Einheitsdefinition
Eine Einheit Restriktionsendonukleaseaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um einen vollständigen Verdau von 1 µg Substrat-DNA (oder Fragmenten) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl in 60 Minuten unter optimalen Testbedingungen, wie sie für jede Restriktionsendonuklease angegeben sind, durchzuführen.
Bestimmung der Volumenaktivität von Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonuklease-Aktivitätsassays werden durchgeführt, indem verschiedene Enzymverdünnungen in den entsprechenden Assay-Puffer mit 1 µg Substrat-DNA gegeben werden. Nach einer 60-minütigen Inkubation bei der entsprechenden Temperatur wird der Verdau gestoppt und die DNA-Proben werden durch Agarosegel/Ethidiumbromid-Elektrophorese sichtbar gemacht. Die am stärksten verdünnte Enzymlösung, die einen vollständigen Verdau ergibt, wird zur Berechnung der Aktivität in Einheiten/µl verwendet.
Bitte beachten Sie, dass die Aktivität substratabhängig ist und das Enzym bei der Arbeit mit einem neuen Substrat titriert werden sollte, um die tatsächliche oder erwartete Aktivität zu bestimmen.
Qualitätskontrollen
Die Ergebnisse aller Qualitätskontroll-Assays sind auf dem technischen Datenblatt aufgeführt, das jedem Enzym beiliegt.
Overdigestions-Assay
Ein Overdigestions-Assay wurde zur qualitativen Bestimmung der Enzymreinheit und des Fehlens von unspezifischen DNasen verwendet. Beim Overdigestion-Assay werden steigende Mengen jeder Restriktionsendonuklease (normalerweise 10, 20, 30, 40, 50 Einheiten) zu einer Reihe von Röhrchen mit 1 µg Substrat-DNA gegeben. Nach einer 20-stündigen Inkubation unter den empfohlenen Testbedingungen wird die maximale Anzahl von Einheiten, die ein klares, scharfes, normales Bandenmuster ergeben, durch Agarosegel/Ethidiumbromid-Elektrophorese bestimmt.
Um den Test zu bestehen, muss das Enzym unter Bedingungen einer bis zu 600-fachen Überverdauung (Einheiten x Stunden) im Vergleich zu einem 2-fachen Verdau ein unverändertes Bandenmuster ergeben. Wenn das Enzym eine „Stern“-Aktivität bei einem geringeren als dem 600-fachen funktionellen Überschuss aufweist, enthält die Produktbeschreibung Informationen über den funktionellen Überschuss, bei dem die „Stern“-Aktivität nicht auftritt.
Test auf unspezifische Endonukleasen
Zur Prüfung auf unspezifische Endonuklease-Kontamination wird jede Restriktionsendonuklease mit einem supergewickelten Plasmidsubstrat inkubiert, dem die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease fehlt. Ein einziger unspezifischer Nick in der RF I-DNA wandelt diese in die RF II-Form um (nicked circle). Zu einer Reihe von Röhrchen, die 1 µg RF I-DNA (supercoiled Form) enthalten, werden ansteigende Enzymmengen (normalerweise 10, 20, 30, 40, 50 Einheiten) hinzugefügt. Nach einer 20-stündigen Inkubation unter den empfohlenen Testbedingungen werden die beiden Formen auf Agarosegelen unterschieden und die prozentuale Umwandlung von RF I in RF II bestimmt.
Ligations- und Rückschneide-Assay
Ein Ligationsassay wurde verwendet, um die funktionelle Reinheit der DNA nach dem Restriktionsenzymverdau zu bestimmen. Die Substrat-DNA wird mit einem 10- und 50-fachen Überschuss der Restriktionsendonuklease im entsprechenden Assay-Puffer vollständig verdaut, mit T4-DNA-Ligase ligiert und mit demselben Restriktionsenzym zurückgeschnitten. Die geschnittenen, ligierten und umgeschnittenen DNAs werden mittels Agarosegel/Ethidiumbromid-Elektrophorese analysiert. Ein normales Bandenmuster deutet auf intakte 5- und 3-Termini sowie auf die Abwesenheit von kontaminierenden Nukleasen oder Phosphatasen hin.
Stabilität
Alle Restriktionsendonukleasen von Jena Bioscience werden alle 4-6 Monate neu getestet. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die volle Enzymaktivität und optimale Leistung jedes von uns gelieferten Enzyms zu gewährleisten. Aufgrund der hervorragenden Ergebnisse dieser Tests haben wir die Verfallsdaten der meisten unserer Enzyme auf 18 Monate verlängert.