Schneller Lateral-Flow-Immunoassay für den Fluoreszenznachweis von SARS-CoV-2-RNA

Im HC-FIA-System verstärken Sonden-DNA-funktionalisierte FNPs das Signal der Hybridisierung von viraler RNA und der DNA in der Sonde. Das Konstruktionsprinzip des HC-FIA-Biosensors ist in Abb. 1 dargestellt.

a, Das Prinzip des HC-FIA. b, Repräsentative Ergebnisse auf einem Lateral Flow Streifen. c, Das Fluoreszenzanalysegerät. d, Ein Foto des tragbaren Kofferlabors mit einer Länge von 55,5 cm, einer Breite von 37 cm und einer Höhe von 23 cm bei einem Gewicht von 8,5 kg. e, Das Testverfahren des HC-FIA-Tests. Schritt 1: Nukleinsäurehybridisierung in einem Inkubator bei konstanter Temperatur. Schritt 2: Bestimmung der Intensität der Fluoreszenzsignale auf der Testkarte mit dem in c gezeigten Gerät. f, Sondenverteilung im Genom von SARS-CoV-2.

Design und Durchführung des HC-FIA-Assays

Die murinen S9.6 monoklonalen Antikörper sind auf der Testlinie (T) des Lateral Flow Streifens vorfixiert, und die Kontrolllinie (C) ist mit polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern beschichtet (Abb. 1a). Die mit S9.6-Antikörpern und Kaninchen-IgG markierten FNPs werden in das Reaktionsgefäß gegeben. Zu Beginn des Nachweisverfahrens wird das SARS-CoV-2 im Rachenabstrich oder in der Sputumprobe lysiert und freigesetzt, und die freigesetzte RNA hybridisiert mit der spezifischen SARS-CoV-2-DNA-Sonde. Das resultierende RNA-DNA-Hybrid wird von den FNP-markierten S9.6-Antikörpern eingefangen, und der Komplex fließt unter Kapillarkräften entlang des Probenpads und der Nitrocellulosemembran in Richtung des absorbierenden Papiers. Beim Durchlaufen des T-Bereichs wird der Komplex von den S9.6-Antikörpern eingefangen und erzeugt allmählich ein Fluoreszenzsignal. Im C-Bereich wird das FNP-markierte Kaninchen-IgG von dem Anti-Kaninchen-IgG eingefangen. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der SARS-CoV-2-RNA wird anhand eines Grenzwerts für die Fluoreszenzintensität bestimmt (Abb. 1b,c). Abbildung 1d zeigt ein tragbares Kofferlabor, das in der Lage ist, nach den folgenden beiden Schritten – Hybridisierung und Immunfluoreszenzanalyse – in weniger als einer Stunde qualitative Ergebnisse zu liefern (Abb. 1e).

Hier wurde das Verhältnis des Testfluoreszenzsignals zum Kontrollfluoreszenzsignal (T/C) auf dem Lateral-Flow-Streifen verwendet, so dass der Einfluss der Hintergrundfluoreszenz der Testkarte minimiert wurde. Bei der Messung des T/C-Verhältnisses von Rachenabstrichproben von 211 gesunden Personen stellten wir fest, dass das durchschnittliche Hintergrund-T/C-Verhältnis 49,95 betrug, mit einem s.d. von 17,16 (ergänzende Abb. 1a). Die Receiver-Operating-Characteristic-Kurve (ROC-Kurve) und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurden verwendet, um den Cut-off-Wert zu bestimmen und die diagnostische Genauigkeit des HC-FIA-Tests auf der Grundlage der Sensitivität und Spezifität bei verschiedenen Schwellenwerten zu bewerten. Wir ermittelten eine ROC-Kurve mit einer AUC von 0,999 mit einem 95 %-Konfidenzintervall (CI) von 0,997-1,000 (ergänzende Abb. 1b) unter Verwendung von Rachenabstrichproben von 100 klinisch bestätigten und ausgeschlossenen COVID-19-Fällen. Der Cut-off-Wert, der die höchste Sensitivität und Spezifität ergab, wurde mit 102,07 bestimmt, was einem Youden-Index von 0,980 entspricht. Alternativ wird bei Immunoassays üblicherweise ein Schwellenwert in Höhe des doppelten negativen Hintergrundwerts (hier 49,95 × 2 = 99,90) als Cut-off-Wert verwendet. Der Einfachheit halber haben wir einen T/C-Cut-off-Wert von 100,00 gewählt.

HC-FIA-Assayentwicklung

Die Optimierung der DNA-Sonden für die Ziel-RNA-Sequenz von SARS-CoV-2 ist der Schlüssel zur Verbesserung der Assay-Effizienz. Eine Liste aller von uns entwickelten DNA-Sondensequenzen findet sich in der ergänzenden Tabelle 1. Das Genom von SARS-CoV-2 umfasst etwa 30.000 Basen, einschließlich einer variablen Anzahl (6-11) von offenen Leserahmen (ORFs). Der erste ORF macht etwa 67 % des gesamten Genoms aus und kodiert für 16 nicht-strukturelle Proteine sowie Helferproteine und Strukturproteine. Die vier wichtigsten Strukturproteine sind das Spike-Glykoprotein (S), das kleine Hüllprotein (E), das Matrixprotein (M) und das Nukleokapsidprotein (N)15,16. Die meisten Nukleinsäurenachweistests für SARS-CoV-2 verwenden die folgenden drei konservierten Regionen im viralen Genom: ORF1ab, in dem sich das Gen für die RNA-abhängige Polymerase (rdrp) befindet15, und die Regionen, die für N und E kodieren.

Wir haben zunächst die RNA-Genomsequenz von SARS-CoV-2 aus der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) abgerufen (Zugangsnummern MN908947, MN908947.3, MN908947.2 und NC_045512.1). Eine detaillierte Analyse anderer veröffentlichter Sequenzen für das SARS-CoV-2-Genom ergab keine nennenswerten Abweichungen in diesen Regionen. Mit Hilfe der Design-Software Primer Premier 5.0 entwarfen wir drei Sonden für jede der drei Regionen: CoV01 und CoV04, die in der empfohlenen Region für den Nachweis von ORF1ab bzw. N liegen, und CoV08, in derselben Region wie E17. Die Genompositionen der Sondenbindungsstellen in der Referenzgenomsequenz (NC_045512.2) sind in Abb. 1f angegeben.

Es wurde ein Sequenzalignment zwischen den entworfenen DNA-Sonden und Sequenzen aus dem menschlichen Genom sowie aus den Genomen von Viren, Bakterien, Mykoplasmen, Chlamydien und anderen gängigen Krankheitserregern durchgeführt. Die Sonden stimmten nur mit der genomischen Sequenz von SARS-CoV-2 überein, und wir fanden keine Homologie zur menschlichen genomischen DNA. Pseudoviren, die verschiedene Regionen des Zielgens tragen und mit Lentiviren als Vektoren konstruiert wurden, dienten als Positivkontrollen. Die Zielgen-Sequenzen der verwendeten Pseudoviren sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt. P1 war positiv für die SARS-CoV-2 N-Region, P2 für die SARS-CoV-2 E-Region und P3 für die SARS-CoV-2 ORF1ab-Region. Die Konzentration der drei Positivkontrollen betrug 3.000 Transduktionseinheiten (TU) ml-1, was bedeutet, dass 3.000 infektiöse Viruspartikel pro ml vorhanden waren. Physiologische Kochsalzlösung, gereinigtes Wasser und Rachenabstrichproben, die positiv für andere gängige Erreger waren, wurden als Negativkontrollen für N1-N17 verwendet. Eine Liste mit Informationen zu den in der Studie verwendeten Positiv- und Negativreferenzen findet sich in der ergänzenden Tabelle 3. Die Testergebnisse sind in den Zusatztabellen 4-6 aufgeführt. Für die ORF1ab-Region wurden die Sonden CoV01 und CoV03 ausgewählt, für die E-Region die Sonde CoV08 und für die N-Region die Sonden CoV04 und CoV06, die bevorzugt an die Ziel-RNA gebunden haben. Die ausgewählten DNA-Sonden wurden durch Kombination weiter optimiert (ergänzende Tabelle 7), wobei jede Sondengruppe gleichzeitig auf alle drei Segmente abzielte. Die HC-FIA-Testergebnisse in der ergänzenden Tabelle 8 zeigen, dass die Kombination der Cov01-, Cov04- und Cov08-Sonden (Gruppe 2) zwischen allen positiven Kontrollproben und den Negativkontrollen unterschied und positive Proben mit einem niedrigen Virustiter (1.000 TU ml-1; ergänzende Tabelle 3, L1-L3) mit einer Positivrate von mehr als 95 % nachwies. Daher wurde Gruppe 2 als endgültige Kombination ausgewählt. Bis heute sind 13.411 SARS-CoV-2-Nukleotidsequenzen im NCBI veröffentlicht. Der Abgleich der drei Sonden mit der entsprechenden Zielregion in den 13.411 hochgeladenen Sequenzen ergab, dass die Zielregionen der Sonden ausreichend konserviert waren, um eine 100%ige Ähnlichkeit zu erreichen.

Wir optimierten auch die Testbedingungen des Assays, insbesondere die Inkubationszeit für die Hybridisierung und die Auslesezeit des Teststreifens. Die Assayleistung für Inkubationszeiten von 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min und 60 min bei 56 °C ist in der ergänzenden Tabelle 9 dargestellt. Man beachte, dass 20 min ausreichten, damit die DNA-Sonden mit der Zielregion hybridisieren konnten, was sich in der 100 %igen Positivrate beim Nachweis positiver Rachenabstrich- und Sputumproben mit niedrigem Virustiter (1.000 TU ml-1; ergänzende Tabelle 3, L1-L3) widerspiegelte. Wurde die Inkubationszeit auf 50 oder 60 Minuten verlängert, war die Reaktion nicht mehr so stabil, da die Positivrate der L1-L3-Referenzproben abnahm. Unter Berücksichtigung der Nachweiseffizienz und der Notwendigkeit der Virusinaktivierung wählten wir 30 Minuten als Inkubationszeit für die Hybridisierung bei 56 °C. Wir bewerteten auch die Ablesezeit des Streifens für die Werte 10 min, 12 min, 15 min und 18 min (ergänzende Tabelle 10). Die Ergebnisse zeigten, dass 12 min oder länger zu einer korrekten Erkennung der positiven und negativen Referenzproben führten. Allerdings lag der Variationskoeffizient (VK) für den Nachweis positiver Proben mit einem niedrigen Virustiter nur bei einer Ablesezeit von 15 min unter 10 %. Daher wählten wir eine Ablesezeit von 15 Minuten.

Guanidiniumthiocyanat und Guanidinchlorid – die am häufigsten verwendeten Proteindenaturierungsmittel für die Nukleinsäureextraktion – wurden als Transportmedien für die Probenkonservierung verglichen. Guanidiniumthiocyanat führte zu einer besseren Leistung bei der Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben, mit einem relativ niedrigen CV für Proben mit einem niedrigen Virustiter. Tatsächlich hat Guanidiniumthiocyanat in einer Konzentration von bis zu 6 mol l-1 hervorragende antivirale Eigenschaften gezeigt18. Wir wählten Guanidiniumthiocyanat in einer Konzentration von 5 mol l-1 als Protein-Denaturierungsmittel für die virale Inaktivierung im Transportmedium.

Spezifität des HC-FIA-Assays

Nach der Optimierung der Sondensequenzen und Reaktionsbedingungen untersuchten wir die Spezifität des HC-FIA-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2. Zu den Positivkontrollen gehörten Pseudoviren (Proben P1-P3) mit Zielgenen und fünf klinische Rachenabstrichproben (Proben P4-P8), die mit einem RT-qPCR-basierten Nukleinsäure-Nachweiskit (Shanghai ZJ Bio-Tech) bestätigt wurden. Die Negativkontrollen, die aus Rachenabstrichproben bestanden, erwiesen sich als negativ für SARS-CoV-2 und positiv für Influenza A, Influenza B, Respiratorisches Synzytialvirus, Chlamydia pneumoniae, Adenovirus oder andere Erreger (Proben N5-N17) oder pseudovirus-positiv für die N-Region von MERS (Probe N18) oder SARS (Probe N19). Eine Liste aller Proben findet sich in der ergänzenden Tabelle 3. Eine Liste der Nachweisergebnisse von 8 positiven Referenzproben und 15 negativen Referenzproben findet sich in der ergänzenden Tabelle 11.

Wir untersuchten, ob es eine Kreuzreaktivität zwischen SARS-CoV-2 und 55 gängigen Erregern von Atemwegserkrankungen gibt. Die Quelle und die quantitativen Informationen zu jedem pathogenen Mikroorganismus sind im ergänzenden Datensatz 1 aufgeführt. Der ursprüngliche Virustiter wurde mit Hilfe eines Plaque-Assays auf 106 plaquebildende Einheiten pro ml bestimmt. Für Interferenzproben von Bakterien, Mykoplasmen und Chlamydien wurde eine Konzentration von 107 koloniebildenden Einheiten pro ml ermittelt. Darüber hinaus wurde aus drei Vollblutproben humane genomische DNA extrahiert und auf 90-105 µg ml-1 quantifiziert. Der HC-FIA-Assay wies eine ausgezeichnete Spezifität für SARS-CoV-2 auf, ohne offensichtliche Kreuzreaktivität mit allen anderen Erregerproben und menschlicher genomischer DNA (Supplementary Dataset 1).

Da der monoklonale Antikörper S9.6 auch an RNA-RNA-Duplexe19 bindet, insbesondere an AU-reiche20, haben wir doppelsträngige RNA-Sequenzen mit unterschiedlichen Anteilen an AU entwickelt. Detaillierte Sequenzinformationen sind in der ergänzenden Tabelle 12 zu finden. Wie aus der ergänzenden Tabelle 13 hervorgeht, zeigte der HC-FIA-Assay unabhängig vom AU-Gehalt kein nachweisbares positives Signal gegenüber doppelsträngiger RNA, was darauf hindeutet, dass die Bindungsaffinität zwischen dem S9.6-Antikörper und doppelsträngiger RNA unter den Assaybedingungen gering ist. Wir untersuchten auch, ob das Vorhandensein von doppelsträngiger RNA die Leistung des Assays beim Nachweis von klinischen Rachenabstrichen oder Sputumproben beeinträchtigt. Wir verwendeten 2 positive Rachenabstrichproben, 2 positive Sputumproben, 10 negative Rachenabstrichproben und 5 negative Sputumproben. Wir haben die T/C-Verhältnisse in Bezug auf die T/C-Werte des interferenzfreien Tests gemessen und festgestellt, dass die Verhältnisse zwischen 0,9 und 1,1 lagen (ergänzender Datensatz 1). Dies deutet darauf hin, dass das Vorhandensein von doppelsträngiger RNA, unabhängig vom AU-Gehalt, die Leistung des HC-FIA-Assays nicht signifikant beeinträchtigt.

Sensitivität und Präzision des HC-FIA-Assays

Wir verdünnten die Pseudovirus-Proben, die drei Abschnitte der Zielgene enthielten, seriell auf Titer von 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 und 100 TU ml-1 und berechneten die durchschnittlichen T/C-Werte für 20 parallele Tests. Abbildung 2a zeigt, dass die Nachweisgrenze (LOD) von Pseudoviren, die positiv für die N-, E- oder ORF1ab-Region von SARS-CoV-2 waren, bei nur 1.000 TU ml-1 lag, wobei die Positivrate mehr als 95 % betrug. Als die Titer der Pseudovirus-Proben 108 TU ml-1 erreichten, wurde kein nennenswerter Hook-Effekt mehr beobachtet (ergänzende Abb. 2). Der lineare Bereich des Assays entspricht Titern zwischen 103 und 106 oder 107 TU ml-1.

Die vertikalen Achsen zeigen das Fluoreszenz-Intensitätsverhältnis (T/C) des Testsignals (T) und des Kontrollsignals (C). Für jede Konzentration wurden 20 Tests parallel durchgeführt. Die LOD wurde als die Konzentration bestimmt, bei der die Positivrate größer oder gleich 95 % war. a, T/C-Verhältnisse für seriell verdünnte Pseudovirus-Proben, die positiv für die N-, E- und ORF1ab-Regionen von SARS-CoV-2 waren. b, T/C-Verhältnisse für seriell verdünnte Rachenabstrichproben von drei schwerkranken Patienten. Die Daten sind Mittelwerte ± s.d.

Rachenabstrichproben von drei schwerkranken Patienten – die mittels RT-qPCR als positiv für SARS-CoV-2 befunden und deren Viruslast mittels digitaler PCR quantifiziert wurde – wurden mit negativen Rachenabstrichproben gemischt, um serielle Verdünnungen von 2.000, 1.000, 500, 400 und 250 Kopien pro ml herzustellen. Wie in Abb. 2b gezeigt, lag der LOD bei 500 Kopien pro ml mit einer Positivrate von mehr als 95 %. Klinische Rachenabstrichproben mit T/C-Werten nahe dem kritischen Wert (100) für Positivität (Proben mit 512, 489 und 497 Kopien pro ml der ORF1ab-Region, gemäß digitaler PCR) wurden zur Überprüfung der LOD verwendet (Tests wurden 20 Mal parallel durchgeführt). Die Positivraten dieser Proben lagen bei über 95 % (ergänzende Tabellen 14-16).

Um die Präzision des HC-FIA-Kits zu bewerten, wurden an fünf aufeinanderfolgenden Tagen 20 parallele Tests für jede klinische Rachenabstrichprobe durchgeführt. Als repräsentative klinische Proben wurden eine positive Probe (1.348 Kopien pro ml der ORF1ab-Region), eine Probe von einer schwerkranken Person (kritisch; 512 Kopien pro ml) und eine negative Probe (0 Kopien pro ml) ausgewählt. Die durchschnittlichen T/C-Werte der drei Chargen beim Nachweis der positiven Probe waren wie folgt: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) und 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), verglichen mit 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) und 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) für die kritische Probe und mit 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) und 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) für die negative Probe. Die CV-Werte von Charge zu Charge betrugen 3,89 %, 4,66 % und 6,74 %. Somit zeigte der Test eine gute Präzision und Reproduzierbarkeit für den Nachweis von SARS-CoV-2.

Robustheit des HC-FIA-Tests

Um etwas über die Robustheit des HC-FIA zu erfahren, haben wir die Auswirkungen endogener Störsubstanzen (wie Hämoglobin und Muzin) und exogener Störsubstanzen (insbesondere klinische Medikamente, die üblicherweise bei der Behandlung von Patienten mit Atemwegsinfektionen eingesetzt werden, einschließlich antiviraler Medikamente, Antibiotika und Hormone) untersucht. Für dieses Experiment wurden 18 klinische Rachenabstrichproben verwendet, darunter sechs kritische Proben (500-530 Kopien pro ml für die ORF1ab-Region, gemäß digitaler PCR), sechs negative Proben und sechs positive Proben. Die Ergebnisse wurden auch als Verhältnis der T/C-Werte (Interferenzproben gegenüber Kontrollproben) erfasst. In den vorbereiteten Interferenzproben betrugen die Hämoglobinkonzentrationen 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 und 2,0 g l-1 und die Konzentrationen für Muzin 5 g l-1, 10 g l-1 und 20 g l-1. Die Wirkstoffkonzentrationen der exogenen Interferenzproben (ergänzende Tabellen 17-19) waren viel höher als ihre Spitzenplasmakonzentrationen in vivo. Wie erwartet lagen alle T/C-Verhältnisse im Bereich von 0,9-1,1 (Supplementary Dataset 2), was darauf hindeutet, dass der HC-FIA-Assay robust gegenüber Interferenzen ist.

Klinische Bewertung des HC-FIA-Testkits

Um die Leistungsfähigkeit des HC-FIA-Assays weiter zu bewerten, wurde eine randomisierte klinische Doppelblindstudie durchgeführt, in der der Assay mit RT-qPCR (SARS-CoV-2-Nachweiskit, hergestellt von Shanghai ZJ Bio-Tech und zugelassen von der NMPA) oder mit klinischen Diagnoseergebnissen in drei unabhängigen medizinischen Einrichtungen verglichen wurde. Das bei der klinischen Bewertung verwendete HC-FIA-Testkit enthielt Testkarten, Lysepuffer, Probenkonservierungslösung, Positiv- und Negativkontrollen sowie ein Reaktionsgefäß mit DNA-Sonden und markierten Antikörpern. Die klinischen Diagnoseergebnisse der bestätigten oder ausgeschlossenen COVID-19-Fälle, die von den benannten Krankenhäusern zur Verfügung gestellt wurden, basierten auf Computertomographie-Bildern und auf den klinischen Manifestationen der Patienten, wie in den Richtlinien des „Diagnose- und Behandlungsprotokolls für neuartige Coronavirus-Pneumonie (Trial Version 6.0)“ von China festgelegt. Insgesamt wurden 734 Proben (593 Rachenabstriche und 141 Sputum) von 670 Personen parallel getestet. Die Rohdaten aus den klinischen Studien sind im ergänzenden Datensatz 3 enthalten. Das von uns verwendete RT-qPCR-Detektionskit wurde als Drei-Target-System (ORF, N und E) konzipiert, und wir folgten dem Test-Retest-Prinzip, um zwischen positiven und negativen Proben zu unterscheiden. Zusätzlich zu vier Fehlversuchen, die durch einen ungültigen internen Standard verursacht wurden, wurden acht Wiederholungstests durchgeführt: einer, weil nur ein rdrp-Zielgen positiv war, und sieben, weil nur die N- und E-Gene positiv waren. In diesen Fällen wurden die vorherigen negativen Ergebnisse ausgeschlossen.

Von den 670 Patienten, die an der Studie teilnahmen, waren 313 männlich (46,72 %) und 357 weiblich (53,28 %). Wie aus der ergänzenden Abbildung 3 hervorgeht, ähnelt die Altersverteilung der eingeschlossenen Bevölkerung der Altersverteilung der SARS-CoV-2-Infektion21. Auch die Besuchsrate und die Diagnoserate waren ausgewogen. Die Ergebnisse der HC-FIA-Testkits sind in Abb. 3 dargestellt, die Fotos von typischen Ergebnissen unter einer Fluoreszenzlichtquelle und die entsprechende Farbverlaufsmatrix nach der Auslesenormalisierung zeigt. Die Farbverlaufsmatrix in der ergänzenden Abb. 4 zeigt die normalisierten Fluoreszenzwerte von 734 klinischen Proben (ergänzender Datensatz 3).

Fotografien typischer Ergebnisse unter einer Fluoreszenzlichtquelle und die entsprechenden Fluoreszenzauslesungen als Farbverlaufsmatrix, normalisiert auf den maximalen Auslesewert. Gruppe E besteht nur aus COVID-19-negativen Ergebnissen. Die horizontale Linie auf dem Farbbalken zeigt den Cut-off-Wert an. Eine Farbverlaufsmatrix für die Fluoreszenzwerte von 734 klinischen Proben findet sich in der ergänzenden Abbildung 4, die entsprechenden numerischen Daten im ergänzenden Datensatz 3.

Bei 621 Fällen stimmten die HC-FIA-Ergebnisse und die klinischen Diagnosen überein (210 bestätigte Fälle und 411 ausgeschlossene Fälle; Tabelle 1); 49 Fälle (27 bestätigte und 22 ausgeschlossene Fälle nach klinischer Diagnose) stimmten nicht mit den HC-FIA-Ergebnissen überein. Bei 730 Proben stimmten die Ergebnisse des HC-FIA-Tests mit denen der RT-qPCR überein (249 positive und 481 negative; Tabelle 1). Vier Proben, die auf der Grundlage von RT-qPCR negativ waren, waren mit HC-FIA positiv. Drei dieser Proben stammten von Patienten, die klinisch als COVID-19-ausgeschlossen diagnostiziert worden waren, was darauf hindeutet, dass der HC-FIA-Test falsch-positive Ergebnisse geliefert hatte. Die verbleibende Probe entsprach einem durch klinische Diagnose bestätigten Fall, was mit dem HC-FIA-Test übereinstimmt.

Cohen’s Kappa (κ), ein häufig verwendetes Maß für die Zuverlässigkeit der Übereinstimmung zwischen kategorialen Variablen, ist ein robusteres Maß als die einfache prozentuale Übereinstimmung zwischen den Variablen, da κ auch zufällige Übereinstimmungen berücksichtigt, insbesondere bei unausgewogenen Datensätzen. Wir betrachteten einen κ-Wert von mehr als 0,75 als Hinweis auf ein hohes Maß an Übereinstimmung (perfekte Übereinstimmung entspricht einem κ = 1). Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, stimmten die Ergebnisse des HC-FIA-Tests in hohem Maße mit der klinischen Diagnose (κ = 0,8393) und mit der RT-qPCR (κ > 0,98, unabhängig vom Probentyp) überein.