Ergebnisse

Um die maximale Emissionswellenlänge zur Überwachung der Fluoreszenzintensität von AMC nach der Trypsinspaltung zu ermitteln, wurden die Anregungs- und Emissionsspektren gemessen und sind in Abbildung 1 dargestellt. Die maximale Emissionswellenlänge liegt bei 440 nm.

Emissions- (blau) und Fluoreszenzspektren (rot) von 50 µmol/L AMC
Abbildung 1. Emissions- (blau) und Fluoreszenzspektren (rot) von 50 µmol/L AMC.

Um die gemessene Fluoreszenzintensität der Enzymlösung auf die Konzentration des isolierten AMC zu standardisieren, wurde eine Titration durchgeführt und die Fluoreszenz gemessen. 0,5 mL Aliquots einer 50 µmol/L AMC-Lösung wurden zu einer 2,5 mL Enzymlösung hinzugefügt, und die Anfangs- und Endkonzentrationen des isolierten AMC sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1. Isolierte AMC-Konzentrationen vor und nach der Standardisierung der Fluoreszenzintensität.

Anfangskonzentration 3 6 15 30 60 120 240
Endkonzentration 0.5 1 2.5 5 10 20 40

Die Kinetik der Trypsinaktivität wurde dann durch Messung der Fluoreszenzintensität von isoliertem AMC nach der Spaltung von Trypsin vom Substrat ermittelt. Abbildung 2 zeigt die Zeitverlaufsmessung, nachdem 0,5 mL unterschiedlicher Konzentrationen der Boc-Gln-Ala-Arg-MCA-Substratlösung zu 2,5 mL der Enzymlösung hinzugefügt wurden.

Fluoreszenzintensität unterschiedlicher Substratkonzentrationen, die der Enzymlösung hinzugefügt wurden. Die Substratkonzentrationen sind die in Tabelle 1 angegebenen Endkonzentrationen.
Abbildung 2. Fluoreszenzintensität unterschiedlicher Substratkonzentrationen, die der Enzymlösung zugesetzt wurden. Die Substratkonzentrationen sind die in Tabelle 1 angegebenen Endkonzentrationen.

Mit dem Programm Kinetics Analysis wurde aus den Fluoreszenzzeitverlaufsmessungen in Abbildung 2 ein Lineweaver-Burk-Diagramm (Abbildung 3) erstellt. Das Lineweaver-Burk-Diagramm liefert enzymkinetische Parameter wie die maximale Reaktionsgeschwindigkeit, Vmax, und die Michaelis-Menten-Konstante, Km. Vmax beschreibt die Reaktionsgeschwindigkeit, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist, während Km die Menge an Substrat angibt, mit der die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird. Vmax war 35.270 nmol/L-min-1 und Km war 5,99. Die Gleichung der Linie war 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.

Lineweaver-Burk-Plot
Abbildung 3. Lineweaver-Burk-Diagramm.