Der oxidativ-fermentative (OF) Test wurde 1953 von Hugh und Leifson entwickelt. Sie entwickelten OF-Medien, um zwischen oxidativen Bakterien (die nur unter aeroben Bedingungen Säure aus Kohlenhydraten produzieren) und fermentativen Bakterien (die sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen Säure produzieren) zu unterscheiden.
Saccharolytische Mikroorganismen bauen Glukose entweder fermentativ oder oxidativ ab. Die Endprodukte der Fermentation sind relativ starke Mischsäuren, die in einem herkömmlichen Fermentationstestmedium nachgewiesen werden können. Die beim oxidativen Abbau von Glukose gebildeten Säuren sind jedoch extrem schwach und geringer, so dass für den Nachweis das empfindlichere Oxidationsfermentationsmedium von Hugh und Leifson benötigt wird. Das Medium wurde hergestellt, indem die Glukosemenge über diejenige erhöht wurde, die in dem zum Nachweis der Fermentation verwendeten Medium enthalten ist, und indem die Peptonmenge verringert wurde.
Das OF-Medium von Hugh und Leifson unterscheidet sich von den Kohlenhydrat-Gärungsmedien wie folgt:
- Die Agarkonzentration wird von 3 % auf 2 % gesenkt, wodurch es eine halbfeste Konsistenz erhält (dies hilft bei der Bestimmung der Motilität des Organismus).
- Die Peptonkonzentration wird von 11 % auf 2 % gesenkt. (Verringerung der Menge an alkalischen Produkten, die durch den Stoffwechsel des Peptons entstehen; dadurch wird die neutralisierende Wirkung dieser Produkte verringert).
- Die Kohlenhydratkonzentration wird um 0,5% auf 1.0% (Die erhöhte Glukosekonzentration im Medium steigert die Produktion dieser schwachen Säuren auf ein Niveau, das mit dem Bromthymolblau-Indikator nachgewiesen werden kann.)
Prinzip:
Der oxidativ-fermentative Test bestimmt, ob bestimmte gramnegative Stäbchen Glukose durch Fermentation oder aerobe Atmung (oxidativ) verstoffwechseln. Während des anaeroben Prozesses der Gärung wird Pyruvat je nach Art der Gärung in eine Vielzahl von Mischsäuren umgewandelt. Die hohe Konzentration der bei der Gärung entstehenden Säuren färbt den Bromthymolblau-Indikator in OF-Medien in Anwesenheit oder Abwesenheit von Sauerstoff von grün auf gelb.
Einige nicht fermentierende gramnegative Bakterien verstoffwechseln Glukose durch aerobe Atmung und produzieren daher nur eine geringe Menge schwacher Säuren während der Glykolyse und des Krebszyklus. Durch die Verringerung der Peptonmenge und die Erhöhung der Glukosemenge wird der Nachweis der so produzierten schwachen Säuren erleichtert. Dikaliumphosphatpuffer wird hinzugefügt, um den Nachweis von Säuren weiter zu fördern.
Verwendungszwecke:
Der OF-Test wird verwendet, um festzustellen, ob gramnegative Bakterien Kohlenhydrate oxidativ oder durch Fermentation verstoffwechseln oder ob sie nichtacchrolytisch sind (sie haben keine Fähigkeit, die Kohlenhydrate im Medium zu verwerten).
Medien:
Hugh und Leifson’s OF Basalmedium; die Bestandteile sind wie folgt:
- Natriumchlorid : 5,0 g
- Kaliumphosphat : 0,3 g
- Pepton : 2.0 g
- Bromthymolblau:0.03 g
- Agar: 3.0 g
- Glucose : 10 g
- Wasser : 1000 ml
Der pH-Wert sollte vor dem Autoklavieren auf 7.1 eingestellt werden. Nach dem 15-minütigen Autoklavieren des Mediums bei 121°C wird dem Medium aseptisch eine filtrierte 10 %ige Kohlenhydratlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt.
Vorgehensweise
- Zwei Röhrchen mit OF-Prüfmedium mit dem Testorganismus unter Verwendung eines geraden Drahtes durch Einstechen „bis zur Hälfte des Bodens“ des Röhrchens beimpfen.
- Ein Röhrchen jedes Paares mit einer 1 cm dicken Schicht sterilen Mineralöls oder flüssigen Paraffins bedecken (es schafft anaerobe Bedingungen im Röhrchen, indem es die Diffusion von Sauerstoff verhindert) und das andere Röhrchen zur Luft hin offen lassen.
- Beide Röhrchen 48 Stunden lang bei 35°C bebrüten (langsam wachsende Bakterien benötigen möglicherweise 3 bis 4 Tage, bevor Ergebnisse beobachtet werden können)
Interpretation
Die Säureproduktion wird im Medium durch das Auftreten einer gelben Farbe nachgewiesen. Bei oxidativen Organismen kann die Farbproduktion zuerst in der Nähe der Oberfläche des Mediums festgestellt werden.
Nachfolgend sind die Reaktionsmuster aufgeführt:
- Fermentatives Ergebnis: Säureproduktion in beiden (offenen und abgedeckten) Röhrchen. Die produzierte Säure verändert den pH-Indikator, Bromthymolblau, von grün nach gelb. z.B. Escherichia coli
- Oxidatives Ergebnis: Die Säureproduktion im offenen Röhrchen (aerob) und nicht im ölbedeckten Röhrchen (anaerob) zeigt ein oxidatives Ergebnis an. Nicht fermentierende Bakterien, die Glukose über den oxidativen Stoffwechsel verstoffwechseln, liefern ein oxidatives Ergebnis. z. B. Pseudomonas aeruginosa
- Nicht saccharolytisch (negatives OF-Ergebnis): Nicht-sacchrolytische Bakterien ergeben ein negatives OF-Ergebnis. Das negative Ergebnis wird durch keine Farbveränderung im ölbedeckten Röhrchen und in einigen Fällen durch einen Anstieg des pH-Wertes (pH 7,6) angezeigt, der das Bromthymolblau im oberen Teil des offenen Röhrchens von grün nach blau verändert. Der Anstieg des pH-Wertes ist auf die Produktion von Aminen durch Bakterien zurückzuführen, die das Pepton (Protein) im Medium abbauen.
Z.B. Alcaligenes faecalis.
Qualitätskontrolle
- Glucose Fermenter: Escherichia coli
- Glucoseoxidator: Pseudomonas aeruginosa
- Nicht-saccharolytisch: Moraxella species
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