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Übersicht

Radioaktive Liganden werden häufig zur Messung der Ligandenbindung an Rezeptoren verwendet. In diesem Assay wird die Bindung eines radioaktiv markierten Liganden an Zellen oder Zellmembranen gemessen, die einen Rezeptor von Interesse enthalten. Für diesen Test können sowohl ganze Zellen als auch Zellmembranen verwendet werden. Mit Radioliganden können Sättigungskurven, Konkurrenz- und kinetische Experimente durchgeführt werden.

Liganden-Rezeptor-Bindung

Bei der Auswahl eines Radioliganden sind einige Faktoren zu beachten:

• Hohe spezifische Aktivität: Radioliganden mit einer hohen spezifischen Aktivität eignen sich gut für Ligandenbindungsversuche. Die spezifische Aktivität gibt an, wie viel Radioaktivität pro Ligandenmolekül vorhanden ist, und wird normalerweise in Curies pro Millimol Ligand angegeben. Mehrere unserer 125I-markierten Liganden werden mit maximaler spezifischer Aktivität angeboten (2200 Ci/mmol, wenn eine 125I-Markierungsstelle verfügbar ist, 4400 Ci/mmol, wenn zwei 125I-Markierungsstellen verfügbar sind usw.). Dies bedeutet, dass praktisch jedes Ligandenmolekül, das in der Vorratsflasche enthalten ist, radioaktiv markiert ist. Für tritiierte Liganden (3H-Liganden) sollten Sie idealerweise einen Liganden wählen, der eine spezifische Aktivität von über 20 Ci/mmol aufweist. Die maximale theoretische spezifische Aktivität pro Tritium beträgt 29 Ci/mmol (Curies pro Millimol Tritium). Spezifische Aktivitäten über diesem Wert bedeuten, dass jedes Ligandenmolekül im Durchschnitt mindestens ein Tritium enthält.
• Geringe unspezifische Bindung: Hydrophobe Liganden weisen im Allgemeinen eine höhere unspezifische Bindung auf. Dies kann manchmal durch Beschichtung von Filtern mit BSA kompensiert werden, um die unspezifische Bindung zu verringern. Die Aufnahme von BSA, Salzen oder Detergenzien in den Wasch- oder Bindungspuffer kann ebenfalls zur Verringerung der unspezifischen Bindung beitragen. Wenn die radiochemische Stammlösung in einem silanisierten Fläschchen verpackt ist (siehe technisches Datenblatt), kann dies darauf hindeuten, dass der Ligand etwas hydrophob ist
• Hohe Reinheit: Im Idealfall sollte der Ligand eine radiochemische Reinheit von über 90 % aufweisen. Die radiochemische Reinheit nimmt mit der Zeit ab, und die tatsächliche Abbaugeschwindigkeit beschleunigt sich mit der Zeit. Die radiochemische Reinheit und die Abbaugeschwindigkeit unserer verschiedenen Radiochemikalien finden Sie in den chargenspezifischen technischen Datenblättern.
• Hohe Selektivität: Je selektiver der Ligand für Ihren Rezeptor ist, desto besser werden Ihre Daten sein. Eine hohe Selektivität bedeutet, dass der Ligand hauptsächlich nur von einem Rezeptor von Interesse erkannt wird, und nicht von anderen Rezeptoren, die in einer Zellmembran vorhanden sein können. Auch die Verwendung von Membranen, die den Rezeptor von Interesse überexprimieren, kann dazu beitragen, einen möglichen Beitrag von Rezeptoren, die endogen in der Membran exprimiert werden, zu reduzieren.
• Stabilität: Wenn Sie Ihren Radioliganden über einen längeren Zeitraum verwenden müssen, kann die Stabilität ein wichtiger Faktor für Sie sein. 125I-markierte Liganden sollten im Allgemeinen innerhalb von ein bis zwei Monaten nach dem Herstellungsdatum verwendet werden. Tritiierte Liganden sollten in der Regel innerhalb von 3-6 Monaten nach dem Herstellungsdatum verwendet werden; es gibt jedoch auch Ausnahmen. Die Abbaugeschwindigkeiten und Herstellungsdaten finden Sie in unseren chargenspezifischen technischen Datenblättern. Sie können sich auch an den technischen Support wenden, um die empfohlene Verwendungsdauer für die einzelnen PerkinElmer-Radiochemikalien zu besprechen – unsere Kontaktinformationen finden Sie oben rechts auf dieser Seite.
• Energie: 3H setzt Beta-Energie frei, die nach Zugabe von Szintillationsmittel (in Form eines Szintillationscocktails, Meltilex®-Feststoffszintillants, eines SPA-Beads usw.) mit einem Szintillationszähler gemessen werden kann. Die Beta-Energie interagiert mit dem Szintillationsmittel und erzeugt Photonen, die vom Detektor gemessen werden. 125I setzt sowohl Beta- als auch Gamma-Energie frei. Wenn Sie nur Zugang zu einem Gammazähler haben, sollten Sie einen mit 125I markierten Radioliganden verwenden. Ein weiterer Faktor ist das Assay-Format. 125I gibt mehr beta-ähnliche Energie ab als 3H. Für SPA-Assays können entweder 3H- oder 125I-markierte Liganden effektiv verwendet werden.

Radioaktive Ligandenbindungsassays können in verschiedenen Formaten durchgeführt werden. Normalerweise führen wir diesen Assay im Filtrationsformat durch, aber der Assay kann auch im SPA-Format durchgeführt werden. Das SPA-Format ist ein homogenes Format, was bedeutet, dass keine Waschschritte erforderlich sind. Beim Filtrationsassay wird der ungebundene Ligand mit Hilfe eines Vakuumverteilers oder eines Zellsammlers abgewaschen.

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Assay-Formate

Filtrations-Ligandenbindungsassays

Sehen Sie sich weitere Informationen darüber an, welche Materialien Sie benötigen, welche Optimierungen Sie möglicherweise vornehmen müssen und welche Referenzen für radioaktive Ligandenbindungs-Filterplattenassays bestehen. Im Filtrationsformat wird der Bindungstest zunächst in einer Testplatte durchgeführt und dann durch eine Filtermatte oder eine UniFilter®-Platte gefiltert, wobei ein Zellsammler (Vakuumverteiler) verwendet wird. Die Filter werden gewaschen, um ungebundene Radioliganden zu entfernen. Die Filtermatte oder UniFilter-Platte wird dann getrocknet und mit Szintillationscocktail (oder Meltilex®) versetzt, bevor sie in einem geeigneten Detektor abgelesen wird.

SPA-Ligandenbindungsassays

Sehen Sie sich weitere Informationen darüber an, welche Materialien Sie benötigen, welche Optimierungen Sie möglicherweise vornehmen müssen und welche Referenzen für SPA-Radioligandenbindungsassays bestehen. Beim SPA-Format werden Zellmembranen auf SPA-Perlen aufgefangen. Wenn der Radioligand an den Rezeptor/die Membran bindet, bringt dies die Radiochemikalie in die Nähe des SPA-Beads. Die Beta-Energie des Radioliganden kann mit dem Szintillant im Bead interagieren und ein Signal erzeugen, das gemessen werden kann. Ein Radioligand, der nicht an die Zellmembran gebunden ist, kommt nicht nahe genug an das SPA-Bead heran, um stark mit dem Szintillant zu interagieren.

Übersicht über die Ligandenbindung

Definitionen

• Affinität (Potenz): die Dichte, mit der der Ligand an den Rezeptor bindet. Dies wird in der Regel als Gleichgewichtskonstante (Kd) ausgedrückt. Je niedriger der Kd-Wert, desto höher die Affinität.
• Spezifität: beschreibt, wie selektiv ein Ligand für einen Rezeptor im Vergleich zu anderen ähnlichen Rezeptoren ist
• Kd: Die Konzentration, bei der 50% der Rezeptoren vom Radioliganden besetzt sind

Pharmakologische Klassifikationen für Liganden

Liganden

• Voller Agonist: ein Ligand, der an einen Rezeptor bindet und diesen aktiviert und eine maximale Reaktion auslöst
• Partieller Agonist: ein Ligand, der an einen Rezeptor bindet und eine submaximale Reaktion hervorruft
• Antagonist: ein Ligand, der an einen Rezeptor bindet, diesen aber nicht aktiviert. Antagonisten lösen bei alleiniger Anwendung keine Reaktion aus. Sie blockieren die Wirkung eines konkurrierenden agonistischen Liganden.
• Inverser Agonist: ein Ligand, der an einen Rezeptor bindet und die Reaktion unter das Basalniveau senkt

Versuche

I. Sättigungsexperiment: Misst das Bindungsgleichgewicht, indem eine Titration des Radioliganden durchgeführt wird, wobei die Menge des Rezeptors konstant gehalten wird.

Mit Hilfe von Sättigungskurven können Bmax (Rezeptorausprägung) und Kd (Bindungsaffinität des Liganden) bestimmt werden.

Sättigungsexperiment

• Gesamtbindung: Steigende Konzentration des Radioliganden in Abwesenheit des kalten Liganden. Misst sowohl die spezifische Bindung an den Rezeptor als auch die unspezifische Bindung.
• Unspezifische Bindung: Steigende Konzentration des Radioliganden in Anwesenheit eines kalten Liganden. Misst die Bindung des Radioliganden an Nicht-Rezeptor-Komponenten.
• Spezifische Bindung: Gesamt minus unspezifische Bindung. Misst die Bindung an den Rezeptor, spezifisch.

II. Konkurrenz-Experiment: Misst die Gleichgewichtsbindung einer einzelnen Radioligandenkonzentration in Gegenwart verschiedener Konzentrationen eines unmarkierten Konkurrenten.

Mit Hilfe von Konkurrenzkurven kann die Affinität einer großen Anzahl unmarkierter Verbindungen für einen Rezeptor im Screening bestimmt werden. IC50 und Ki können aus den Konkurrenzdaten abgeleitet werden.

Konkurrenzkurve

• IC50: Konzentration eines konkurrierenden Liganden, die die Hälfte des radioaktiven Liganden verdrängt
• Ki: Affinität eines kalten Liganden für den Rezeptor

Hinweis: Bei Änderung der Radioligandenkonzentration kann eine Verschiebung der IC50 einer Referenzverbindung beobachtet werden; der Ki bleibt jedoch gleich.

III. Kinetische Experimente: Messung der Bindungsstärke zu verschiedenen Zeiten, um die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation und Dissoziation des Radioliganden zu bestimmen.

Kinetik

• Sättigende Konzentration des zugegebenen Liganden und gebundene Menge über die Zeit, um die Kon
• Hohe Konzentration des zugegebenen unmarkierten Konkurrenten zu bestimmen und Abnahme der Bindung über die Zeit gemessen, um den Koff

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Tipps und FAQs

Allerdings, Sie sollten einen Radioliganden auswählen, der die folgenden Eigenschaften hat:

• Hohe spezifische Aktivität (> 20 Ci/mmol für einen tritiierten Liganden)
• Niedrige unspezifische Bindung (hydrophobe Liganden weisen im Allgemeinen eine höhere unspezifische Bindung auf)
• Hohe Reinheit (typischerweise > 90% rein)
• Hohe Selektivität
• Stabilität (wenn Sie Ihren Radioliganden über einen längeren Zeitraum verwenden müssen, kann die Stabilität ein Faktor sein. 125I-markierte Liganden sollten im Allgemeinen innerhalb von ein bis zwei Monaten nach dem Herstellungsdatum verwendet werden. Tritiierte Liganden sollten in der Regel innerhalb von 3 bis 6 Monaten nach dem Herstellungsdatum verwendet werden (es gibt jedoch auch Ausnahmen).

Wenn Sie Ihre Daten aufzeichnen, empfehlen wir Ihnen, die experimentell ermittelte Konzentration Ihrer Radioliganden-Arbeitslösungen zu verwenden, anstatt eine berechnete Konzentration. Einige Radioliganden kleben an den Wänden der Verdünnungsröhrchen. Es ist wichtig, dass Sie die tatsächliche Konzentration Ihres pipettierten Radioliganden bestimmen. Um die Konzentration einer Radioligandenverdünnung experimentell zu bestimmen, pipettieren Sie ein paar Mikroliter aus Ihrem Verdünnungsröhrchen und tupfen Sie sie auf eine Filtermatte. Vielleicht möchten Sie auch eine 1/10-Verdünnung dieser Probe spotten, damit Sie Ihre Ergebnisse überprüfen können. Bestimmen Sie die dpms (Zerfallszeiten pro Minute). Rechne von dpms in Curies um, indem du die folgende Gleichung verwendest:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Dann verwende die spezifische Aktivität deiner Radioligandencharge, um von Curies in Mol umzurechnen. Um die radioaktive Konzentration zu diesem Zeitpunkt zu bestimmen, teile die Anzahl der Mole durch das Volumen, das du auf die Filtermatte getupft hast.

FAQs

Q. Welche Konzentration des Radioliganden sollte ich für meine Sättigungskurve verwenden?
A. Wir empfehlen im Allgemeinen, 3-5 Konzentrationen unterhalb der Kd und 3-5 Konzentrationen oberhalb der Kd zu wählen. Die höchste Konzentration sollte das Zehnfache der Kd betragen.

Q.Welche Radioligandenkonzentration sollte für die kompetitive Bindung gewählt werden?
A. Der Radioligand wird in einer niedrigen Konzentration verwendet, normalerweise bei oder unter seinem Kd-Wert. Wenn die spezifische Aktivität niedrig ist, kann eine Konzentration oberhalb des Kd-Wertes verwendet werden, sie darf jedoch niemals bei oder über der Sättigungskonzentration liegen.

Q. Welche Art von Ligand sollte ich verwenden, um die unspezifische Bindung in meinen Sättigungskurven zu bestimmen?
A. Normalerweise sollten Sie einen Liganden wählen, der sich von Ihrem Radioliganden unterscheidet. Sie wollen nur die spezifische Bindung des Radioliganden an den Rezeptor verdrängen. Sie sollten einen Liganden wählen, der eine hohe Affinität für die Rezeptorbindungsstelle und eine geringe Affinität für unspezifische Bindungsstellen hat.

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