Molekulare Identifizierung von Mycobacterium-Arten, die für die öffentliche Gesundheit und die Tiermedizin von Bedeutung sind, bei Rindern im Süden Mexikos

Abstract

Die Gattung Mycobacterium verursacht eine Vielzahl von Zoonosekrankheiten. Das bekannteste Beispiel ist die zoonotische Tuberkulose durch M. bovis. Über die „nichttuberkulösen Mykobakterien (NTM)“, die ebenfalls mit Infektionen beim Menschen in Verbindung gebracht werden, ist viel weniger bekannt. Die mexikanische Norm NOM-ZOO-031-1995 regelt das Vorhandensein von M. bovis bei Rindern; für die NTM-Arten gibt es jedoch keine Regelung. Ziel dieser Studie war die Isolierung und Identifizierung nichttuberkulöser Mykobakterienarten aus Rindern lokaler Herden in der südlichen Region des Bundesstaates Mexiko durch die Identifizierung und den Nachweis des molekularen 100-bp-Markers im 23S rRNA-Gen mit anschließender Sequenzierung des 16S rRNA-Gens. Es wurden Milchproben (35) und Nasenexsudatproben (68) gesammelt. Von den 108 isolierten Stämmen wurden 39 zur Identifizierung ausgewählt. Dreizehn aus Nasenexsudaten isolierte Stämme amplifizierten den molekularen 100 bp-Marker und wurden als M. neoaurum (sechs Stämme), M. parafortuitum (vier Stämme), M. moriokaense (zwei Stämme) und M. confluentis (ein Stamm) identifiziert. Mit Ausnahme von M. parafortuitum sind die anderen identifizierten Spezies für die öffentliche Gesundheit und die Veterinärmedizin von Bedeutung, da sie für den Menschen pathogen sind, insbesondere für Menschen mit medizinischen Grunderkrankungen.

1. Einleitung

Die Gattung Mycobacterium verursacht eine Vielzahl von zoonotischen Krankheiten. Das bekannteste Beispiel ist die zoonotische Tuberkulose durch M. bovis, für die Rinder das Hauptreservoir darstellen. M. bovis ist Teil des „Tuberkulosekomplexes“, zu dem auch die Arten M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae und M. microti gehören.

Zu der Gruppe der Mykobakterien gehören die „nichttuberkulösen Mykobakterien (NTM)“, die auch mit Infektionen beim Menschen in Verbindung gebracht werden. Die NTM kommen in verschiedenen Umweltquellen wie Boden, Wasser, Vegetation, Tieren, Milchprodukten und Fäkalien vor und können unbeabsichtigt durch Einatmen, Verschlucken oder Hautpenetration übertragen werden.

Die mexikanische Norm NOM-ZOO-031-1995 regelt das Vorhandensein von M. bovis bei Rindern, um die Rindertuberkulose (bTB) zu kontrollieren und auszurotten; für die NTM-Arten gibt es jedoch keine Regelung. Die offizielle Diagnose der Rindertuberkulose aufgrund des Vorhandenseins von M. bovis auf Feldebene basiert auf dem Intrakutantest unter Verwendung eines gereinigten Proteinderivats (Tuberkulin). Obwohl dieser Test seit mehreren Jahren verwendet wird, ist er nicht sehr empfindlich und spezifisch. Etwa 20 % der an Tuberkulose erkrankten Tiere reagieren nicht auf den Test, und das Vorhandensein anderer Mykobakterienarten, sowohl des Tuberkulosekomplexes als auch von NTM-Arten, verursacht Interferenzen, die zu falsch-positiven und falsch-negativen Diagnosen führen.

Obwohl Mexiko über einen gesetzlichen Standard verfügt, wird in einigen Gebieten eine bTB-Prävalenz von über 2 % gemeldet. Angesichts der geringen Spezifität und Sensitivität des Tuberkulin-Tests ist das tatsächliche Vorhandensein von M. bovis wahrscheinlich niedriger und die Infektionsrate von Rindern mit anderen Mykobakterien wahrscheinlich höher. Daher könnten Rinderzüchter, Tierärzte, Techniker und Angestellte in der Viehwirtschaft berufsbedingt einer Infektion mit M. bovis und NTM ausgesetzt sein. Über die berufliche Exposition gegenüber Zoonosen durch NTM-Spezies ist nur sehr wenig bekannt, da die Identifizierung dieser Spezies vor der Entwicklung molekularbiologischer Identifizierungstechniken eine ziemlich schwierige Aufgabe war.

Die derzeit am häufigsten für die Diagnose von durch Mykobakterien verursachten Krankheiten verwendeten molekularbiologischen Techniken sind Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) für die Diagnose von M. Tuberkulose , die Spoligotypisierung zur Diagnose von M. bovis und der Nachweis einer 100 Basenpaare (bp) langen „spezifischen Insertion“ auf dem 23S rRNA-Gen, die für grampositive Bakterien mit einem hohen Guanin-Cytosin-Gehalt (HGC) charakteristisch ist und als molekularer Marker für diese Bakteriengruppe gilt, gefolgt von einer Sequenzanalyse des 16S rRNA-Gens zur Identifizierung der Bakterien auf Artniveau.

Zu den mit den oben genannten Techniken identifizierten NTM-Spezies gehören M. balnei, M. marinum und M. platypoecilus, die oberflächliche und tiefe Hautläsionen verursacht haben; M. kansasii bei Lungenläsionen; M. simiae bei generalisierten Infektionen; M. scrofulaceum bei Infektionen der Haut und der inneren Organe; M. szulgai in Verbindung mit Lungeninfektionen, Osteomyelitis, Tenosynovitis und Lymphadenitis; M. ulcerans in Verbindung mit subkutanen Granulomen; M. fortuitum und M. chelonae, die mit Vaskulitis, Endokarditis, Osteomyelitis, Mediastinitis, Meningitis, Keratitis und Hepatitis assoziiert sind; M. abscessus, der mit erythematösen Läsionen assoziiert ist, die zu ulzerierten Knötchen fortschreiten; und andere Spezies.

Der größte Prozentsatz des staatlichen Bestands an Rindern im Bundesstaat Mexiko in Mexiko ist in der südlichen Region konzentriert, und eine der wichtigsten wirtschaftlichen Aktivitäten ist die Rinderzucht . Die mexikanische Verordnung zur Rinderkontrolle NOM-ZOO-031-1995 konzentriert sich nur auf den Tuberkulin-Test zur Diagnose von M. bovis. Über das Vorkommen von NTM bei den Rindern der Region ist wenig bekannt. Angesichts der Möglichkeit der Identifizierung von Aktinobakterienarten durch den Nachweis des molekularen Markers mit 100 Basenpaaren auf dem 23S rRNA-Gen und der anschließenden Sequenzierung des 16S rRNA-Gens ist es möglich, die oben genannten NTM-Spezies zu identifizieren.

Das Ziel der vorliegenden Studie war die Isolierung und Identifizierung von NTM-Spezies aus Rindern der südlichen Region des Bundesstaates Mexiko. Die Mycobacterium-Spezies wurden aus Proben von Nasenexsudat und Rindermilch isoliert und durch den Nachweis des molekularen Markers mit 100 Basenpaaren im 23S rRNA-Gen mit anschließender Sequenzierung des 16S rRNA-Gens identifiziert.

2. Materialien und Methoden

2.1. Probenahme

Eine Probenahme wurde auf der Grundlage der räumlichen Verteilung von Herden mit positivem Befund für Rindertuberkulose im Bundesstaat Mexiko durchgeführt (Zaragoza et al. 2015). Es wurden vier Rinderherden in der südlichen Region des Bundesstaates Mexiko ausgewählt, eine Herde in der Gemeinde Temascaltepec und drei Herden in der Gemeinde Zacazonapan. Insgesamt wurden 103 Proben, 35 Milchproben und 68 Proben von Nasenexsudat, entnommen. Die Verteilung der Anzahl und Art der in jeder Herde entnommenen Proben ist in Tabelle 1 dargestellt.

2.2. Entnahme von Milch- und Nasenexsudatproben

Das Euter und die Brustwarzen wurden mit gereinigtem Wasser und Seife gereinigt und anschließend mit Papiertüchern abgetrocknet. Anschließend wurden die Brustwarzen mit in 70%igem Alkohol getränkten Tupfern aseptisch gereinigt. Fünf Milliliter Milch wurden direkt von der Brustwarze in sterilen 20-ml-Behältern aufgefangen, wobei der anfängliche Fluss verworfen wurde. Das Nasenexsudat wurde direkt von der Innenseite der Nasenöffnung mit einem 10 cm langen sterilen Tupfer entnommen, der anschließend in eine isotonische Kochsalzlösung (0,85 %) getaucht wurde. Die Proben von Milch und Nasensekret wurden bis zur Verarbeitung bei 4°C gelagert.

2.3. Probenverarbeitung

2.3.1. Isolierung von Mykobakterien

Die Milchproben wurden 10 Minuten lang bei 2500 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. Die Pellets aus den Milch- und Nasenexsudatproben wurden in das folgende, für Mykobakterien selektive Kulturmedium beimpft: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) und Middlebrook (BD BBL 254521), ergänzt mit 6 g Natriumpyruvat pro Liter (Middlebrook-P). Die inokulierten Medien wurden 8 Wochen lang bei 37°C bebrütet und alle 3 Tage untersucht.

2.3.2. Klassifizierung der isolierten Stämme

Die isolierten Stämme wurden nach den folgenden Merkmalen in Gruppen eingeteilt: Koloniepigmentierung, Wachstumszeit und Kolonieeigenschaften (Form, Konsistenz, Textur und Pigmentproduktion). Die isolierten Stämme wurden mit Ziehl-Neelsen gefärbt, um das Vorhandensein von säurefesten Bazillen (AFB) zu bestätigen.

2.4. DNA-Extraktion

Stämme mit mikroskopischen Merkmalen, die Mykobakterien ähneln (säurefeste Positivität), und zwei repräsentative Stämme aus jeder Gruppe wurden zur Identifizierung ausgewählt. Zur Gewinnung von Biomasse wurden die Stämme in 30 ml Middlebrook-Flüssigkulturmedium (BD BBL 254521) in 125-mL-Flaschen beimpft und 7 Tage lang bei 37 °C bebrütet. Das flüssige Medium wurde in sterile 15-mL-Falcon-Röhrchen umgefüllt und 15 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen überführt; die Röhrchen wurden dann 5 Minuten lang bei 14 000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die DNA-Extraktion aus dem resultierenden Pellet erfolgte mit dem Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega A1120).

2.5. Nachweis des molekularen Markers im 23S rRNA-Gen

Der 100 bp molekulare Marker, der sich auf dem 23S rRNA-Gen befindet, wurde nach der Methode amplifiziert, die von Roller et al. (1992) beschriebenen Methode unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, und 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Die Reaktion wurde mit einer kommerziellen Taq-DNA-Polymerase (Promega M1661) durchgeführt. Es wurden die folgenden thermischen Zyklusbedingungen verwendet: ein Vordenaturierungsschritt für 5 Minuten (94°C); 29 Zyklen mit Denaturierung für 30 Sekunden (94°C), Hybridisierung für 45 Sekunden (46°C) und Elongation für 50 Sekunden (72°C); und schließlich ein Postelongationszyklus von 5 Minuten (72°C). Die amplifizierten Fragmente wurden auf einem mit Ethidiumbromid (SIGMA 46065) gefärbten 2%igen Agarosegel bestätigt.

2.6. Amplifikation des 16S rRNA-Gens

Stämme, die den phylogenetischen Marker von 100 bp amplifizierten, wurden für die Sequenzanalyse der 16S rRNA ausgewählt. Für die Amplifikation wurden die folgenden Primer verwendet: 8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG und 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

Die Reaktion wurde mit einer kommerziellen Taq-DNA-Polymerase (Promega M1661) durchgeführt. Es wurden die folgenden thermischen Zyklusbedingungen verwendet: ein Vordenaturierungsschritt für 5 Minuten (94°C); 34 Zyklen mit Denaturierung für 30 Sekunden (94°C), Hybridisierung für 20 Sekunden (52°C) und Elongation für 1 Minute 30 Sekunden (72°C); und schließlich ein Postelongationszyklus von 7 Minuten (72°C).

Die amplifizierten Fragmente wurden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1% Agarosegel (SIGMA 46065) bestätigt. Die Produkte dieser Amplifikation wurden mit dem Amicon Ultra Filter® Kit (Millipore UFC901008) gereinigt und auf einem 1%igen Agarosegel bestätigt, um ihr Vorhandensein und ihre Qualität zu überprüfen.

2.7. Identifizierung von Mycobacterium-Spezies

Die amplifizierten Produkte des 16S rRNA-Gens wurden an den Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA, geschickt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Hilfe des Programms BioEdit analysiert und korrigiert. Aus den Vorwärts- und Rückwärtsfragmenten wurden Konsenssequenzen erstellt, die mit den zuvor in GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) hinterlegten Sequenzen unter Verwendung des BLAST-Programms und EzTaxon 2.1 verglichen wurden.

2.8. Phylogenetische Analyse

Die Sequenzen des 16S rRNA-Gens wurden für die folgenden Mykobakterienarten aus der American Type Culture Collection (ATCC) und der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) gewonnen: M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , und M. confluentis . Die Sequenzen der Sammelstämme und die der in der vorliegenden Untersuchung isolierten Stämme wurden mit dem Programm BioEdit abgeglichen. Die phylogenetische Analyse wurde mit der Methode der maximalen Parsimonie in der MEGA-Software Version 4 durchgeführt. Um die Wurzel des Kladogramms zu bilden, wurde die Sequenz von Pantoea agglomerans DSM 3493 verwendet.

3. Ergebnisse

Die 108 Stämme, die aus den 103 gesammelten Proben isoliert wurden, wurden nach ihren makroskopischen und mikroskopischen morphologischen Merkmalen in 13 Gruppen aufgeteilt (Tabelle 2). Die Gruppen 11 und 12 bestanden insbesondere aus säurefesten Stämmen.

Für die Identifizierung auf Artniveau wurden 39 Stämme ausgewählt: 10 von ihnen gehörten zu Gruppe 11 und 7 zu Gruppe 12. Zwei Stämme aus jeder der verbleibenden 11 Gruppen wurden ausgewählt, um die 39 Stämme zu vervollständigen. Der molekulare 100-Bp-Marker wurde bei 33 % (13/39) der ausgewählten Stämme gefunden. Für sie wurde das 16S rRNA-Gen zur Sequenzierung und Identifizierung auf Speziesebene amplifiziert.

Die Gesamtprävalenz von NTM in den gesammelten Proben betrug 12,6 % (13/103), wobei sowohl Milch- als auch Nasenexsudatproben berücksichtigt wurden. Die spezifische Prävalenz für Nasenexsudatproben betrug jedoch 19,1 % (13/68).

Nach dem Sequenzvergleich wurden vier NTM-Arten der Gattung Mycobacterium identifiziert; 64 % (6/13) der Stämme wiesen 98 % und 99 % Ähnlichkeiten mit M. neoaurum, während 31% (4/13) 99% Ähnlichkeit mit M. parafortuitum, 15% (2/13) 98% und 99% Ähnlichkeit mit M. moriokaense und schließlich 8% (1/13) 99% Ähnlichkeit mit M. confluentis aufwiesen (Tabelle 3).

Der phylogenetische Baum wurde mit der Gattung Mycobacterium und vier ihrer Arten gebildet, wodurch die phylogenetischen Beziehungen zwischen den Sammelstämmen und den in der vorliegenden Untersuchung isolierten Stämmen beobachtet wurden (Abbildung 1).

Abbildung 1

Phylogenetischer Baum, der durch Vergleich der 16S rRNA-Gen-Sequenzen der isolierten und der Referenzstämme erstellt wurde.

4. Diskussion

Die NTM-Spezies wurden nur aus Proben von Nasenexsudat isoliert, womit die Proben von einem der lokalen Bauernhöfe in dieser Studie ausgeschlossen wurden (Tabelle 1). Wir stellten fest, dass die spezifische Prävalenz in den Herden der südlichen Region des Bundesstaates Mexiko 19,1 % betrug. Ähnliche Studien in den Vereinigten Staaten, Südafrika, Tansania und Brasilien berichteten über NTM-Prävalenzwerte von 3,4 %, 24,5 %, 7 % bzw. 7,8 %; daher liegt der in dieser Studie ermittelte Prävalenzwert innerhalb des zuvor berichteten Bereichs. In dieser Studie wurden 13 der 39 analysierten Stämme als die NTM-Arten M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis und M. parafortuitum identifiziert.

M. neoaurum, ein Mitglied des Mycobacterium-parafortuitum-Komplexes, ist für ein breites Spektrum von Erkrankungen verantwortlich, die meisten davon für gerätebedingte Infektionen wie Hickman-Katheter, BROVIAC-Katheter, PICC-Leitungen, arteriovenöse Fisteln, die ein Polytetrafluorethylen-Transplantat enthielten, Herzschrittmacher und Endokarditis bei Herzklappenprothesen. Immungeschwächte Patienten, die diese Geräte tragen, sind die Hauptwirte, zum Beispiel Krebspatienten und Diabetiker mit Nierenversagen und Herzproblemen. M. neoaurum wurde auch bei Patienten mit Harnwegsinfektionen, Meningoenzephalitis und Veränderungen des zentralen Nervensystems, Bakteriämie und Endokarditis sowie Lungeninfektionen isoliert. Obwohl es hauptsächlich aus klinischen Fällen isoliert wurde, gibt es auch Berichte über seine Isolierung aus Milch und Rindern.

M. moriokaense wurde aus einer Sputumprobe isoliert. Obwohl er als nicht pathogen für den Menschen gilt, wurde er mit Lungenkrankheiten in Verbindung gebracht. M. confluentis wurde ebenfalls aus Sputumproben isoliert und gilt ebenso wie M. parafortuitum als nichtpathogene Spezies. M. confluentis, M. moriokaense und M. neoaurum wurden aus verschiedenen Geweben von Rindern und Wildtieren mit tuberkulösen Läsionen isoliert, während M. parafortuitum nur aus Rindermilch isoliert wurde. In unserer Arbeit wurde M. parafortuitum jedoch nur aus Nasenexsudatproben isoliert.

Die Ernährungsbedürfnisse der Mykobakterien sind bei den verschiedenen Arten unterschiedlich, was der Grund für die Verwendung verschiedener Kulturmedien war. Bemerkenswert ist, dass sieben der 13 in dieser Studie identifizierten Stämme auf Stonebrink-Medium isoliert wurden, darunter M. neoaurum, M. parafortuitum und M. moriokaense. Dieses Ergebnis stimmt mit dem von Sepúlveda et al. beschriebenen überein, die darauf hinwiesen, dass das Stonebrink-Medium für die Gewinnung verschiedener Arten der Gattung Mycobacterium geeignet ist. García-Martos und García-Agudo berichteten, dass Middlebrook-Medium optimal für die Isolierung von Actinomyceten ist, was mit der vorliegenden Untersuchung übereinstimmt, da zwei Arten, M. neoaurum und M. parafortuitum, in diesem Medium isoliert wurden. Bemerkenswert ist, dass M. confluentis nur in mit Natriumpyruvat angereichertem Middlebrook-Medium isoliert wurde; somit war die Strategie der Verwendung verschiedener Kulturmedien angemessen, da sie die Isolierung verschiedener Arten der Gattung Mycobacterium ermöglichte.

Der Nachweis des molekularen Markers im 23S rRNA-Gen grampositiver Bakterien mit HGC-Gehalt ermöglichte die Unterscheidung zwischen Stämmen von Eubakterien und Mykobakterien. Die Sequenzierungsanalyse des 16S rRNA-Gens ermöglichte die Identifizierung auf Artniveau; daher ist die Kombination dieser Methoden für die Identifizierung von NTM-Arten geeignet.

5. Schlussfolgerungen

Mit der in dieser Studie beschriebenen Methodik wurden vier NTM-Spezies isoliert und identifiziert: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum und M. parafortuitum. Diese Arten wurden zum ersten Mal aus Nasenexsudaten von Rindern aus der südlichen Region des Bundesstaates Mexiko isoliert. Drei der identifizierten Arten (M. neoaurum, M. moriokaense und M. confluentis) sind von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit und die Veterinärmedizin.

Bekanntgabe

Diese Arbeit stammt aus der Dissertation zur Erlangung des Doktortitels in Gesundheitswissenschaften (Universidad Autónoma del Estado de México), die im PNPC-CONACYT registriert ist.

Interessenkonflikte

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich für die finanzielle Unterstützung durch das Sekretariat für Forschung und Fortgeschrittene Studien der Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) durch die folgenden Forschungsstipendien bedanken: (i) „Implementation of Geographic Information Systems and Techniques of Molecular Biology, as tools in the detection and identification of Mycobacterium spp.“, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, und (ii) das Netzwerk „Microbiología y química en las Ciencias de la Salud“, 039/2014RIF.