve methode en een geldige strategie is in gebieden met een lage seroprevalentie, met een verlaging van de gevoeligheid geschat op 4,2%. De toepassing in onze studie van de pooling-methode op zwangere vrouwen, onder wie de prevalentie van chronische dragers van HBsAg 0,93% bedraagt, toonde een sensitiviteit en specificiteit van 100% aan.

De verdeling van de twee belangrijkste subtypes van HBsAg (ad en ay) in onze omgeving is ongeveer 50% voor elk, waarbij ay frequenter voorkomt bij drugsverslaafden die de parenterale route gebruiken (22). Wij hebben aangetoond dat de pooling-methode de gevoeligheid verbetert, d.w.z. de detectielimiet verlaagt van een immunoassay die gebruikt wordt voor de bepaling van de twee voornaamste HBsAg-subtypes. Met onze pooling-techniek kunnen hoeveelheden van slechts 0,20 ng/mL HBsAg/ad, en 0,12 ng/mL HBsAg/ay worden gedetecteerd, zelfs lager dan die welke met de standaardmethode worden verkregen. De bevinding van verhoogde gevoeligheid met pooltesten is niet verrassend, aangezien dit ook door andere auteurs is gemeld (16). Het is belangrijk om de gevoeligheid van de EIA-kit die voor de pooltest wordt gebruikt te beoordelen, omdat niet alle kits geschikt kunnen zijn voor het screenen van pools, zoals is aangetoond in het geval van antilichamen tegen het hepatitis C-virus (23,24).

De aanwezigheid van anti-HB’s in de poolsera zou de gevoeligheid van de techniek kunnen wijzigen, maar alleen op significante wijze bij titers hoger dan 10.000 IE/mL, die alleen worden waargenomen in monsters van post-vaccinatie controleonderzoeken; in deze situatie is de bepaling van HBsAg niet geïndiceerd. In feite vonden Cunninghan et al. (20) dat slechts 4,5% van de mengsels van sera van zwangere vrouwen een anti-HBs titer groter dan 7.500 IU/L hadden. Rekening houdend met deze beperking van de gevoeligheid van de pooling-methode, vonden zij dat deze ook ongeveer 100% in gevoeligheid en specificiteit bedroeg. Onze resultaten zouden reproduceerbaar kunnen zijn in andere gebieden met een lage prevalentie, maar zij zouden eerder moeten worden aangetoond in gebieden met een hoge endemiciteit voor HBV. In deze gebieden is de meerderheid van de bevolking al geïmmuniseerd tegen dit virus, en het is mogelijk dat de in sera gevonden anti-HBs titers licht verhoogd zijn.

Rabenau et al. (21) onderzochten de veiligheid van serologische tests in plasmapools voor HBsAg met behulp van een EIA-systeem dat vergelijkbaar is met het onze. In hun studie werd de detectie van HBsAg beïnvloed door de aanwezigheid van lage anti-HBs titers na 5 uur incubatie. Na dissociatie van het immuuncomplex was HBsAg echter nog steeds aantoonbaar in de pool, zelfs in aanwezigheid van hoge anti-HBs titers. In onze studie tonen we aan dat alleen een significante afname in gevoeligheid resulteert voor anti-HBs titers hoger dan 10.000 IU/L. Deze verschillen kunnen te wijten zijn aan het feit dat in ons geval monsters werden getest zonder voorafgaande incubatie. Dit zou de neutralisatie van het antigeen door immunocomplexvorming kunnen verhinderen.

Wij geloven daarom dat zowel de titer van anti-HBs in serum als de verwerking van monsters met EIA vóór de test de gevoeligheid van de pooling-methode kunnen beïnvloeden. Elk laboratorium dat deze techniek wenst toe te passen, moet rekening houden met deze twee factoren vóór algemeen gebruik.

De WHO beveelt het gebruik van de serumpooling-methode aan in geval van HIV-infectie, wanneer de prevalentie van de ziekte minder dan 2% bedraagt, en met een maximum pooling van 5 sera (25). Volgens deze aanwijzingen passen de meeste studies poolingtechnieken toe in gebieden met een lage seroprevalentie en bevelen zij het gebruik ervan aan. In onze studie tonen wij aan dat het poolen van sera ook kosteneffectief kan zijn in populaties met een hoge prevalentie van HBsAg-dragers. Dit zou het gebruik ervan mogelijk kunnen maken in landen die behoren tot gebieden met een gemiddelde en hoge endemiciteit voor HBV-infectie, wat in het algemeen samenvalt met onderontwikkelde of ontwikkelingslanden, d.w.z. landen die een grotere behoefte hebben aan vermindering van de economische kosten van laboratoriumtests. Niettemin zullen in deze gebieden soortgelijke studies moeten worden verricht om onze resultaten te bevestigen. Er is echter reeds aangetoond dat in landen zoals Kenia, waar de frequentie van HIV-infectie hoog is (7,3%), de toepassing van pooling voor de opsporing ervan een economische besparing van 62% zou opleveren zonder significant verlies van veiligheid (14). In Spanje, een land dat behoort tot een gebied met een lage endemie voor HBV-infectie, en met een frequentie van HBsAg-dragers in de algemene bevolking van 1,2% (4), kan het worden gebruikt in al die groepen waar screening op HBsAg momenteel verplicht is (zoals bloeddonors, personen die autotransfusieprogramma’s ondergaan, screening van zwangere vrouwen).

De kosten-batenstudie van de toepassing van technieken voor het opsporen van chronische dragers van HBV maakt het mogelijk aan te tonen dat de economische besparingen groter zijn bij een groot aantal bepalingen in groepen met een lage seroprevalentie, en het gebruik ervan zou ook kosteneffectief kunnen zijn in gebieden met een hoge prevalentie van infectie, en zelfs in laboratoria die een klein aantal bepalingen uitvoeren. Wij hebben economische kostenbesparingen aangetoond naar gelang van zowel de verschillende HBsAg-prevalentie als het aantal jaarlijks uit te voeren tests. In ons gebied zou de toepassing van de pooling-methode een besparing van ongeveer 74% van de totale economische kosten kunnen opleveren in vergelijking met de enkelvoudige methode.

Sommige onderzoekers zijn onlangs begonnen met het beoefenen van strategieën voor de opsporing van virale nucleïnezuren in bloeddonors met behulp van polymerase kettingreactie (PCR) om de veiligheid bij de transfusie van bloedderivaten te vergroten (26-29). Aangezien het wegens economische problemen en de hoeveelheid werk niet mogelijk is individuele screenings uit te voeren, wordt nu de methode gebruikt waarbij monsters van serologisch negatief bloed worden samengevoegd. Deze procedure kan de veiligheid van het bloed vergroten door een systematische screening van bloeddonaties tegen betrekkelijk lage kosten. Aangezien een van de belangrijkste beperkingen bij de toepassing van deze methoden economisch van aard is, denken wij dat er met onze studie een theoretische basis kan worden gelegd voor het gebruik van screening op HBV-, HCV- en HIV-infecties in twee fasen tegen betrekkelijk lage economische kosten. In de eerste fase zou een commerciële EIA kunnen worden toegepast op een pool van donorsera; in de tweede fase zou de toepassing van PCR-technieken op een pool van seronegatieve monsters de veiligheid van de analyse kunnen verhogen. Totdat toekomstige studies de waarde van deze techniek bij bloeddonors kunnen aantonen, menen wij dat deze alleen kan worden toegepast voor diagnostische en epidemiologische tests.

Wij concluderen dat de toepassing van EIA op gepoolde sera een gevoelige en specifieke methode is bij de opsporing van de twee voornaamste HBsAg-subtypes in een gebied met een lage seroprevalentie. De gevoeligheid neemt alleen af wanneer in de gepoolde sera zeer hoge titers anti-HBs voorkomen. De pooling-techniek is een methode die ook financiële besparingen kan opleveren indien zij wordt toegepast bij het onderzoek van populaties met een hoge prevalentie van HBsAg-dragers. Wij menen dat verdere studies nodig zijn om deze bevindingen te bevestigen.

Acknowledgements

Wij danken David H. Wallace (lid van de European Association of Science Editors en de Council of Biological Editors) voor de Engelse vertaling van het manuscript.

1. Maynard JE. Hepatitis B: global importance and need for control. Vaccine 1990; 8 (Supl.): 18s-20s.

2. Margolis HS, Alter MJ, Hadler SC. Hepatitis B: evolving epidemiology and implications for control. Sem Liver Dis 1991; 11: 84-92.

3. Alter MJ, Mast EE. The epidemiology of viral hepatitis in the United States. Gastroenterol Clin North Am 1994; 23: 437-55.

4. Suárez A, Riestra S, Navascués CA, et al. Positive HBsAg blood donors in Asturias (Spain): current prevalence and its significance. (Engl abstract). Med Clin (Barcelona) 1994; 102: 329-32.

5. Emmanuel JC, Basset MT, Smith HJ, Jacobs JA. Pooling of sera for human immunodeficiency virus (HIV) testing: an economical method for use in developing countries. J Clin Pathol 1988; 41: 582-5.

6. Kline RL, Brothers TA, Brookmeyer R, et al. Evaluation of human immunodeficiency virus seroprevalence in population surveys using pooled sera. J Clin Microbiol 1989; 27: 1449-52.

7. Cahoon-Young B, Chandler A, Livermore T, et al. Sensitivity and specificity of pooled versus individual sera in a human immunodeficiency virus antibody prevalence study. J Clin Microbiol 1989; 27: 1893-5.

8. Frosner GG, Dobler G, von Sonnenburg FJ. Cost reduction of unlinked testing for anti-HIV by investigation of pooled sera. AIDS 1990; 4: 73-5.

9. Behets F, Bertozzi S, Kasali M, et al. Sucessful use of pooled sera to determine HIV-1 seroprevalce in Zaire with development of cost-efficiency models. AIDS 1990; 4: 737-41.

10. Monzon OT, Paladin FJ, Dimaandal E, et al. Relevantie van antilichaamgehalte en testformaat bij HIV-testen van gepoolde sera. AIDS 1992; 6: 43-8.

11. Tamashiro H, Maskill W, Emmanuel J, et al. Reducing the cost of HIV antibody testing. Lancet 1993; 342: 87-90.

12. Perriens JH, Magazani K, Kapila N, et al. Use of a rapid test and an ELISA for HIV antibody screening of pooled serum samples in Lubumbashi, Zaire. J Virol Methods 1993; 41: 213-21.

13. 13. McMahon EJ, Fang C, Layug L, Sandler SG. Pooling blood donor samples to reduce the cost of HIV-1 antibody testing. Vox Sang 1995; 68: 215-9.

14. Verstraeten T, Farah B, Duchateau L, Matu R. Pooling sera to reduce the cost of HIV surveillance: a feasibility study in a rural Kenyan district. Trop Med Int Health 1998; 3: 747-50.

15. Kamel MA, Ghaffar YA, Wasef MA, et al. High HCV prevalence in Egyptian blood donors. Lancet 1992; 340: 427.

16. Neil AGS, Conradie JD. Low cost anti-HCV screening of blood donors. Lancet 1992; 340: 1096.

17. Fernández E, Riestra S, García S, Rodríguez S. Pool tests for detection of hepatitis C virus infection. J Hepatol 1995; 23: 236.

18. García Z, Taylor L, Ruano A, et al. Evaluation of a pooling method for routine anti-HCV screening of blood donors to lower the cost burden on blood banks in countries under development. J Med Virol 1996; 49: 218-22.

19. Liu P, Shi ZX, Zhang YC, et al. A prospective study of a serum-pooling strategy in screening blood donors for antibody to hepatitis C virus. Transfusion 1997; 37: 732-6.

20. Cunningham R, Northwood JL, Kelly CD, et al. Routine antenatal screening for hepatitis B using pooled sera: validation and review of 10 years experience. J Clin Pathol 1998; 51: 392-5.

21. Rabenau H, Schutz R, Berger A, et al. How accurate is serologic testing of plasma pools for hepatitis B virus surface antigen, anti-human immunodeficiency virus 1 and 2, and anti-hepatitis C virus? (Engl abstract). Infus Transfus 1996; 23: 124-30.

22. Echevarría JE, León P, López JA, et al. HBsAg subtype distribution among different populations of HBsAg carriers in Spain. Eur J Epidemiol 1995; 11: 39-45.

23. Neill AGS, Conradie JD. Pool tests for hepatitis C virus. Lancet 1994; 343: 738.

24. Liu P, Shi ZX, Zhang YC, Zhang XY. Comparative study on 4 EIA kits for screening antibody to hepatitis C virus in pooled sera. Biomed Environ Sci 1998; 11: 75-80.

25. Recommendations for testing for HIV antibody on serum pool. WHO Weekly Epidemiol Rec 1991; 44: 316-27.

26. Lefrere JJ, Coste J, Defer C, et al. Screening blood donations for viral genomes: multicenter study of real-time simulation using pooled samples on the model of hepatitis C virus RNA detection. Transfusion 1998; 38: 915-23.

27. Yerly S, Pedrocchi M, Perrin L. The use of polymerase chain reaction in plasma pools for the concomitant detection of hepatitis C virus and HIV type 1 RNA. Transfusion 1998; 38: 908-14.

28. Schottstedt V, Tuma W, Bunger G, Lefevre H. PCR voor HBV, HCV en HIV-1 ervaringen en eerste resultaten van een routinescreeningprogramma in een grote bloedtransfusiedienst. Biologicals 1998; 26: 101-4.

29. Morandi PA, Schockmel GA, Yerly S, et al. Detection of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA in pools of sera negative for antibodies to HIV-1 and HIV-2. J Clin Microbiol 1998; 36: 1534-8.