Trp53-Null- und R270H-Mutationsallele haben vergleichbare Auswirkungen auf die Regulierung von Invasion, Metastasierung und Genexpression bei der Dickdarmtumorentstehung von Mäusen

Missense- und Null-Trp53-Mutationen fördern das Fortschreiten des Dickdarmtumors von Mäusen in CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) Mäusen

Um ein Maus-Darmtumormodell zu entwickeln, das durch Gendefekte ausgelöst wird, wie sie bei menschlichen Darmtumoren häufig vorkommen, haben wir mutierte Mäuse erzeugt, die ein floxiertes Apc-Allel (Apcflox, 580S, abgekürzt als A), das durch die Cre-Rekombinase-Funktion inaktiviert werden kann, und ein floxiertes, latent onkogenes Kras-Allel (KrasLSL-G12D, abgekürzt als K), das durch Cre-Rekombination aktiviert werden kann. Mit Hilfe des CDX2P-CreERT2-Transgens und einer TAM-Behandlung zur Aktivierung der Cre-Funktion in Dickdarm-Epithelzellen haben wir die Apc- und Kras-Allele im Epithel des distalen Ileums, des Zökums und des Dickdarms gezielt aktiviert. Während CDX2P-CreERT2 K-Mäuse ein serriertes und hyperplasisches Dickdarmepithel aufweisen, hatten die CDX2P-CreERT2AK (AK)-Mäuse ein serriertes und hyperplastisches Dickdarmepithel und entwickelten außerdem durchschnittlich 13 Adenome mit einer Größe von 0,5 mm bis 2 mm, als die Mäuse 10-15 Monate nach der TAM-Behandlung den humanen Endpunkt erreichten (Abb. 1a). Bei sechs von 10 AK-Mäusen fanden wir ein oder zwei Adenokarzinome, die im Zökum entstanden. Von den insgesamt acht Adenokarzinomen, die bei den 10 untersuchten AK-Mäusen gefunden wurden, drangen sieben Tumore in die Muscularis propria (MP) oder tiefer ein und fünf erreichten die Subserosa oder Serosa (Abb. 1b, Tabelle 1 und ergänzende Tabelle 1). Da jedoch nur 8 von 131 beobachteten Tumoren in den AK-Mäusen invasiv waren, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass neben Apc- und Kras-Mutationen zusätzliche somatische Defekte für die Entwicklung invasiver Kolontumoren in den AK-Mäusen erforderlich waren.

Missense- und Null-Trp53-Mutationen fördern die Entwicklung von Dickdarmtumoren in CDX2P-CreERT2-Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK)-Mäusen. a Kaplan-Meier-Überlebenskurven von CDX2P-CreERT2AK (AK)-Mäusen (n = 10, medianes Überleben = 336 Tage), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+)-Mäusen (n = 16, medianes Überleben = 166 Tage), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) Mäuse (n = 16, medianes Überleben = 97 Tage) und CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) Mäuse (n = 20, medianes Überleben = 88 Tage). TAM wurde täglich über zwei Tage verabreicht, wobei der Zeitpunkt Null den zweiten dieser Tage darstellt. Die P-Werte wurden mit dem Log-Rank-Test für die folgenden Vergleiche ermittelt: P = 1,4E-6 für AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 für AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 für AKP270/fl vs. AKP270/+. b Prozentualer Anteil der Dickdarmtumoren mit unterschiedlichen Invasionstiefen von AK-Mäusen, AKP270/+-Mäusen, AKPfl/fl-Mäusen und AKP270/fl-Mäusen. Die Daten beziehen sich auf mehrere Läsionen pro Maus (n = 10-14 Mäuse pro Gruppe). P-Werte, die auf exakten Fisher-Tests und exakten Poisson-Tests basieren, sind in Tabelle 1 bzw. in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Die Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts. A Adenom, SM Submukosa, MP Muskularis propria, SS Subserosa, S Serosa. c, d Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) von repräsentativen invasiven Tumoren aus dem proximalen Kolon (rechts) und Zökum (links) für AKP270/fl-Mäuse (c) und AKPfl/fl-Mäuse (d). Die Tumore in (c) und (d) wurden 3 Monate nach der TAM-Injektion entnommen. Bilder mit hoher Vergrößerung sind in den unteren Feldern zu sehen und werden in den unteren vergrößerten Bereichen in den entsprechenden oberen Feldern umrahmt. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenze zwischen Muskelschicht und Subserosa. Skalenbalken: 500 μm für das Bild mit geringer Vergrößerung (obere Felder); 100 μm für Bilder mit hoher Vergrößerung (untere Felder)

Wie bereits erwähnt, finden sich TP53-Mutationen in etwa 60 % der menschlichen CRCs und scheinen während der Adenom-Karzinom-Progression selektiert zu werden. Wir wollten die Zusammenarbeit der Trp53-Inaktivierung mit Apc- und Kras-Mutationen bei der Progression von Dickdarmtumoren in vivo bewerten und feststellen, ob potenzielle GOF-Effekte eines Trp53-Fehlsensemutanten-Allels im Modell beobachtet werden können. Wir führten ein konstitutives Trp53R270H-Mutationsallel (das murine Äquivalent des menschlichen R273H, bezeichnet als P270) und/oder ein bedingtes Null-Allel Trp53flox (bezeichnet als Pfl) in das AK-Modell ein. Es wurden Mäuse mit zusammengesetzten Genotypen erzeugt, deren Abkürzungen wie folgt lauten: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+ Mäuse), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl Mäuse) und CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl Mäuse). Kohorten von erwachsenen AKP270/+-, AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäusen wurden durch TAM-Behandlung zu Dickdarmtumoren angeregt und ihr Gesundheitszustand wurde überwacht. Im Vergleich zu AK-Mäusen (medianes Überleben = 336 Tage) hatten die AKP270/+, AKP270/fl und AKPfl/fl-Mäuse eine deutlich verkürzte Lebenserwartung. Die AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäuse hatten eine mediane Überlebenszeit von 88 bzw. 97 Tagen, während die AKP270/+-Mäuse eine mediane Überlebenszeit von 166 Tagen hatten (Abb. 1a). Die AKP270/+-Mäuse hatten eine signifikant längere Überlebenszeit als AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäuse (P < 0,0001 für jede Maus im Vergleich zu AKP270/+-Mäusen), aber es wurde kein statistisch signifikanter Überlebensunterschied beim Vergleich von AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäusen festgestellt (Abb. 1a). Die Hinzufügung der Trp53-Mutation(en) (R270H oder null) erhöhte die Gesamttumorinzidenz im Vergleich zu AK-Mäusen signifikant (P < 0,0001 sowohl für AKPfl/fl als auch für AKP270/fl im Vergleich zu AK-Mäusen, siehe ergänzende Tabelle 1 unten links). AKP-Mäuse hatten auch mehrere Dickdarm- und Blinddarmtumore, die invasive Merkmale aufwiesen (7,3 und 8,9 invasive Tumore pro Maus bei AKPfl/fl-Mäusen bzw. AKP270/fl-Mäusen) im Vergleich zu AK-Mäusen (0,8 invasive Tumore pro Maus; Abb. 1b und ergänzende Tabelle 1 oben rechts, P < 0,0001 für AKPfl/fl vs. AK und AKP270/fl). AKP270/fl vs. AK).

Eine eingehende Analyse des Zökum- und Dickdarmgewebes der Mäuse, das bei der Nekropsie entnommen wurde, definierte die umfangreiche Tumorlast in den Mäusen AKP270/+, AKPfl/fl und AKP270/fl, wobei die Läsionen von Adenomen bis hin zu Adenokarzinomen im Spätstadium reichten (Abb. 1b-d und Tabelle 1). Alle untersuchten AKP270/+-, AKPfl/fl- und AKP270/fl-Mäuse wiesen mindestens ein Adenokarzinom auf (Tumore mit Submukosa oder tieferer Invasion). Hinweise auf eine Invasion in die glatte Muskulatur und in einigen Fällen in die Serosa fanden sich sowohl im Zökum als auch in den proximalen Dickdarmregionen der AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäuse (Abb. 1c bzw. d). Bei den AKP270/+-Mäusen, bei denen die Cre-gezielten Epithelzellen zunächst ein funktionelles Wildtyp-Trp53-Allel behalten, war die Latenzzeit für die Tumorentwicklung länger, und die Gesamttumorlast (18,5 pro Maus) sowie der Prozentsatz der Tumoren mit tieferer Invasion (11.9 %) waren im Vergleich zu AKP270/fl- oder AKPfl/fl-Mäusen signifikant niedriger (ergänzende Tabelle 1 und Tabelle 1, P < 0,01 im Vergleich zu AKP270/fl- oder AKPfl/fl-Mäusen für die Tumorlast pro Maus und den Anteil der Adenokarzinome). Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass Wildtyp-p53 eine Tumorsuppressorfunktion bei der Kolontumorigenese hat, selbst im Zusammenhang mit einer Trp53-Missense-Mutation. Beim Vergleich aller beobachteten Tumoren zwischen AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäusen stellten wir fest, dass der Anteil der Adenokarzinome mit Submukosa- oder tieferer Invasion bei AKP270/fl-Mäusen höher war als bei AKPfl/fl-Mäusen (36,9 % bzw. 26,1 % bei AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäusen; Tabelle 1, P = 0,0026), was auf einen möglichen bescheidenen GOF-Effekt des R270H Trp53-Allels bei der Verstärkung der Gewebeinvasion hindeutet. Der bescheidene Anstieg des invasiven Potenzials bei AKP270/fl-Mäusen kann jedoch ausgeglichen werden, da die durchschnittliche Tumorlast pro Maus bei AKPfl/fl-Mäusen tendenziell höher war als bei AKP270/fl-Mäusen (28,0 vs 24,2 pro Maus, P = 0.054; ergänzende Tabelle 1), und die AKPfl/fl- und AKP270/fl-Mäuse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Inzidenz von Adenokarzinomen (7,3 vs. 8,9 Adenokarzinome pro Maus, ergänzende Tabelle 1 oben rechts, P = 0,16). Darüber hinaus wurde sowohl bei AKP270/fl- als auch bei AKPfl/fl-Mäusen eine Invasion einiger Tumoren in die Muskularis propria, Subserosa oder Serosa beobachtet (Abb. 1b und Tabelle 1). Da sich nur etwa 30 % der Tumoren von AKP270/fl- oder AKPfl/fl-Mäusen während des Studienzeitraums zu Adenokarzinomen entwickelten, sind neben Apc-, Kras- und Trp53-Defekten wahrscheinlich weitere somatische Veränderungen für die Entstehung von Karzinomen in den AKP-Mäusen entscheidend.

Tumorhistologie und Metastasierung in AKP270/fl- oder AKPfl/fl-Mäusen

Jede der AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäuse entwickelte ein oder mehrere Adenokarzinome, bis die humanen Endpunkte erreicht waren. Bei AKP270/fl-Mäusen wiesen mehr als 80 % der Adenokarzinome gut bis mäßig differenzierte Merkmale auf, mit Tumorknospung/Sprossenbildung an der Invasionsfront und gelegentlicher Muzinsekretion (Abb. 2a, oben). Etwa 15-20 % der AKP270/fl-Adenokarzinome waren schlecht differenziert und wiesen eine solide Morphologie vom Trabekeltyp auf (Abb. 2a, Mitte). Seltene Siegelringzellkarzinome wurden bei AKP270/fl-Mäusen beobachtet (Abb. 2a, unten). Bei AKPfl/fl-Mäusen waren etwa 50 % der Adenokarzinome gut bis mäßig differenziert und wiesen eine Muzinsekretion auf (Abb. 2b, oben); die übrigen waren schlecht differenziert (Abb. 2b, unten). In invasiven AKP270/fl- und AKPfl/fl-Tumoren wurde eine starke nukleäre und zytoplasmatische Färbung von β-Catenin festgestellt (Abb. 2, Mitte), was auf eine gestörte Wnt-Signalübertragung infolge einer Apc-Inaktivierung hindeutet. In AKP270/fl-Tumorzellen wurde eine starke Kernfärbung für p53 beobachtet. In AKPfl/fl-Tumorzellen wurde erwartungsgemäß keine p53-Färbung festgestellt (Abb. 2, rechts).

Histologische Typen von Kolonadenokarzinomen aus p53-mutierten Mäusen. H&E-Färbungen (linke Tafeln) und immunhistochemische Färbungen für β-Catenin (mittlere Tafeln) und p53 (rechte Tafeln) sind für unabhängige Kolontumore repräsentativer histologischer Typen von AKP270/fl-Mäusen (a) und AKPfl/fl-Mäusen (b) dargestellt. Die Tumore wurden 3 Monate nach der TAM-Induktion entnommen. Skalenbalken: 50 μm

Bei der Nekropsie wurden bei 3 von 13 AKPfl/fl-Mäusen und 5 von 14 AKP270/fl-Mäusen Lymphknotenmetastasen gefunden (Tabelle 2). Unter den drei AKPfl/fl-Mäusen, die jeweils eine Metastase in einem abdominalen Lymphknoten aufwiesen, hatte eine Maus auch mehrere Metastasen in der Lunge und eine andere Maus mehrere Metastasen in der Leber (Tabelle 2). Von den fünf AKP270/fl-Mäusen, die jeweils eine Metastase in einem abdominalen Lymphknoten aufwiesen, hatte eine Maus mehrere Metastasen in der Lunge und eine weitere Maus hatte sowohl in der Lunge als auch in der Leber metastatische Läsionen (Tabelle 2). Bei AK- oder AKP270/+-Mäusen wurden keine metastatischen Läsionen gefunden (Tabelle 2). Unsere Daten deuten darauf hin, dass Mäuse-CRCs mit Missense- oder Null-Mutationen in Trp53 spontane Lymphknoten- und Fernmetastasen mit vergleichbarer Häufigkeit hervorrufen können, was gegen einen GOF-Effekt für Missense-Trp53-Mutationen bei der Verstärkung der Metastasierung in unserem Maus-CRC-Modell spricht.

Epithelial-mesenchymaler Übergang in metastatischen CRCs mit Missense- oder Null-Trp53

In den einzelnen Lymphknotenmetastasen, die in fünf verschiedenen AKP270/fl-Mäusen gefunden wurden, zeigten vier Läsionen mäßig differenzierte Adenokarzinome und eine Läsion war schlecht differenziert (Abb. 3a, b, oben). 3a, b, obere Felder). Alle mäßig differenzierten Lymphknotenmetastasen wiesen eine starke nukleäre β-Catenin-Färbung sowie eine starke Membranfärbung für E-Cadherin und eine fehlende Vimentin-Färbung auf (Abb. 3a), was auf die Beibehaltung epithelialer Eigenschaften in AKP270/fl-Metastasen hinweist, die mäßig differenzierte Merkmale aufwiesen. In der einen AKP270/fl-Maus, bei der die Lymphknotenmetastase schlecht differenzierte Merkmale aufwies, wurden auch in der Lunge, der Leber und dem Blinddarm Adenokarzinom-Läsionen mit schlecht differenzierter Morphologie gefunden (Abb. 3b und ergänzende Abb. 1). Die schlecht differenzierte Zökumläsion und die metastatischen Läsionen zeigten eine starke nukleäre β-Catenin-Färbung und einen Verlust der E-Cadherin-Expression sowie eine starke Vimentin-Expression, was mit den Merkmalen der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) übereinstimmt (Abb. 3b und ergänzende Abb. 1). Alle metastatischen Läsionen in AKP270/fl-Mäusen wiesen eine positive CDX2-Färbung auf (ergänzende Abb. 2), was auf ihren kolonalen epithelialen Ursprung hindeutet.

Kolonabgeleitete metastatische Tumoren mit Trp53-Missense-Mutationen können eine epithelial-mesenchymale Transformation (EMT) durchlaufen. Mikroskopische Aufnahmen von H&E-gefärbten Schnitten, die die Lymphknoten- und Lungenmetastasen von zwei repräsentativen AKP270/fl-Mäusen zeigen (a, b, obere Felder). Immunhistochemische Färbungen zeigen eine starke nukleäre Expression von β-Catenin, eine starke membranständige Expression von E-Cadherin und eine fehlende Vimentin-Expression für die mäßig differenzierten Läsionen, die in einer repräsentativen Maus gefunden wurden (a, untere drei Felder). Im Gegensatz dazu zeigen die schlecht differenzierten Läsionen einer anderen Maus (b) eine starke nukleäre Expression von β-Catenin, einen Verlust der E-Cadherin-Expression und eine starke Expression von Vimentin, was darauf hinweist, dass die metastatischen Läsionen dieser Maus eine EMT durchlaufen haben (b, untere drei Felder). Die repräsentativen Mikroaufnahmen von H&E-gefärbten Schnitten wurden zur Orientierung mit schwacher Vergrößerung gezeigt; die seriellen Schnitte wurden einer immunhistochemischen Färbung unterzogen und der umrahmte Bereich mit Färbungen für β-Catenin, E-Cadherin und Vimentin wurde mit starker Vergrößerung gezeigt. Skalenbalken: 20 μm für alle Bilder

Zwei der drei Lymphknotenmetastasen von tumortragenden AKPfl/fl-Mäusen waren mäßig differenziert und eine war schlecht differenziert (Abb. 4a, b, obere Felder). Die AKPfl/fl-Maus mit Lebermetastasen hatte eine mäßig differenzierte Lymphknotenmetastase. In dieser Maus mit Lebermetastasen zeigten sowohl das mutmaßliche primäre Kolonadenokarzinom als auch die Lymphknoten- und Lebermetastasen eine starke nukleäre Expression von β-Catenin und eine starke membranständige Expression von E-Cadherin (ergänzende Abb. 3). Bei der einzelnen AKPfl/fl-Maus mit einer schlecht differenzierten Lymphknotenmetastase wurden auch in der Lunge mehrere Läsionen mit ähnlicher Morphologie gefunden (Abb. 4b). Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass die metastatischen Läsionen in der Lunge und das mutmaßliche primäre Adenokarzinom im Blinddarm alle eine starke nukleäre Expression von β-Catenin und eine reduzierte E-Cadherin-Expression sowie eine starke Vimentin-Expression aufwiesen, was mit EMT im primären Krebs und in den metastatischen Zellen übereinstimmt (Abb. 4b). Die metastatischen Läsionen in AKPfl/fl-Mäusen waren alle CDX2-positiv (ergänzende Abb. 4). Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied in den histologischen Merkmalen metastatischer Läsionen gibt, die in AKP270/fl-Mäusen oder AKPfl/fl-Mäusen entstehen, und dass die schlecht differenzierte Untergruppe der Primärtumore und metastatischen Läsionen mit Missense- oder Null-Trp53-Mutationen EMT-Merkmale aufweisen kann.

Kolonabgeleitete metastatische Tumoren mit Null-Trp53-Mutationen können eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen. a Mikroskopische Aufnahme eines H&E-gefärbten Schnitts, der eine mäßig differenzierte Tumorläsion zeigt, die im Lymphknoten einer repräsentativen AKPfl/fl-Maus 2,5 Monate nach der TAM-Injektion gefunden wurde (oberes Feld). Die immunhistochemischen Färbungen dieser Läsion zeigen eine starke nukleäre Expression von β-Catenin, eine starke membranständige Expression von E-Cadherin und eine fehlende Vimentin-Expression (untere drei Felder). b Mikroskopische Aufnahmen von H&E-gefärbten Schnitten, die die wenig differenzierten Läsionen im Zökum, im Lymphknoten und in der Lunge einer anderen AKPfl/fl-Maus 4 Monate nach der TAM-Injektion zeigen (oberes Feld). Alle diese Läsionen zeigen eine starke nukleäre Expression von β-Catenin, einen Verlust der E-Cadherin-Expression und eine starke Expression von Vimentin, was darauf hindeutet, dass die primären und metastatischen Läsionen in dieser Maus eine EMT durchlaufen haben (untere drei Felder). Die repräsentativen Mikroaufnahmen von H&E-gefärbten Schnitten wurden zur Orientierung mit geringer Vergrößerung gezeigt; die seriellen Schnitte wurden einer immunhistochemischen Färbung unterzogen und der umrahmte Bereich mit Färbungen für β-Catenin, E-Cadherin und Vimentin wurde mit hoher Vergrößerung gezeigt. Skalenbalken: 20 μm für alle Bilder

Die Stabilisierung des missense-mutierten p53-Proteins steht in Zusammenhang mit dem Verlust von Wildtyp-p53 und dem Fortschreiten der Krankheit

Die meisten menschlichen Tumoren mit missense-TP53-Mutationen weisen einen TP53-Verlust an Heterozygotie (LOH) auf, und eine Studie deutet darauf hin, dass TP53-LOH eine Voraussetzung für die Stabilisierung der missense-mutierten p53-Proteine sowohl in Mäusesarkomen als auch in Mammakarzinomen darstellt. Wir untersuchten die p53-Färbemuster in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung in AKP270/+-Mäusen nach Induktion der Tumorgenese durch TAM-Injektion, da das Cre-gezielte Dickdarmepithel in AKP270/+-Mäusen zunächst ein funktionelles Trp53-Allel aufweist. In hyperplastischen Polypen von AKP270/+ Mäusen, in denen Kras aktiviert ist und Apc LOH noch nicht stattgefunden hat, ist die p53-Färbung nicht nachweisbar (Abb. 5b, Tafel HP), ähnlich wie die negative Färbung für p53 im Epithel von Wildtyp-Mäusen (Abb. 5a), obwohl das p53 R270H Missense-Mutantenprotein im Dickdarmgewebe der AKP270/+ Mäuse konstitutionell exprimiert wird. Eine gewisse p53-Immunreaktivität war in Adenomen (Abb. 5b, Panel Adenom und Tabelle 3, n = 185) und Karzinomen (Abb. 5c und Tabelle 3, n = 28), die in AKP270/+ Mäusen entstanden, deutlich zu erkennen. Unter diesen Tumoren zeigten 94 % der Adenome und 43 % der Karzinome eine schwache p53-Färbung (Abb. 5 und Tabelle 3, 5-10 % Positivität), während 6 % der Adenome und 57 % der Karzinome eine starke p53-Färbung aufwiesen (Abb. 5 und Tabelle 3, >10 % Positivität, P < 0,0001). Die Mehrheit der Tumoren mit starker p53-Färbung zeigte p53 LOH, während die Tumoren mit schwacher p53-Färbung noch das Trp53-Wildtyp-Allel behielten (Abb. 6). Unsere Ergebnisse ähneln denen, die in neueren Arbeiten zur Expression von p53-Missense-Proteinen in Mäusesarkomen und Brustkarzinomen beobachtet wurden. Unsere Daten zeigen, dass die Expression einer stabilisierten Missense-Mutante des p53-Proteins eng mit dem Verlust der Wildtyp-p53-Funktion und dem Fortschreiten der Invasion korreliert.

Die Stabilisierung des mutierten p53R270H-Proteins während der Tumorprogression von der Hyperplasie zum Karzinom in AKP270/+ Mäusen. Immunhistochemische Färbung von p53 in einem repräsentativen hyperplastischen Polyp (HP, b, linkes Feld), einem Adenom (b, rechtes Feld) und drei Karzinomen (c), die im Zökum von AKP270/+-Mäusen entstanden sind. Ein Schnitt aus dem Zökum einer Wildtyp-Maus diente als Kontrolle (a). Die p53-Färbung reicht von nicht nachweisbarer Färbung in den normalen (a) und HP (b) Schnitten über schwache Färbung (<10% Positivität) im Adenom (b) und Karzinom 1 (c, linkes Feld) bis hin zu starker Färbung in den Karzinomen 2 und 3 (>10% Positivität). Die gestrichelten Linien zeigen die Muscularis mucosae an. Schwarze Pfeile zeigen die invasiven Drüsen mit schwacher p53-Färbung an; rote Pfeile zeigen die invasiven Drüsen mit starker p53-Färbung an. Skalenbalken: 50 μm

Die Stabilisierung der p53R270H-Missense-Mutante korreliert mit dem Verlust der p53-Heterozygotie (LOH). a Genotypisierung von Dickdarmtumoren (T2-T6), die in AKP270/+-Mäusen 5 Monate nach der TAM-Induktion entstanden. Ein Tumor, der in einer AKP270/fl-Maus (T1) entstanden ist, und Dickdarmgewebe einer Wildtyp-Maus (N) werden als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet. Das Vorhandensein des Trp53-Wildtyp-Allels und des rekombinierten Trp53-Mutanten-Allels (flox out) wurde mittels PCR nachgewiesen. b-e Die immunhistochemische Färbung von p53 in den in (a) beschriebenen Dickdarmgeweben zeigt eine starke Korrelation zwischen der Stabilisierung der p53-Mutante (d, T2 und T3) und dem Verlust der p53-Heterozygotie, verglichen mit der schwachen p53-Färbung und dem Vorhandensein des Trp53-Wildtyp-Allels in den Tumoren 4-6 (e). Die gestrichelten Linien zeigen die Muskularis mucosae an. Skalenbalken: 100 μm

Globale Genexpressionsprofile zeigen wenige Unterschiede zwischen Maus- oder menschlichen Kolontumorzellen, die R270H/R273H Missense-Mutanten und Null-Trp53/TP53-Allele tragen

Wir erstellten Profile der Genexpression in Kolon-Adenokarzinom-Geweben von AKP270/fl-Mäusen (n = 6) oder AKPfl/fl (n = 6) Mäusen unter Verwendung von Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays mit 24.562 Sonden-Sets. Wir isolierten RNA nach Laser Capture Microdissection (LCM) von Krebszellen aus einem invasiven Primärtumor von jeder Maus. Als Kontrollen dienten mikrodissezierte normale Kolonepithelzellen von Wildtyp-Mäusen (n = 3). Für diese 15 Proben wurden ANOVA-Modelle mit Termen für 3 Mittelwerte gebildet. Der Vergleich der Tumorgewebe mit normalem Gewebe ergab über 2400 Sondensätze mit P < 0,001 sowohl für AKP270/fl- als auch für AKPfl/fl-Tumoren, aber der Vergleich der beiden Tumorarten untereinander ergab nur 30 Sondensätze, während wir rein zufällig 24,6 Sondensätze (24.562*0,001) erwarten. Das letztgenannte Ergebnis deutet darauf hin, dass es sich bei den meisten der 30 gefundenen Sondensätze um falsch-positive Ergebnisse handelt (Tabelle 4, oberer Teil), und dass es, wenn überhaupt, nur wenige signifikante Unterschiede in der Genexpression zwischen Kolontumoren mit Trp53-Fehlsensemutationen und solchen mit Trp53-Nullmutationen gab. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung fanden wir heraus, dass die AKP270/fl- und AKPfl/fl-Adenokarzinome in Hauptkomponentenanalysen (PC) der Genexpression nicht unterscheidbar waren, obwohl beide Tumorgruppen Genexpressionsmuster aufweisen, die sich deutlich vom Wildtyp-Darmepithel unterscheiden (ergänzende Abb. 5). 5).

Wir führten auch Affymetrix-Genexpressionsanalysen an Organoiden durch, die aus Dickdarmtumoren von AKP270/fl-Mäusen (n = 3) oder AKPfl/fl-Mäusen (n = 2) stammen. Organoide, die aus Adenomen von Apcfl/fl-Mäusen (Cont 1, n = 3) oder aus Wildtyp-Darmepithel (Cont 2, n = 4) gewonnen wurden, dienten als Kontrollen. Wir haben ein ANOVA-Modell auf die vier Organoidgruppen angewandt. Wir fanden 435 Sondensätze mit P < 0,001 für AKPfl/fl Organoide und 609 Sondensätze für AKP270/fl Organoide im Vergleich zu Apc-null Organoiden (Cont 1, Tabelle 4). Darüber hinaus wurden mehr differenziell exprimierte Sondensätze identifiziert (960 für AKPfl/fl und 1332 für AKP270/fl, P < 0,001), wenn AKPfl/fl- oder AKP270/fl-Organoide mit normalen Kolon-Organoiden verglichen wurden (Cont 2, Tabelle 4). Wir führten einen Test zur Anreicherung von Signalwegen für Gene durch, die sowohl in AKPfl/fl- als auch in AKP270/fl-Tumoren und Organoiden im Vergleich zum normalen Kolonepithel unterschiedlich exprimiert wurden. Wir fanden heraus, dass eine Vielzahl von Signalwegen sowohl in p53-Null- als auch in Missense-Mutanten-Tumorzellen signifikant verändert waren, wobei Gene, die am G2M-Checkpoint, dem Zellwachstum, der Stressreaktion und dem Zellstoffwechsel beteiligt sind, die am stärksten veränderten Gensätze darstellten (ergänzende Tabelle 2). Wir erhielten jedoch nur 35 Sondensätze mit P < 0,001 für den Vergleich AKPfl/fl vs. AKP270/fl (Tabelle 4), von denen wiederum 24,6 zufällig erwartet wurden, was zeigt, dass es schwierig war, Unterschiede in der Genexpression zwischen den Organoiden mit Null- und Missense-Trp53-Mutationen zu finden. PC-Plots zeigten, dass AKPfl/fl- und AKP270/fl-Proben immer zusammen geclustert und von Organoiden getrennt waren, die aus Apc-mutierten Adenomen (Cont1, ergänzende Abb. 6) oder normalem Kolonepithel (Cont2, ergänzende Abb. 6) stammten.

Um zu prüfen, ob es nachweisbare Unterschiede in den Genexpressionsmustern zwischen menschlichen CRCs mit Missense- und Null-TP53-Mutationen gibt, analysierten wir log2-transformierte normalisierte Zählungen aus RNA-seq-Daten für CRCs im The Cancer Genome Atlas (TCGA), und verglichen 9 Tumore mit TP53 Codon 273 Missense-Mutationen mit 36 Tumoren mit Null-Mutationen (verursacht durch Frame-Shift-, Spleißstellen- und Nonsense-Mutationen, siehe ergänzende Tabelle 3 für Details) durch einen T-Test mit zwei Stichproben für 20531 Gene. Wir fanden nur 244 Gene mit P < 0,01 und 30 Gene mit P < 0,001, was nur geringfügig mehr war als die zufällig erwartete Anzahl (205 bzw. 20,5, Tabelle 4). TP53 selbst lieferte den signifikantesten Unterschied in der Genexpression und war im Durchschnitt fast 5-fach niedriger in Tumoren mit Null-Mutationen im Vergleich zu TP53 Codon 273 Mutationen (ergänzende Tabelle 4, P = 2 × 10-10). Auch bei der PC-Analyse fanden wir nur eine geringe Trennung zwischen den beiden Tumorgruppen (ergänzende Abb. 7). In Übereinstimmung mit der ähnlichen Transkriptionssignatur passten wir Cox-Proportional-Hazards-Modelle an 43 Patienten mit Überlebensdaten an, wobei wir Alter, Stadium und TP53-Status im Modell verwendeten, und fanden keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Patientenergebnis und dem TP53-Mutationsstatus (R273-Missense-Mutation vs. Null-Mutation, ergänzende Tabelle 5, P = 0,67 durch Wald-Test). Es ist erwähnenswert, dass bei nur 7 Todesfällen unter diesen Patienten die Aussagekraft zum Nachweis von Unterschieden recht gering war. Schließlich untersuchten wir die Schnittmenge der Gene, die in einem der drei oben beschriebenen Datensätze (d. h. menschliche und Maus-Kolontumore, Maus-Kolon-Organoide) einen P < 0,05 ergaben und die sich beim Vergleich von Trp53/TP53-Missense und Null in dieselbe Richtung veränderten. In der ergänzenden Tabelle 4 sind die Gene aufgeführt, die in zwei der drei Datensätze P < 0,05 und eine Fold-Change von mindestens 1,3 aufwiesen. Wir fanden nur Trp53/TP53, das sich in allen drei Studien in die gleiche Richtung veränderte (siehe ergänzende Tabelle 4; die detaillierten Statistiken für jedes Gen in allen drei Datensätzen sind in unserer öffentlichen GEO-Serie verfügbar). Insgesamt deuten unsere Genexpressionsanalysen für Darmkrebs bei Mäusen und Menschen darauf hin, dass Dickdarmtumore mit R270/R273-Missense- oder Null-Trp53/TP53-Mutationen sehr ähnliche Genexpressionsprofile aufweisen, was mit dem Fehlen größerer Unterschiede bei den biologischen Merkmalen der Dickdarmtumore und den in vivo in AKP270/fl- und AKPfl/fl-Mäusen auftretenden Phänotypen übereinstimmt.