Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering

Choosing proper restriction enzymes based on defined criteria

Um mit einem prägnanten Beispiel fortzufahren, wurde das fluoreszierende Protein tdTomato in einen alpharetroviralen Vektor kloniert. Anschließend wurde eine murine Leukämie-Zelllinie erzeugt, die tdTomato exprimiert. Diese Zelllinie wird verwendet, um Tumorzellen nach der Injektion in Mäuse in präklinischen Immunotherapiestudien zu verfolgen. Diese Klonierungsmethode ist jedoch auch auf jedes andere Gen anwendbar. Zu Beginn des Klonierungsprojekts sollte das Gen von Interesse (GOI) analysiert werden. Zunächst prüfen wir, ob unsere annotierte Sequenz ein Startcodon (ATG, das häufigste Startcodon) und eines der drei Stoppcodons (TAA, TAG, TGA) aufweist. Falls das Gen zuvor manipuliert oder mit einem anderen Gen fusioniert wurde (z. B. über eine 2A-Sequenz), kann es vorkommen, dass ein Gen von Interesse kein Stoppcodon aufweist. In solchen Fällen muss am Ende der annotierten Sequenz ein Stoppcodon hinzugefügt werden. Es ist auch von Vorteil, zu untersuchen, ob Ihre GOI einen offenen Leserahmen (ORF) enthält. Dies ist wichtig, da durch häufige Manipulationen der Sequenzen entweder durch Software oder durch Klonen fälschlicherweise Nukleotide hinzugefügt oder gelöscht werden können. Wir verwenden die Software Clone Manager (SciEd), um ORFs in unseren Plasmidsequenzen zu finden; es gibt jedoch auch mehrere kostenlose Websites, die Sie nutzen können, um ORFs zu finden, darunter den NCBI Open Reading Frame Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).

Das tdTomato-Gen enthält ein ATG-Startcodon und ein TAA-Stopcodon (Abbildung 1). Die Größe des tdTomato-Gens beträgt 716 bp.

Übersicht über den Start und das Ende des Gens von Interesse. (A) Dargestellt sind die Nukleotidsequenzen am Anfang und am Ende des tdTomato-Gens. Die Nukleotide des kodierenden Strangs sind fett gedruckt. (B) Die Nukleotidsequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die geeignete Restriktionsenzymstellen und die Kozak-Sequenz enthalten, sind dargestellt.

In einem nächsten Schritt müssen PCR-Primer, die geeignete Restriktionsenzymstellen enthalten, für die Amplifikation des GOI entworfen werden. Bei der Auswahl der optimalen Restriktionsenzyme sollten mehrere Kriterien berücksichtigt werden. Erstens sollten die Bindungsstellen für Restriktionsenzyme idealerweise an einer Mehrfachklonierungsstelle im Vektor vorhanden sein. Alternativ können sie auch stromabwärts des Promotors in Ihrer Vektoren-Sequenz liegen. Restriktionsenzyme sollten Einfachschneider sein (Einfachschneider greifen nur eine Restriktionsstelle innerhalb einer DNA-Sequenz an) (Abbildung 2A). Wenn es sich um Doppel- oder Mehrfachschneider handelt, sollten sie innerhalb einer Sequenz schneiden, die für das ordnungsgemäße Funktionieren des Vektorplasmids nicht erforderlich ist und schließlich entfernt wird (Abbildung 2B). Es ist auch möglich, ein Doppelschneider- oder Mehrfachschneider-Enzym zu wählen, das den Vektor stromabwärts des Promotors und auch nicht innerhalb einer lebenswichtigen Sequenz des Plasmids schneidet (Abbildung 2C). Doppelschneider- oder Mehrfachschneider-Enzyme haben zwei bzw. mehr Restriktionsstellen an einer DNA-Sequenz. Das Schneiden des Vektors mit Doppel- oder Mehrfachschneidern würde zu zwei identischen Enden führen. In einem solchen Fall sollte die Insertkassette an beiden Enden die gleichen Restriktionsenzymstellen enthalten. Wenn die Insert- und Vektorfragmente in einem Ligationsversuch gemischt werden, kann das Insert daher entweder in der richtigen Orientierung (vom Startcodon zum Stoppcodon) oder in umgekehrter Orientierung (vom Stoppcodon zum Startcodon) mit dem Vektor fusionieren. Ein drittes Szenario kann eintreten, wenn das Vektorfragment einen selbstligierenden Kreis bildet, in dem das Insert überhaupt nicht vorhanden ist. Nach der Inkubation der DNA mit Restriktionsenzymen wird durch die Dephosphorylierung der 5′- und 3′-Enden des Vektorplasmids mit einem alkalischen Phosphatase-Enzym das Risiko der Selbstligierung stark verringert. Daher ist es wichtig, ein Klonierungsprodukt nach der Fragmentligation auf diese drei Produkte (richtige Orientierung, umgekehrte Orientierung, Selbstligation) zu überprüfen.

Auswahl der richtigen Restriktionsenzyme anhand definierter Kriterien für die PCR-Klonierung. (A) Zwei Single-Cutter-Restriktionsenzyme (E1 und E2) befinden sich stromabwärts des Promotors. (B) Die Restriktionsenzyme E1 und E2 schneiden das Plasmid stromabwärts des Promotors mehrmals (hier zwei Mal für jedes Enzym). (C) Das Restriktionsenzym E1 schneidet das Plasmid stromabwärts des Promotors mehr als einmal. (D) Das PCR-Produkt, das das tdTomato-Gen und die Restriktionsenzymstellen enthält, wurde auf einem Gel ausgeführt, bevor es für nachgeschaltete Anwendungen extrahiert wurde.

Zweitens ist es aufgrund der höheren Klonierungseffizienz bei Verwendung von DNA-Fragmenten mit klebrigen Enden wünschenswert, dass mindestens eines (besser beide) der Restriktionsenzyme ein so genannter Sticky-End-Cutter ist. Sticky-End-Cutter schneiden die DNA asymmetrisch und erzeugen dabei komplementäre kohäsive Enden. Im Gegensatz dazu schneiden stumpfe End-Cutter die Sequenz symmetrisch und hinterlassen keine Überhänge. Das Klonen von Fragmenten mit stumpfem Ende ist schwieriger. Dennoch kann die Wahl eines höheren Molverhältnisses zwischen Insert und Vektor (5 oder mehr) und die Verwendung von 10 % Polyethylenglykol (PEG) die Ligation von Fragmenten mit stumpfem Ende verbessern.

Drittens schneiden einige Restriktionsenzyme keine methylierte DNA. Die meisten E. coli-Stämme enthalten Dam- oder Dcm-Methylasen, die DNA-Sequenzen methylieren. Dies macht sie resistent gegen methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme. Da Vektor-DNA meist in E. coli hergestellt wird, wird sie methyliert sein. Daher ist es wünschenswert, methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme zu vermeiden; manchmal ist jedoch das Isoschizomer eines methylierungsempfindlichen Restriktionsenzyms resistent gegen Methylierung. So ist beispielsweise das Enzym Acc65I empfindlich, während sein Isoschizomer kpnI resistent gegen Methylierung ist. Isoschizomere sind Restriktionsenzyme, die dieselben Nukleotidsequenzen erkennen. Bleibt keine andere Möglichkeit als die Verwendung methylierungsempfindlicher Restriktionsenzyme, muss die Vektor-DNA in dam – dcm – E. coli-Stämmen hergestellt werden. Eine Liste dieser Stämme sowie gängiger E. coli-Wirtsstämme für molekulares Klonen ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Informationen über die Methylierungssensitivität von Restriktionsenzymen werden in der Regel vom Hersteller zur Verfügung gestellt.

Viertens erleichtert es die Klonierung, wenn der für die volle Funktionalität der Restriktionsenzyme erforderliche Puffer derselbe ist, da man einen doppelten Restriktionsverdau durchführen kann. Das spart Zeit und reduziert den DNA-Verlust bei der Aufreinigung. Es kann vorkommen, dass eines der Restriktionsenzyme in einem Puffer aktiv ist und das zweite Enzym in der doppelten Konzentration desselben Puffers aktiv ist. Zum Beispiel ist das NheI-Enzym von Thermo Scientific in Tango 1X-Puffer (Thermo Scientific) und das EcoR1-Enzym in Tango 2X-Puffer (Thermo Scientific) aktiv. In solchen Fällen muss die Plasmid-DNA zunächst mit dem Enzym verdaut werden, das die höhere Pufferkonzentration benötigt (hier EcoR1). Anschließend wird der Puffer für das nächste Enzym (das eine niedrigere Konzentration benötigt (hier NheI)) im selben Puffer verdünnt. Das Aufkommen von Universalpuffern hat jedoch den Doppelverdau von DNA-Sequenzen vereinfacht. In unserem Beispiel enthält der Vektor die Restriktionsstellen AgeI und SalI. Diese Enzymstellen wurden für den Entwurf von PCR-Primern verwendet (Abbildung 1). Für einen ordnungsgemäßen Restriktionsenzymverdau ist eine hohe Reinheit des Plasmids unerlässlich. Die mit einem Spektralphotometer gemessene DNA-Absorption kann zur Bestimmung der Reinheit nach der Aufreinigung verwendet werden. DNA, Proteine und Lösungsmittel absorbieren bei 260 nm, 280 nm bzw. 230 nm. Ein OD 260/280-Verhältnis von >1,8 und ein OD 260/230-Verhältnis von 2 bis 2,2 wird bei DNA-Proben als rein angesehen. Die OD 260/280- und 260/230-Verhältnisse unserer beispielhaften Plasmidpräparate lagen bei 1,89 bzw. 2,22. Wir beobachteten, dass die Reinheit der gelförmig extrahierten Vektor- und Insert-DNA-Fragmente nach dem Restriktionsverdau geringer war; die Ligation funktioniert auch in solchen Fällen, jedoch sind bessere Ergebnisse bei Verwendung hochreiner Fragmente zu erwarten.

Für die Auswahl verschiedener Vektoren (virale Expression und Verpackung, leere Backbones, fluoreszierende Proteine, induzierbare Vektoren, Epitop-Tags, Fusionsproteine, Reportergene, artspezifische Expressionssysteme, Selektionsmarker, Promotoren, shRNA-Expression und Genom-Engineering) kann die folgende Website des Plasmid-Repositoriums hilfreich sein:http://www.addgene.org/browse/.

Eine Sammlung von Klonierungsvektoren von E. coli ist auf der folgenden Website verfügbar:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.

Entwerfen von Klonierungsprimern anhand definierter Kriterien

Für das Design von PCR-Primern überprüfen Sie die Start- und Stoppcodons Ihrer GOI. Suchen Sie die Sequenz der gewünschten Restriktionsenzyme (auf den Websites der Hersteller verfügbar) für den Vorwärtsprimer (Abbildung 3A). Sie muss sich vor der GOI befinden (Abbildung 1B). Die so genannte Kozak-Sequenz findet sich in eukaryotischen mRNAs und verbessert die Initiierung der Translation. Es ist vorteilhaft, die Kozak-Sequenz (GCCACC) vor dem ATG-Startcodon einzufügen, da sie die Translation und die Expression des gewünschten Proteins in Eukaryonten erhöht. Daher haben wir GCCACC unmittelbar nach der Restriktionsenzymsequenz AgeI und vor dem ATG-Startcodon eingefügt. Anschließend werden die ersten 18 bis 30 Nukleotide des GOI ab dem ATG-Startcodon an die Vorwärts-Primersequenz angehängt. Diese überlappenden Nukleotide binden an die Template-DNA und bestimmen die Annealing-Temperatur (Tm). Letztere liegt in der Regel über 60°C. Hier verwenden wir die Phusion high-fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific). Zur Bestimmung der optimalen Tm können Sie die folgenden Websites nutzen:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.

Design von Primern nach definierten Kriterien für die PCR-Klonierung. (A-B) Abgebildet sind die Sequenzen des Vorwärts- und des Rückwärtsprimers. Das Ende des kodierenden Strangs muss für das Design des Rückwärtsprimers in das Format des Rückwärtskomplements umgewandelt werden. Weitere Informationen finden Sie im Text.

https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.

Die Tm unseres Vorwärtsprimers beträgt 66°C.

Wählen Sie die letzten 18 bis 30 Nukleotide einschließlich des Stoppcodons Ihres GOI für das Design des Rückwärtsprimers (Abbildung 3B). Berechnen Sie dann den Tm-Wert für diese Sequenz, der über 60°C und nahe dem Tm-Wert des Vorwärtsprimers liegen sollte. Die Tm der überlappenden Sequenz unseres Reverse Primers betrug 68°C. Fügen Sie dann die Zielsequenz der zweiten Restriktionsenzymstelle (in diesem Fall SalI) unmittelbar nach dem Stoppcodon hinzu. Schließlich wandeln Sie diese zusammengesetzte Sequenz in eine Reverse-Complement-Sequenz um. Die folgenden Webseiten können verwendet werden, um die Sequenz des Reverse Primers zu bestimmen:

http://reverse-complement.com/

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis ist wichtig, da der Reverse Primer den kodierenden Strang bindet und seine Sequenz (5′ → 3′) daher umgekehrt komplementär zur Sequenz des kodierenden Strangs sein muss (Abbildung 1A).

Die Durchführung der PCR mit Proofreading-Polymerasen

Da die PCR-Reaktion einer logarithmischen Amplifikation der Zielsequenz folgt, wird jeder Replikationsfehler während dieses Prozesses amplifiziert. Die Fehlerrate von nicht-proofreading-DNA-Polymerasen wie der Taq-Polymerase liegt bei etwa 8 × 10-6 Fehlern/bp/PCR-Zyklus; proofreading-Enzyme wie die Phusion-Polymerase haben jedoch eine gemeldete Fehlerrate von 4,4 × 10-7 Fehlern/bp/PCR-Zyklus. In diesem Beispiel wurde die Phusion-DNA-Polymerase aufgrund ihrer überlegenen Zuverlässigkeit und Verarbeitungsfähigkeit verwendet. Es ist zu beachten, dass Phusion andere Temperaturanforderungen hat als andere DNA-Polymerasen. Die Primer-Tm für Phusion wird auf der Grundlage der Breslauer-Methode berechnet und ist höher als die Tm von Taq- oder pfu-Polymerasen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte die Tm auf der Grundlage der Informationen auf der Website des Enzymanbieters berechnet werden. Außerdem reichen aufgrund der höheren Geschwindigkeit von Phusion in der Regel 15 bis 30 Sekunden für die Amplifikation jedes kb der interessierenden Sequenz aus.

Nach der PCR muss das Produkt auf ein Gel geladen werden (Abbildung 2D). Die entsprechende Bande muss geschnitten und die DNA extrahiert werden. Eine Sequenzierung des PCR-Produkts ist unerlässlich, da das PCR-Produkt Mutationen enthalten kann. Es gibt mehrere PCR-Klonierungskits, von denen einige in Tabelle 2 aufgeführt sind. Wir verwendeten den Klonierungsvektor pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, Patentveröffentlichung: US 2009/0042249 A1, Genbank-Zugangsnummer EF694056.1) und klonierten das PCR-Produkt in den linearisierten Vektor. Dieser Vektor enthält ein Letalgen (eco47IR), das aktiviert wird, wenn der Vektor zirkularisiert wird. Wenn das PCR-Produkt jedoch in die Klonierungsstelle innerhalb des letalen Gens kloniert wird, wird dieses unterbrochen, so dass die Bakterien nach der Transformation Kolonien bilden können. Zirkularisierte Vektoren, die das PCR-Produkt nicht enthalten, exprimieren das toxische Gen, das somit die Bakterien abtötet und die Bildung von Kolonien verhindert. Die Bakterienklone werden dann kultiviert, die Plasmid-DNA wird isoliert und sequenziert. Die Qualität des isolierten Plasmids ist entscheidend für optimale Sequenzierungsergebnisse. Wir isolierten die Plasmid-DNA aus insgesamt 1,5 ml kultivierten Bakterien (Ausbeute 6 μg DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) unter Verwendung eines Plasmid-Mini-Preparation-Kits (QIAGEN). Der gesamte PCR-Prozess, einschließlich der Klonierung des PCR-Produkts in den Sequenziervektor und der Transfektion der Bakterien mit dem Sequenziervektor, kann an einem Tag durchgeführt werden. Am nächsten Tag werden die bakteriellen Klone über Nacht kultiviert, bevor sie zur Sequenzierung verschickt werden.

Analyse von Sequenzierungsdaten

Sequenzierungsunternehmen übermitteln Sequenzierungsdaten normalerweise als FASTA-Datei und auch als fertige Nukleotidsequenzen per E-Mail. Für die Sequenzanalyse können die folgenden Websites genutzt werden:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi

Hier konzentrieren wir uns auf die erste Website. Klicken Sie auf dieser Website auf die Option „Nucleotide Blast“ (Abbildung 4A). Es öffnet sich ein neues Fenster. Standardmäßig ist die Option „blastn“ (blast nucleotide sequences) markiert (Abbildung 4B). Markieren Sie dann das Kästchen hinter „Align two or more sequences“. Nun erscheinen zwei Felder. In das Feld „Enter Query Sequence“ (oberes Feld) fügen Sie die gewünschte Sequenz Ihres Gens von Interesse ein, die von den Restriktionsstellen flankiert wird, die Sie bereits für Ihre PCR-Primer entworfen haben. Geben Sie im Feld „Enter Subject Sequence“ (unteres Feld) die Sequenz ein oder laden Sie die FASTA-Datei hoch, die Sie von der Sequenzierfirma erhalten haben. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „BLAST“ am unteren Ende der Seite. Nach ein paar Sekunden werden die Ergebnisse auf einer anderen Seite angezeigt. Ein Teil der Alignment-Daten ist in Abbildung 4C dargestellt. Bei der Interpretation sollten die folgenden Punkte beachtet werden: 1) Die Anzahl der identischen Nukleotide (angezeigt unter dem Punkt „Identitäten“) muss gleich der Nukleotidzahl Ihres Gens von Interesse sein. In unserem Beispiel betrug die Anzahl der Nukleotide des tdTomato-Gens zusammen mit denen der Restriktionsenzymstellen und der Kozak-Sequenz 735. Dies entspricht der angegebenen Zahl (Abbildung 4C). 2) Die Sequenzidentität (unter dem Punkt „Identitäten“) sollte 100% betragen. Gelegentlich beträgt die Sequenzidentität 100 %, aber die Anzahl der identischen Nukleotide ist geringer als erwartet. Dies kann vorkommen, wenn ein oder mehrere der Ausgangsnukleotide nicht vorhanden sind. Bedenken Sie, dass alle Sequenzierungstechnologien eine Fehlerquote haben. Bei der Sanger-Sequenzierung liegt diese Fehlerquote Berichten zufolge zwischen 0,001 % und 1 %. Eine Nukleotidsubstitution, -deletion oder -insertion kann durch Analyse der Sequenzierungsergebnisse festgestellt werden. Wenn die Sequenzidentität nicht 100 % erreicht, sollte das Plasmid daher erneut sequenziert werden, um PCR-Fehler von einfachen Sequenzierungsfehlern zu unterscheiden. 3) Lücken (unter dem Punkt „Lücken“) sollten nicht vorhanden sein. Falls Lücken auftreten, sollte das Plasmid erneut sequenziert werden.

Sequenzanalyse des PCR-Produkts mit der NCBI BLAST-Plattform. (A) Auf der NCBI BLAST-Webseite ist die Option „nucleotide blast“ ausgewählt (gekennzeichnet durch die ovale Linie). (B) Die Option „blastn“ wird standardmäßig angezeigt (durch den Kreis gekennzeichnet). Die Sequenz des interessierenden Gens (flankiert von den Restriktionsstellen, die zuvor für die PCR-Primer festgelegt wurden) und das PCR-Produkt müssen in die Felder „Enter Query Sequence“ und „Enter Subject Sequence“ eingegeben werden. Die Sequenzen können auch als FASTA-Dateien hochgeladen werden. (C) Das Nukleotid-Alignment der ersten 60 Nukleotide ist dargestellt. Zwei für die Sequenzanalyse wichtige Punkte sind durch ovale Linien markiert.

Die durchschnittliche Länge eines Reads, oder Read-Länge, beträgt bei der Sanger-Sequenzierung mindestens 800 bis 900 Nukleotide. Für den pJET-Vektor müssen ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer verwendet werden, um das gesamte Gen zu sequenzieren. Diese Primer können normalerweise eine Gengröße von bis zu 1800 bp abdecken. Ist die Größe eines Gens größer als 1800, sollte für jeweils 800 zusätzliche Nukleotide ein weiterer Primer entwickelt werden. Da ein zuverlässiges Base-Calling nicht unmittelbar nach dem Primer, sondern etwa 45 bis 55 Nukleotide stromabwärts des Primers beginnt, sollte der nächste Vorwärtsprimer etwa 700 Nukleotide nach dem Beginn des Gens angesetzt werden. Für das Design dieser Primer können verschiedene Websites, einschließlich der folgenden, verwendet werden:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design

Mit einer Länge von 735 bp lag die Größe des PCR-Produkts in diesem Beispiel gut im Bereich der pJET-Sequenzierprimer.

Nach der Auswahl des sequenzgeprüften Klons wurden Vektor- und Insert-Plasmide mit den Restriktionsenzymen AgeI und SalI verdaut (Abbildung 5). Anschließend erfolgte eine Gelreinigung und Ligation der Fragmente. Die Transformation von kompetenten E. coli mit der Ligationsmischung ergab mehrere Klone, die mit Restriktionsenzymen untersucht wurden. Wir haben acht Klone untersucht, die alle das tdTomato-Insert enthielten (Abbildung 6). Es ist wichtig, Klone auszuwählen, die groß sind. Satellitenklone haben möglicherweise nicht das richtige Konstrukt. Wir verwendeten ein schnelles Plasmid-Mini-Präparationskit (Zymo Research), um das Plasmid aus 0,6 ml Bakteriensuspension zu extrahieren. Die Ausbeute und die Reinheit waren für ein restriktionsenzymbasiertes Screening zufriedenstellend (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Für die Plasmidreinigung im großen Maßstab wurde ein Maxi-Preparation Kit (QIAGEN) verwendet, um das Plasmid aus 450 ml Bakterienkultur zu extrahieren (Ausbeute 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Die erwartete Ausbeute einer pBR322-abgeleiteten Plasmidisolierung aus 1,5 ml und 500 ml Bakterienkultur beträgt etwa 2-5 μg bzw. 500-4000 μg DNA.

Vektor- und Insertplasmidkarten A) Darstellung des CloneJET-Plasmids mit dem PCR-Produkt. Die Einfügung des PCR-Produkts in die Klonierungsstelle des Plasmids unterbricht die Integrität des toxischen Gens eco47IR und ermöglicht das Wachstum von transgen-positiven Klonen. Das Plasmid wurde mit den Enzymen AgeI und SalI geschnitten, wodurch zwei Fragmente von 3 kb und 0,7 kb Größe entstanden. Das 0,7-kb-Fragment (tdTomato-Gen) wurde als Insert für die Klonierung verwendet. (B) Illustration des Vektorplasmids. Das Plasmid wurde mit den Enzymen AgeI und SalI geschnitten, wodurch zwei Fragmente von 4,9 kb und 0,7 kb Größe entstanden. Das 4,9 kb große Fragment wurde als Vektor für die Klonierung verwendet. AMP: Ampicillin-Resistenzgen; PRE: posttranskriptionelles regulatorisches Element; MPSV: myeloproliferativer Sarkomvirus-Promotor.

Screening des endgültigen Plasmids mit Restriktionsenzymen. Das fertige Plasmid ist hier abgebildet. Für das Screening wurde das Plasmid mit dem BsiwI-Enzym geschnitten, wodurch zwei Fragmente von 4,8 kb und 0,8 kb Größe entstanden. AMP: Ampicillin-Resistenzgen; PRE: posttranskriptionelles regulatorisches Element; MPSV: myeloproliferativer Sarkomvirus-Promotor.

Einige Plasmide neigen dazu, sich innerhalb des bakteriellen Wirts zu rekombinieren, wodurch Insertionen, Deletionen und Rekombinationen entstehen. In diesen Fällen kann die Verwendung eines recA-defizienten E. coli sinnvoll sein (Tabelle 1). Wenn die GOI toxisch ist, kann die Inkubation der Bakterien bei niedrigeren Temperaturen (25-30 °C) und die Verwendung von ABLE C- oder ABLE K-Stämmen das Problem umgehen.

Virale Produktion und Transduktion von Zielzellen

Um die In-vitro-Expression des geklonten Gens zu untersuchen, wurden HEK293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die für das tdTomato-Gen, das alpharetrovirale Gag/Pol und das Glykoprotein des vesikulären Stomatitis-Virus (VSVG) kodieren. Diese Zellen, die aus der menschlichen Embryonalniere stammen, lassen sich leicht kultivieren und transfizieren. Daher werden sie in der Biotechnologie und Gentherapie häufig zur Erzeugung viraler Partikel verwendet. HEK293T-Zellen müssen jeden zweiten Tag in warmem Medium geteilt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten sie keine 100%ige Konfluenz erreichen. Um eine gute Transfektionseffizienz zu erzielen, müssen diese Zellen mindestens eine Woche lang kultiviert werden, damit sie sich in der log-Phase befinden. Die Transfektionseffizienz betrug 22 %, wie anhand der Expression von tdTomato durch Fluoreszenzmikroskopie 24 Stunden später festgestellt wurde (Abbildung 7A-B). Um eine Maus-Leukämie-Zelllinie zu erzeugen, die das tdTomato-Gen für Immuntherapie-Studien exprimiert, wurden C1498-Leukämiezellen mit frisch geerntetem Virus transduziert (36 Stunden nach der Transfektion). Bildgebende Untersuchungen (Abbildung 7C) und durchflusszytometrische Analysen (Abbildung 7D) vier Tage nach der Transduktion bestätigten die Expression von tdTomato in der Mehrzahl der Zellen.

Bewertung der In-vitro-Expression des klonierten Gens. (A, B) HEK293T-Zellen wurden mit Gag/Pol-, VSVG- und tdTomato-Plasmiden transfiziert. Die Expression des tdTomato-Gens wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Fluoreszenzbilder wurden einem Hellfeldbild überlagert, um die positiv transduzierten Zellen zu unterscheiden. Die Transfektionseffizienz wurde anhand der Expression von tdTomato nach 24 Stunden bestimmt. Nicht transfizierte HEK293T-Zellen wurden als Kontrollen verwendet (blaues Histogramm). (C, D) Die murine Leukämie-Zelllinie C1498 wurde mit frischem Virus transfiziert. Vier Tage später wurde die Transgenexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie (C) und Durchflusszytometrie (D) untersucht. Nicht transduzierte C1498-Zellen wurden als Kontrollen verwendet (blaues Histogramm). Skalenbalken entsprechen 30 μm.