Ergebnisse und Diskussion
Die konstitutive Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB wird als wesentlich für die B-Zell-Transformation durch das API2-MALT1-Fusionsprotein von MALT-Lymphomen mit einer Translokation t(11;18) angesehen. Die vorübergehende Überexpression von API2-MALT1 in 293T-Zellen führt zu einer robusten Aktivierung eines NF-κB-Luciferase-Reportergens und bietet damit ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung der Mechanismen, durch die API2-MALT1 Signale an NF-κB sendet. Um die Effizienz der Transfektion zu überprüfen, haben wir in einer Reihe von Experimenten pEGFP-N2 (Clontech) ko-exprimiert. Zu unserer Überraschung stellten wir fest, dass EGFP die durch API2-MALT1 induzierte NF-κB-Aktivierung dosisabhängig hemmte (Abb. 1A). Im Gegensatz dazu hatte EGFP keinen Einfluss auf die Reporteraktivierung, die durch die Expression der p50/p65-Untereinheiten von NF-κB ausgelöst wurde (Abb. 1B), was auf eine Interferenz mit der NF-κB-Signalkaskade hindeutet, die durch API2-MALT1 stromaufwärts von NF-κB aktiviert wird.
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(A) Die Aktivierung eines NF-κB-Luciferase-Reporters durch ein Flag-tagged API2-MALT1-Fusionsprotein wird durch EGFP in einer dosisabhängigen Weise gehemmt.
(B) EGFP blockiert nicht die NF-κB-abhängige Luziferase-Aktivität, die durch die Expression der p50/p65-Untereinheiten von NF-κB induziert wird (C) Die Aktivierung eines NF-κB-Luziferase-Reporters durch Flag-API2-MALT1 wird durch EGFP, das für das TRAF6-Bindungsmotiv mutiert ist, gehemmt (D) EGFP, aber nicht pmaxGFP, verhindert die TNF-α-induzierte Aktivierung des NF-κB-Luciferase-Reporters und die Phosphorylierung von IκB-α und JUN in 293T-Zellen.
EGFP erhöht nicht die HSP70-Spiegel oder induziert HSP70B′ in 293T-Zellen.
Die Fluoreszenzintensitäten (Ex485/Em520nm) für EGFP und pmaxGFP waren beide ∼100-fach über dem Hintergrund. (E) N- und/oder C-terminale EGFP-Fusionsproteine (für API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) oder β-Tubulin) und EGFP mit einem nukleären Lokalisierungssignal (NLS) oder einer Farnysilylierungsstelle (pEGFP-F) reduzieren die TNF-α-induzierte NF-κB-Luciferase-Reporteraktivität in 293T-Zellen. Unten: Beim Menschen wird HSP70 unter normalen Bedingungen konstitutiv exprimiert, aber Hsp70B′ wird nur als Reaktion auf Stress induziert.
Es gibt keine Basalexpression von Hsp70B′.
Als positive Kontrolle für die HSP70B′-Expression wurden 293T-Zellen (Spur 2) zwei Stunden lang bei 44°C hitzeschockiert (Spur 3) und vor der Ernte 5 (Spur 4) oder 18 (Spur 5) Stunden lang bei 37°C erholt. Die NF-κB-abhängige Luziferaseaktivität wird für jedes Experiment als Fold-Induktion von vektortransfizierten Zellen und grafisch als Mittelwert und Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt.
Alle Molekulargewichtsstandards sind in kDa angegeben.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 ist eine wesentliche Signalkomponente des Antigen-Rezeptor-Wegs zu NF-κB , . Es wird angenommen, dass BCL10 die Oligomerisierung von MALT1 vermittelt, die die Bildung eines Komplexes mit TRAF6 ermöglicht. Die Oligomerisierung von TRAF6 löst die E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität seiner RING-Domäne aus, was zu einer Modifikation von IKKγ (NEMO) über Lys63-verknüpfte Polyubiquitinketten führt. Dies erleichtert dann die Interaktion von IKKγ mit der TGFβ-aktivierenden Kinase 1 (TAK1), die den IκB-Kinase-Komplex (IKK) über die Phosphorylierung von IKKβ vollständig aktiviert, was zur NF-κB-Aktivierung führt. In ähnlicher Weise aktiviert das API2-MALT1-Fusionsprotein NF-κB über die TRAF6-vermittelte Polyubiquitinierung von IKKγ . Die Interaktion von TRAF6 mit dem Carboxy-Terminus von MALT1 erfolgt über zwei potenzielle TRAF6-Bindungsmotive (PxExxAr/Ac mit Ar/Ac für einen aromatischen oder sauren Rest . Die Inspektion der EGFP-Sequenz ergab das Vorhandensein eines TRAF6-Bindungskonsenses (PNEKRD, AA 212-217). Die Kristallstruktur von EGFP zeigt, dass das PNEKRD-Motiv in einer Schleife zwischen zwei Beta-Sheets exponiert ist, was auf seine Zugänglichkeit und eine Rolle für EGFP als negativer Regulator durch Sequestrierung von TRAF6 hindeutet. Co-IP-Experimente konnten jedoch keine Interaktion zwischen EGFP und TRAF6 nachweisen (Daten nicht gezeigt), und Mutanten für den TRAF6-Bindungskonsens blockierten die NF-κB-Aktivierung durch API2-MALT1 ebenso effizient wie EGFP (Abb. 1C).
Um zu untersuchen, ob der Effekt auf API2-MALT1 beschränkt war, analysierten wir die TNF-α-induzierte NF-κB-Aktivierung in 293T-Zellen, die EGFP exprimieren. Auch hier reduzierte EGFP die NF-κB-Signalisierung, was sich in einer geringeren Reporteraktivität und einer reduzierten Phosphorylierung des NF-κB-Inhibitors IκB-α zeigte (Abb. 1D). Als nächstes untersuchten wir, ob EGFP-Fusionsproteine die gleiche Wirkung haben könnten. Sowohl N- als auch C-terminale EGFP-Fusionen blockierten die API2-MALT1- (Daten nicht gezeigt) und TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung (Abb. 1E). Neben der Aktivierung des NF-κB-Signalwegs löst die TNF-α-Behandlung auch die JNK-Signalisierung aus. Die Phosphorylierung von JUN, die auf einen aktivierten JNK-Signalweg hindeutet, wird durch EGFP nach TNF-α-Behandlung ebenfalls reduziert (Abb. 1D).
Es wurde berichtet, dass eine verlängerte Visualisierung von GFP-exprimierenden Zellen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies induziert, die zu physiologischen Veränderungen und schließlich zum Zelltod führen können. Interessanterweise hatten beide EGFP-Mutanten für den TRAF6-Bindungskonsens ihre grüne Fluoreszenz verloren, hemmten aber wirksam die NF-κB-Signalisierung (Abb. 1C). Darüber hinaus hatte pmaxGFP (Amaxa Biosystems), ein strukturell anderes fluoreszierendes Protein, keinen Einfluss auf die NF-κB- und JNK-Aktivierung bei TNF-α-Behandlung (Abb. 1D), was darauf hindeutet, dass die Hemmung nicht auf eine mit freien Radikalen verbundene Phototoxizität zurückzuführen ist. Eine andere Studie wies darauf hin, dass hohe EGFP-Spiegel das Hitzeschockprotein 70 (HSP70) induzieren können, das die NF-κB-Aktivierung über seine Interaktion mit IKKγ und TRAF6 hemmen kann. Die Induktion von HSP70 war jedoch auf Endothelzellen beschränkt, und wir konnten keine erhöhten HSP70-Spiegel oder eine Induktion von HSP70B′ in EGFP-exprimierenden 293T-Zellen beobachten (Abb. 1D-E).
Die NF-κB-Aktivierung durch API2-MALT1-Expression oder nach TNF-α-Behandlung ist mit einer Modifikation von IKKγ mit Lys63-verknüpftem Polyubiquitin durch TRAF6 bzw. TRAF2 verbunden. Darüber hinaus erfordert die TNF-α-induzierte JNK-Signalisierung die Auto-Ubiquitinierung durch TRAF2. Um eine mögliche Auswirkung von EGFP auf die RING-E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität von TRAF6 oder TRAF2 zu beurteilen, haben wir die Ubiquitinierung über eine HA-markierte Ubiquitin-Mutante überwacht, bei der nur Lys63 für die Polymerisation verfügbar ist (HA-Ub-K63). Die Expression von API2-MALT1 oder die TNF-α-Stimulation erhöhte den Gehalt an polyubiquitinierten Proteinen in 293T-Zellen und war mit einer verstärkten IKKγ-Polyubiquitinierung in Immunpräzipitaten verbunden, und beide Prozesse wurden durch EGFP blockiert (Abb. 2A, Spuren 1,2,5,6). Darüber hinaus reduzierte EGFP das Basalniveau der K63-gebundenen Polyubiquitinierung in 293T-Zellen (Abb. 2A, Spuren 3 und 4). In ähnlicher Weise stimuliert die Expression von API2-MALT1 oder eine TNFα-Behandlung die K48-verknüpfte Ubiquitinkettenbildung, die wiederum durch EGFP und sein strukturelles Homolog dsRed (Clontech), nicht aber durch pmaxGFP blockiert wird (Abb. 2B).
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(A) 293T-Zellen, die mit den angegebenen Konstrukten transfiziert und 4 Stunden lang mit 20 ng/ml TNF-α (Spur 5 und 6) behandelt wurden, wurden mit anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) und anti-EGFP-Antikörpern immunoblottiert (linke Tafel) oder anti-IKKγ-Immunpräzipitate wurden mit anti-Flag (IKKγ) oder anti-HA (Ubiquitin) immunoblottiert (rechte Tafel).
(B) EGFP beeinflusst die K48-verknüpfte Polyubiquitinierung.
293T-Zellen wurden mit einem Ubiquitin-Konstrukt transfiziert, bei dem nur Lys48 für die Polymerisation zur Verfügung steht (HA-Ub-K48), 4 Stunden lang mit 20 ng/ml TNF-α behandelt oder unbehandelt gelassen, und die Zelllysate wurden mit anti-HA (Ub-K48) und anti-EGFP-Antikörpern immunoblottiert.
Die Fluoreszenzintensitäten (Anregung 485/Emission 520 nm) für EGFP und pmaxGFP waren vergleichbar (∼100fach höher als die Hintergrundwerte), die Expression von pDs-Red wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.
(C) EGFP stabilisiert exogenes API2-Myc in 293T-Zellen durch Reduktion seiner Lys48-gebundenen Auto-Ubiquitinierung und proteasomalen Degradation.
(D) Die stabile Expression von EGFP in der Merkelzellkarzinom-Zelllinie MCC14.2 reduziert die Polyubiquitinierung und erhöht das endogene p53-Expressionsniveau.
Angegeben sind das durchschnittliche Verhältnis und die Standardabweichung der p53- zu den Aktin-Signalen (drei unabhängige Experimente), (Ub)n : polyubiquitinierte Proteine.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Um zu untersuchen, ob EGFP ausschließlich die Ubiquitinierung durch TRAF-Proteine beeinflusst, untersuchten wir API2, eine RING-E3-Ubiquitin-Ligase, die sich durch Lys48-verknüpfte Auto-Ubiquitinierung selbst destabilisiert. Die Koexpression von EGFP hemmte die durch API2 induzierte Polyubiquitinierung in 293T-Zellen, was zu einem Anstieg der API2-Expressionsmengen führte (Abb. 2C). Auch in MCC14.2-Zellen mit stabiler Expression von EGFP wurde eine geringere Ubiquitinierung im Steady-State beobachtet. Infolgedessen sind die Basalwerte von endogenem p53, die durch die Lys48-verknüpfte Ubiquitinierung durch MDM2 streng reguliert werden, in EGFP-exprimierenden Zellen leicht erhöht (Abb. 2D).
Als nächstes untersuchten wir, ob EGFP die Ubiquitinierung in vivo beeinflusst. Die Basalwerte der Polyubiquitinierung waren in Milzlymphozyten von EGFP-transgenen Mäusen reduziert, was mit einer reduzierten Phosphorylierung von IκB-α nach Antigenstimulation im Vergleich zu Kontrollmäusen einherging, was darauf hinweist, dass EGFP die B-Zell-Rezeptor-induzierte NF-κB-Aktivierung reduziert (Abb. 3A-B). API2-MALT1-transgene Mäuse haben ein Defizit an B220+/CD40+ B-Zellen in ihrem Knochenmark, da die API2-MALT1-vermittelte NF-κB-Aktivierung ihre Reifung zu naiven B-Zellen beschleunigt. Als diese API2-MALT1-transgenen Mäuse mit EGFP-Mäusen gekreuzt wurden, war das Defizit an B220+/CD40+ B-Zellen im Knochenmark der EGFP/API2-MALT1-doppeltransgenen Mäuse (Abb. 3C) wiederhergestellt, was eine Auswirkung auf die Ubiquitinierung und die NF-κB-Signalgebung in vivo belegt. In ähnlicher Weise war die Polyubiquitinierung in Leberzellen von EGFP-Mäusen reduziert und ging mit einer Stabilisierung von p53 einher, wie der Anstieg seiner Expressionsrate zeigt (Abb. 3A, D). Das wichtigste Zielgen von p53 bei durch γ-Strahlung induzierten DNA-Schäden in der Leber ist p21, das für den Zellzyklus-Stillstand und die DNA-Reparatur erforderlich ist. Dementsprechend verursachte eine durch γ-Strahlung induzierte DNA-Schädigung nicht nur eine höhere p53-Antwort in EGFP-Mäusen, sondern auch die Induktion von p21 war leicht erhöht (Abb. 3D). Schließlich wurden in vitro-Experimente durchgeführt, um festzustellen, ob EGFP die Ubiquitin-Kettenbildung direkt beeinflusst; rekombinantes EGFP hatte jedoch keinen Einfluss auf die Polyubiquitinierung eines Kontrollsubstrats (Abb. 3E), was auf eine vom Zellkontext abhängige Wirkung von EGFP auf die Ubiquitinierung hindeutet.
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(A) Western Blots von Milz- und Leberextrakten von FVB-Wildtyp- (wt) und EGFP-transgenen Mäusen, die mit Antikörpern gegen Ubiquitin, EGFP und Aktin (Ladekontrolle) nachgewiesen wurden.
(B) EGFP reduziert die Phosphorylierung von IκB-α in anti-IgM/anti-CD40-stimulierten B-Lymphozyten, die aus EGFP-Mäusen gereinigt wurden.
Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, ein repräsentatives Bild eines Experiments ist abgebildet.
Angegeben sind der Durchschnitt und die Standardabweichungen der Verhältnisse von IκB-α-P zu Aktin im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen.
(C) Das Defizit an B220+/CD40+ B-Zellen im Knochenmark von API2-MALT1-Mäusen ist in EGFP/API2-MALT1-Doppeltransgenmäusen wiederhergestellt.
Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, die Mittelwerte und Standardabweichungen sind dargestellt. eMalt1: endogenes Malt1, *a-spezifische Bande (D) EGFP-Mäuse weisen erhöhte p53-Spiegel in der Leber auf und haben verstärkte p53/p21-Reaktionen auf γ-Strahlung induzierte DNA-Schäden.
Angegeben sind der Durchschnitt und die Standardabweichungen der Verhältnisse von p53/p21 zu Aktin-Signalen im Vergleich zu Probe 1.
(E) Rekombinantes EGFP (rEGFP) verhindert nicht die Polyubiquitinierung eines Biotin-Lysozym-Substrats in vitro. (Ub)n: polyubiquitinierte Proteine.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass EGFP und EGFP-Fusionsproteine RING E3-Ubiquitin-Ligase-abhängige Prozesse wie NF-κB- und JNK-Signalisierung oder p53-Homöostase in Zelllinien und in Mäusen beeinflussen. NF-κB spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich angeborener und adaptiver Immunität, Entwicklung, Zellwachstum und Überleben. Die überlebensfördernden Signale resultieren aus der erhöhten Expression von Apoptoseinhibitoren, wie z. B. B-Zell-Leukämie/Lymphom-XL. Daher könnte die durch EGFP in Zellen oder im motorischen Kortex und Striatum des Gehirns von Mäusen induzierte Zunahme der Apoptose mit einer verringerten NF-κB-Aktivität aufgrund einer fehlerhaften Polyubiquitinierung und Aktivierung/Degradierung seiner vorgeschalteten Regulatoren zusammenhängen. Eine mangelhafte Ubiquitinierung wird auch als Ursache der Gliedergürtel-Muskeldystrophie postuliert, die mit Mutationen in Trim32, einer Ubiquitin-Ligase für Aktin, in Verbindung gebracht wird. Da sich gezeigt hat, dass EGFP die Aktin-Myosin-Interaktionen in Muskelzellen beeinträchtigt und in EGFP-Mäusen eine dilatative Kardiomyopathie auslöst, liegt die Vermutung nahe, dass die Ubiquitinierung von Aktin eine wesentliche Rolle für die normale Muskelfunktion spielt und dass ihre Deregulierung durch EGFP die oben genannten Phänotypen verursacht. Angesichts der sich abzeichnenden Rolle der Ubiquitinierung in zahlreichen zellulären Prozessen sollte die Verwendung von EGFP als Reporter in lebenden Zellen daher sorgfältig geprüft werden.
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