Humane Fettsäuresynthase: Struktur und Substratselektivität der Thioesterasedomäne

Die drei katalytischen Reste des menschlichen FAS TE (Ser-2308, His-2481 und Asp-2338) sind untereinander und mit den benachbarten Resten durch ein ausgedehntes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk verbunden (Abb. 4). Die Hydroxylgruppe von Ser-2308 ist an einer kooperativen Wasserstoffbrückenbindung beteiligt, die vom benachbarten Amidgerüst von Tyr-2309 aufgenommen wird und an Nε2 von His-2481 abgegeben wird. Dies wiederum würde die Aktivierung von Ser-2308 als Nukleophil erleichtern und dazu beitragen, das tetraedrische Oxyanion-Zwischenprodukt zu stabilisieren, das sich während der katalytischen TE-Reaktion voraussichtlich bildet, wie es bei Serinhydrolasen der Fall ist. Der His-2481-Rest (Nε2) ist seinerseits an Asp-2338 (Oδ2) wasserstoffgebunden. Asp-2338 (Oδ1-Atom) geht zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen sowohl mit dem Amid des Ala-2448 als auch mit der Hydroxylgruppe von Tyr-2462 im Rückgrat ein. Tyr-2462 ist völlig unveränderlich, während Ala-2448 teilweise von Insekten bis zu Säugetieren konserviert ist (Abb. 3). Die Wechselwirkung zwischen diesen Resten und dem katalytischen Aspartatrest scheint also wichtig zu sein, um Asp-2338 in seiner besonderen Position zu halten, was ein weiterer Hinweis auf die wichtige Rolle dieses Restes ist. Das ausgedehnte Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk an der katalytischen Stelle hält das Enzym für die Aktion bereit, indem es die katalytischen Reste an ihren erforderlichen Positionen ausrichtet und platziert, ähnlich wie bei Serinhydrolasen (40).

Palmitoylketten-Bindungsstelle und Kettenlängenspezifität. Um den Mechanismus zu verstehen, durch den die TE-Domäne von FAS die Kettenlängenspezifität reguliert, haben wir die TE-Struktur auf das Vorhandensein einer Rille in der Nähe des katalytischen Zentrums untersucht, die Substrate mit langen Fettacylketten aufnehmen könnte. Das Vorhandensein von nur einer Furche ist offensichtlich, die sich an der Schnittstelle zwischen den Subdomänen A und B befindet (Abb. 5). Die Analyse mit proshape (siehe Materialien und Methoden) bestätigte das Vorhandensein der Rille mit einem Volumen von 186,9 Å3 und einer Oberfläche von 140 Å2, deren distales Ende eine Tasche bildet (Abb. 5). Die Furche befindet sich in der Nähe des Aminoterminus der TE-Domäne, die mit der ACP-Domäne von FAS verbunden ist, die die wachsenden Acylketten zum Scannen und Freigeben durch die TE-Domäne nach Erreichen der optimalen Fettsäurekettenlänge von 16 Kohlenstoffatomen hält. Die meisten Reste, die die Furche auskleiden, stammen aus der ampiphilischen Helix α8 der Subdomäne B. Andere Reste, die dazu beitragen, stammen aus der Helix α5 der Subdomäne B, der N-terminalen Helix α1 der Subdomäne A und der Schleife zwischen β2 und α2 der Subdomäne A. Die Reste, die die Furche auskleiden und größtenteils hydrophob sind, bestehen aus Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 und Lys-2426 von Helix α8, Phe-2370 und Phe-2371 von Helix α5, Leu-2222, Leu-2223 und Val-2224 von Helix α1 und Ile-2250 und Glu-2251 von der Schleife zwischen β2 und α2 (Abb. 5A ). Von diesen Resten sind Ile-2250, Glu-2251 und Lys-2426 über alle Spezies hinweg unverändert, während Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 und Phe-2423 größtenteils konserviert sind (Abb. 3). Der Rest der Reste ist bei Säugetieren vollständig konserviert (Abb. 3). Alle oben genannten Beobachtungen zusammengenommen deuten darauf hin, dass die Schnittstelle zwischen den beiden Subdomänen eine hervorragende Region für die Bindung von Fettsäureketten darstellt. Zwei Experimente wurden durchgeführt, um diese Vermutung zu untermauern und einen Einblick in die Selektivität der Fettacylketten zu erhalten.

Zunächst haben wir durch ortsgerichtete Mutagenese gezeigt, dass der Ersatz mehrerer Reste, die die Furche und die Tasche der TE-Domäne auskleiden, die TE-Aktivität reduziert, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß (Tabelle 2).

Zweitens konnten wir die Bindung eines C16-Palmitoylketten-haltigen Inhibitors Hexadecylsulfonyl-Fluorid (HDSF) in der Rille modellieren. Die Modellierung orientierte sich an den Daten der Kristallstruktur des Palmitoylproteins TE 1 (PPT1) mit kovalent gebundenem Hexadecylsulfonat (HDS) (PDB ID Code 1exw; Ref. 41) und wurde durch Energieminimierung in cns ergänzt. Wie TE enthält die katalytische Stelle von PPT1 einen konservierten katalytischen Dreiklang aus Serin, Histidin und Aspartat. Die Struktur des PPT1-HDS-Komplexes zeigte die Bildung der kovalenten Bindung zwischen dem Schwefelatom des HDS und dem Sauerstoffatom des katalytischen Serins sowie die Anwesenheit der Fettacylkette in einer langen, meist hydrophoben Oberflächenrille des Proteins (41). Das modellierte kovalent gebundene HDS in der TE-Struktur (siehe Abb. 5) zeigte mehrere Merkmale der Ligandenbindung mit wichtigen funktionellen und biochemischen Implikationen. Die Einpassung des HDS führte zu keiner größeren Umlagerung der Reste in der Bindungsstelle. Die Palmitoylkette macht eine scharfe Biegung in Bezug auf die Sulfonatgruppe, ähnlich wie sie in der gebundenen PPT1-Struktur zu sehen ist. Die Palmitoylkette mit 16 Kohlenstoffatomen passt gut in die Furche, wobei die ersten ≈12 Kohlenstoffatome dem Lösungsmittel ausgesetzt sind und die restlichen ≈4 Kohlenstoffatome in die distale Tasche eingefügt und dort festgehalten werden. Diese Übereinstimmung stimmt mit der Beobachtung überein, dass die FAS TE von Säugetieren die Bildung von Palmitinsäure als Hauptprodukt katalysiert (20). Das Vorhandensein der letzten ≈4 Kohlenstoffatome in der Tasche trägt dazu bei, die Fettsäurekette für die Hydrolyse des Palmitoyl-Acyl-Substrats zu fixieren. Die Art der Bindungsstelle, die eine freiliegende Furche mit einer geschlossenen Tasche kombiniert, ist einzigartig und für die Spezifität dieses TE ausgelegt. Die Feststellung, dass die TE-Domäne von Säugetier-FASs keine signifikante Aktivität gegenüber Fettacylketten mit weniger als 14 Kohlenstoffatomen aufweist (20), lässt sich durch eine unproduktive Bindung aufgrund der fehlenden Bindung und der daraus resultierenden größeren Mobilität der exponierten kürzeren Ketten erklären. Die letzten ≈4 Kohlenstoffatome der Palmitoylkette besetzen teilweise die distale Tasche, so dass genügend Platz für nur 2 weitere Kohlenstoffatome bleibt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem dramatischen Aktivitätsverlust, der bei Modellsubstraten mit mehr als 18 Kohlenstoffatomen beobachtet wurde (20). Es ist unklar, ob die letzten ≈4- und ≈6-Kohlenstoffatome der C16- bzw. C18-Fettacylketten in eine vorgeformte Tasche zwischen den beiden Subdomänen eingefügt werden, wie es in der Struktur der ungebundenen Form zu sehen ist, oder ob sie zunächst an eine offene Form der Domäne gebunden werden, die dann anschließend eine Scharnier-Biegebewegung zwischen den Subdomänen durchläuft, um die terminalen Kohlenstoffatome der Fettacylketten einzuschließen und die produktive Konfiguration des aktiven Bereichs zu schaffen.

Es wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, TE mit verschiedenen Analoga langkettiger Fettsäuren zu kristallisieren (z. B., Palmitoyl-CoA, Myristoyl-CoA, Stearoyl-CoA, Palmitinsäure, Hexadecylsulfonylfluorid und Palmitinsäure) zu kristallisieren, aber es wurden keine langlebigen stabilen Komplexstrukturen gefunden. Wie unabhängige Enzymaktivitäts- oder radioaktive Bindungsversuche in Lösung zeigten, dissoziierten die meisten Komplexe innerhalb von 5 Minuten bis 1 Stunde, so dass sie für Kristallisations- oder Einweichversuche ungeeignet waren.

Cryo-EM Fit der TE-Struktur. Obwohl die 20-Å-Kryo-EM-Rekonstruktionsstruktur des menschlichen FAS-Dimers beschrieben wurde (31), gab es keinen Hinweis auf die N- bis C-terminale Polarität der FAS-Untereinheit, mit Ausnahme eines früheren Hinweises aus der Antikörper-Markierung, dass sich die FAS-TE-Domäne an einem der Enden der gesamten Struktur befand (42). Wir versuchten eine vorläufige Bewertung der Polarität, indem wir die kleinere (32 kDa) menschliche FAS TE-Domänenstruktur, die das C-terminale Ende der FAS-Untereinheit einnimmt, und die größere (42 kDa) E. coli β-Ketoacylsynthase I (oder KSI) Kristallstruktur (PDB ID Code 1ek4) (43), die ein enges Homolog der N-terminalen KS-Domäne von Säugetier-FAS ist, in jedes Ende der Monomereinheit, die in der Kryo-EM-Massendichte als Kopf und Fuß bezeichnet wird (Abb. 6). Die TE-Struktur passt gut in die Spitze der als Fuß bezeichneten Substruktur, während die KSI am besten in die Spitze der als Kopf bezeichneten Substruktur passt (Abb. 6). Im FAS-Dimer interagiert die ACP-Domäne sowohl mit der TE-Domäne desselben Monomers als auch mit der Ketoacylsynthasedomäne des gegenüberliegenden Monomers, was zur Bildung von zwei aktiven Zentren an den beiden Enden des Dimers führt. Die Ausrichtung der TE-Domäne und des KS-Domänen-Homologs für die beste Anpassung am Fuß bzw. am Kopf berücksichtigte sowohl den Raum als auch die funktionelle Interaktion des ACP-Moleküls mit beiden Proteinen. Wenn die Strukturen vertauscht wurden, war die Anpassung viel schlechter, wobei einige Teile der KS-Domäne außerhalb der Dichte lagen und ein größeres Volumen an nicht berücksichtigter Dichte in der TE-Anpassung auftrat (Abb. 6).

Schlussfolgerungen. Die wichtigsten Schlussfolgerungen, die aus der Kristallstruktur der TE-Domäne des menschlichen FAS gezogen werden können, sind folgende. (i) Die TE-Domäne besteht aus zwei Subdomänen, die sich in Größe und Faltmotiven unterscheiden. (ii) Die größere Subdomäne A weist ein α/β-Motiv auf, während die kleinere Subdomäne B vollständig helikal ist. (iii) Subdomäne A steuert die katalytische Triade aus Ser-, Asp- und His-Resten bei. (iv) Die lange Furche mit einer distalen Tasche zwischen Subdomäne B und Teilen der Subdomäne A bildet die Bindungsstelle für die Fettacylkette. Die Geometrie und Beschaffenheit dieser Stelle stehen im Einklang mit der hohen Spezifität des TE für C16- bis C18-Fettacylsubstrate. Die Furche wirkt wie ein Lineal, das die richtige Substratlänge misst. (v) Die vorläufige Einpassung der TE in die Kryo-EM-Struktur des intakten menschlichen FAS deutet auf eine plausible N-zu-C-Terminus-Polarität der Untereinheiten hin. Für eine weitere Überprüfung der Anpassung und eine eingehende Analyse der FAS-Funktion ist jedoch eine höher aufgelöste Kryo-EM-Karte erforderlich.