Methoden, Techniken und Protokolle der Immunzytochemie

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Um den freien Zugang des Antikörpers zu seinem Antigen zu gewährleisten, müssen die Zellen fixiert und permeabilisiert werden. Im Allgemeinen sind die Fixierungsstärken und -zeiten bei Zellen wesentlich kürzer als bei den dickeren, strukturell komplexen Gewebeschnitten. Bei der Immunzytochemie besteht die Probenvorbereitung im Wesentlichen in der Fixierung der Zielzellen auf dem Objektträger. Eine perfekte Fixierung würde die Antigene immobilisieren, während die authentische zelluläre und subzelluläre Architektur erhalten bliebe und der ungehinderte Zugang der Antikörper zu allen Zellen und subzellulären Kompartimenten möglich wäre. Die Wahl der richtigen Methode hängt von der Art des zu untersuchenden Antigens und von den Eigenschaften des verwendeten Antikörpers ab. Die Fixierungsmethoden lassen sich im Allgemeinen in zwei Klassen einteilen: organische Lösungsmittel und Vernetzungsreagenzien. Organische Lösungsmittel wie Alkohole und Aceton entfernen Lipide und dehydrieren die Zellen, während die Proteine auf der Zellarchitektur ausgefällt werden. Vernetzungsreagenzien (wie Paraformaldehyd) bilden intermolekulare Brücken, in der Regel durch freie Aminogruppen, und schaffen so ein Netz von verknüpften Antigenen. Vernetzer erhalten die Zellstruktur besser als organische Lösungsmittel, können aber die Antigenität einiger Zellbestandteile verringern und erfordern einen zusätzlichen Permeabilisierungsschritt, damit der Antikörper zur Probe gelangen kann. Die Fixierung mit beiden Methoden kann Proteinantigene denaturieren, weshalb Antikörper, die gegen denaturierte Proteine hergestellt wurden, für die Zellfärbung nützlicher sein können. Es werden verschiedene Fixierungsmethoden beschrieben. Die geeignete Fixierungsmethode sollte entsprechend der jeweiligen Anwendung gewählt werden.

1. Aceton-Fixierung

  • Zellen in -20°C Aceton für 5-10 Minuten fixieren.

  • Nach der Aceton-Fixierung ist kein Permeabilisierungsschritt erforderlich.

2. Methanol-Fixierung

  • Zellen in -20°C Methanol für 5-10 Minuten fixieren.

  • Nach der Methanolfixierung ist kein Permeabilisierungsschritt erforderlich.

3. Ethanolfixierung

  • Zellen in gekühltem 95%igem Ethanol, 5%iger Eisessig für 5-10 Minuten fixieren.

4. Methanol-Aceton-Fixierung

  • Fixieren in gekühltem Methanol, 10 Minuten bei -20 °C.

  • Überschüssiges Methanol entfernen.

  • Permeabilisieren mit gekühltem Aceton für 1 Minute bei -20 °C.

5. Methanol-Aceton-Gemisch Fixierung

  • 1:1 Methanol und Aceton-Gemisch.

  • Das Gemisch frisch herstellen und Zellen bei -20 C für 5-10 Minuten fixieren.

6. Methanol-Ethanol-Gemisch Fixierung

  • 1:1 Methanol-Ethanol-Gemisch.

  • Machen Sie das Gemisch frisch und fixieren Sie die Zellen bei -20 C für 5-10 Minuten.

7. Formalinfixierung

  • Zellen in 10% neutral gepuffertem Formalin für 5-10 Minuten fixieren.

  • Kurz mit PBS spülen.

  • Permeabilisieren mit 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten.

8. Paraformaldehyd-Triton Fixierung

  • Fixieren in 3-4% Paraformaldehyd für 10-20 Minuten.

  • Kurz mit PBS spülen.

  • Permeabilisieren mit 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten.

9. Paraformaldehyd-Methanol-Fixierung

  • Fixieren in 4% Paraformaldehyd für 10-20 Minuten.

  • Kurz mit PBS spülen.

  • Permeabilisieren mit gekühltem Methanol für 5-10 Minuten bei -20 °C.