Materialien

Duloxetin (DLX) in reiner Qualität wurde freundlicherweise von Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, Indien, als Geschenkmuster zur Verfügung gestellt. Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) in den Qualitäten 100 M, 4CM und 15 M CR wurde großzügig von Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Indien zur Verfügung gestellt. Alle anderen in der Studie verwendeten Laborchemikalien und Reagenzien waren von analytischer Reagenzienqualität. Während der gesamten Studie wurde doppelt destilliertes Wasser verwendet. Polyethylenglykol 400 wurde von S.D. Fine Chem Ltd. in Boisar, Indien, bezogen. Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und Natriumhydroxid wurden von CDH Ltd. aus Neu-Delhi, Indien, bezogen. Ethanol, absolut, wurde von Changshu Yangyuan Chemical, China, bezogen. n-Octanol wurde von E-Merck (India) Ltd. in Mumbai, Indien, erworben. Dialysemembran150 wurde von Hi Media Laboratories Ltd. aus Mumbai bezogen. Alle Materialien und Pulver wurden unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.

Ausrüstung

UV-Spektren wurden mit dem Perkin Elmer lambda 15 UV/visible Spektrophotometer im UV/visible Bereich von 190 bis 600 nm aufgenommen. Der Franz-Diffusionszellenaufbau wurde von Permegear, Inc. in den USA bezogen. Das Infrarot-Spektrophotometer FT-IR-8300 wurde von Perkin Elmer PE RX 1 FTIR-Spektrophotometer bezogen. Die Spektren der Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) wurden mit dem DSC-Modell Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments) ermittelt. Die Forschungszentrifuge stammte von REMI Equipments, Mumbai, Indien. Das pH-Meter CyberScan pH 510 wurde von Eutech Instruments, Indien, bezogen.

Vorformulierungsstudien

Zubereitung von phosphatgepufferter Salzlösung pH 7.4

0,19 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,38 g Dinatriumhydrogenorthophosphat und 8,0 g NaCl wurden in destilliertem Wasser aufgelöst und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Der pH-Wert des Puffers wurde auf 7,4 eingestellt.

Quantifizierung von Duloxetinhydrochlorid

Der Gehalt an Duloxetin wurde durch UV-spektrophotometrische Analyse in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 analysiert. Das Scannen der Stammlösung wurde im UV-Bereich von 190 bis 400 nm durchgeführt. Das λ max wurde bei einer Wellenlänge von 289 nm ermittelt. Stammlösung A (250 μ/ml) von Duloxetinhydrochlorid wurde durch Auflösen von 0,0250 g des Arzneimittels in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) auf 100 ml hergestellt. Ferner wurden serielle Verdünnungen von 1 μg/ml bis 100 μg/ml Duloxetin durch Verdünnung der Stammlösungen A und B mit Phosphatpuffer (pH 7,4) hergestellt. Die Absorptionswerte der Verdünnungen wurden bei λ max von DLX, d. h., Die Absorptionswerte der Verdünnungen wurden bei 289 nm gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4), die als Leerwert genommen wurde, gemessen, und die Kalibrierungskurve wurde aufgezeichnet.

Physikochemische Charakterisierung von Duloxetinhydrochlorid

Bestimmung des Schmelzpunkts

Eine kleine Menge Duloxetinhydrochlorid wurde in ein Kapillarröhrchen (an einem Ende verschmolzen) gegeben und in ein Schmelzpunktgerät gegeben, und die Schmelztemperatur wurde aufgezeichnet. Zu diesem Zweck wurden drei separate Messungen durchgeführt und der Durchschnittswert ermittelt.

Bestimmung des Verteilungskoeffizienten

Der Verteilungskoeffizient von Duloxetinhydrochlorid wurde im Octanol-Wasser-System (Wells 2002) bestimmt. Die beiden Phasen wurden im Verhältnis 1:1 v/v genommen und in einem Wasserbadschüttler bei 37 °C gegenseitig gesättigt und dann getrennt. Zehn Milligramm des Arzneimittels wurden zu einer Mischung aus 20 ml vorgesättigter organischer Phase und 20 ml vorgesättigtem Wasser gegeben und 10 Minuten lang geschüttelt. Die Kolben wurden dann 24 Stunden lang bei 37 °C unter ständigem Schütteln gelagert. Anschließend wurde die Mischung zentrifugiert, um die wässrige und die nichtwässrige Phase zu trennen. Die beiden Phasen wurden getrennt spektrophotometrisch auf Duloxetin untersucht. Der Verteilungskoeffizient des Arzneimittels „K o/w“ wurde dann aus dem Verhältnis der Arzneimittelkonzentration in Octanol und in der wässrigen Phase berechnet.

Studien zur Wechselwirkung zwischen Arzneimittel und Polymer

Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) wurde zur Analyse des reinen Arzneimittels DLX, der physikalischen Mischung aus DLX und HPMC (15 CR, 100 M und 4 M) sowie der mit dem Arzneimittel beladenen transdermalen Pflaster unter Verwendung der KBr-Pellet-Methode eingesetzt. Alle Proben wurden von 400 bis 4000 cm-1 gescannt.

Differential Scanning Calorimetry

Mögliche Wechselwirkungen zwischen dem Arzneimittel und dem verwendeten Polymer wurden anhand von DSC-Thermogrammen des reinen Arzneimittels Duloxetinhydrochlorid und der Formulierung (HPMC + Arzneimittel) analysiert, die mit dem DSC-Modell Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments) erhalten wurden. Alle Proben wurden in Aluminiumwannen mit flachem Boden versiegelt und über einen Temperaturbereich von 25 bis 300 °C mit einer Steigerungsrate von 5 °C/min erhitzt.

Herstellung von transdermalen Pflastern

Transdermale Filme, die Duloxetinhydrochlorid enthalten, wurden auf Glasobjektträger durch Lösungsmittelverdampfung unter Verwendung verschiedener HPMC-Qualitäten (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) in Gegenwart und Abwesenheit eines Weichmachers gegossen. In allen Fällen wurde PEG 400 (5%) als Weichmacher verwendet. Tabelle 1 zeigt die Formeln und die Zusammensetzung für die verschiedenen Arten von formulierten Pflastern. Duloxetinhydrochlorid (60 mg) wurde in einem Wasser-Methanol-Gemisch (7:3) aufgelöst. Die Wirkstoffmatrix wurde durch Auflösen unterschiedlicher Konzentrationen (1 % und 1,5 % w/v) von HPMC im gleichen Lösungsmittelsystem hergestellt. Die Lösung wurde 24 Stunden lang nicht bewegt. Dann wurde die Lösung mit Hilfe einer Spritze und einer Nadel in einen Glasring mit einem Durchmesser von 5,0 cm auf der Glasoberfläche gegossen. Das Lösungsmittel wurde 6 Stunden lang in einem thermostatisch kontrollierten Ofen bei 60 °C verdampft. Die Pflaster wurden vor der Verwendung 7 Tage lang in einem luftdichten Behälter unter Umgebungsbedingungen gelagert.

Tabelle 1 Formeln und Zusammensetzung der formulierten transdermalen Systeme von Duloxetin HCl

Bewertung der transdermalen Pflaster

Physikalisches Aussehen

Alle vorbereiteten Pflaster wurden visuell auf Farbe, Klarheit, Flexibilität und Glätte geprüft.

Dicke des Pflasters

Die Dicke der arzneimittelhaltigen Pflaster wurde mit einem Schraubenmikrometer an drei verschiedenen Stellen des Pflasters gemessen. Die Durchschnittswerte und die Standardabweichung der drei Messwerte wurden für jedes arzneimittelbeladene Pflaster berechnet.

Gleichmäßigkeit des Gewichts

Die Pflaster wurden einem Test der Gewichtsvariation unterzogen, indem alle Pflaster auf einer digitalen Waage gewogen wurden. Die Bestimmungen wurden für jede Formulierung in dreifacher Ausführung durchgeführt. Anschließend wurden das Durchschnittsgewicht und die Standardabweichung berechnet.

Glättungsstudie

Die Glättungsstudie wurde durchgeführt, um zu prüfen, ob die hergestellten transdermalen Pflaster eine glatte Oberfläche besitzen und sich nicht mit der Zeit zusammenziehen. Es wurden drei Längsstreifen an drei verschiedenen Stellen aus der Folie geschnitten. Die Länge jedes Streifens wurde gemessen und die Längenvariation aufgrund von Ungleichmäßigkeiten in der Ebenheit durch Bestimmung der prozentualen Einschnürung ermittelt, wobei 0 % Einschnürung einer 100 %igen Ebenheit entspricht. Die prozentuale Einschnürung wurde als (l 1 – l 2)/l 1 × 100 ermittelt. Dabei ist l 1 die anfängliche Länge jedes Streifens und l 2 die endgültige Länge jedes Streifens.

Faltfestigkeit

Dieser Test wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des Weichmachers und die Festigkeit des mit verschiedenen Polymeren hergestellten Pflasters zu prüfen. Die Faltfestigkeit ist definiert als die Anzahl der Faltungen, die erforderlich sind, um ein Polymerpflaster zu brechen. Die Faltfestigkeit wurde manuell gemessen, indem ein kleiner Streifen der Folie (2 × 2 cm) wiederholt an derselben Stelle gefaltet wurde, bis er riss. Die Anzahl der Male, die das Pflaster an der gleichen Stelle gefaltet werden konnte, ohne zu brechen, ergab den Wert der Faltfestigkeit. Für den Test wurden drei Pflaster jedes Typs entnommen.

Prozentuale Feuchtigkeitsabsorption/Wasserdampfabsorption

Der Test zur prozentualen Feuchtigkeitsabsorption wurde durchgeführt, um die physikalische Stabilität und Integrität der Folien bei hoher Luftfeuchtigkeit zu prüfen. Die vorbereiteten Filme (3,14 cm2) wurden einzeln genau gewogen und in einem Exsikkator mit 100 ml gesättigter Kaliumchloridlösung bei Raumtemperatur einer relativen Luftfeuchtigkeit von 85 ± 5% ausgesetzt. Während dieser Zeit wurden die Filme in regelmäßigen Abständen von 24, 48 und 72 Stunden gewogen. Die prozentuale Feuchtigkeitsaufnahme wurde anhand der folgenden Formel bestimmt:

Prozentualer Feuchtigkeitsgehalt

Dieser Test wurde auch durchgeführt, um die Integrität der Filme unter trockenen Bedingungen zu überprüfen. Die einzelnen transdermalen Filme (mit bestimmter Fläche) wurden in einem Exsikkator mit geschmolzenem wasserfreiem Calciumchlorid bei Raumtemperatur aufbewahrt. Während dieses Zeitraums wurden die Filme in regelmäßigen Abständen von 24, 48 und 72 Stunden gewogen. Der prozentuale Feuchtigkeitsgehalt wurde anhand der folgenden Formel bestimmt:

Wasserdampfdurchlässigkeit

Die Wasserdampfdurchlässigkeit (WVTR) ist definiert als die Menge an Feuchtigkeit, die in einer Zeiteinheit durch eine Flächeneinheit des Films hindurchgeht. Als Transmissionszellen wurden Glasfläschchen mit gleichem Volumen und Durchmesser verwendet. Die Zellen wurden gründlich gewaschen und im Ofen getrocknet. Dann wurde etwa 1 g wasserfreies geschmolzenes Kalziumchlorid in jedes Fläschchen gegeben und das Pflaster mit Hilfe eines Klebebandes über dem Rand des Fläschchens befestigt. Anschließend wurden die Fläschchen gewogen und in Exsikkatoren mit gesättigter Kaliumchloridlösung gestellt, um eine relative Luftfeuchtigkeit von 84 % aufrechtzuerhalten. Die Zellen wurden nach dem 1., 2., 3., 4., 5., 6. und 7. Tag aus den Exsikkatoren genommen und gewogen. Die Wasserdampfdurchlässigkeit wurde wie folgt bestimmt:

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

Wobei W das Gewicht des durchgelassenen Wasserdampfes, L die Dicke des Pflasters und S die exponierte Oberfläche in Quadratzentimeter ist.

Oberflächen-pH

Die Pflaster wurden 1 Stunde lang in Glasröhren mit 0,5 ml doppelt destilliertem Wasser in Kontakt gehalten und durften aufquellen. Eine kombinierte Glaselektrode wurde in die Nähe der Oberfläche des Pflasters gebracht und der pH-Wert wurde nach einer Äquilibrierungszeit von 1 Minute gemessen.

Bestimmung des Wirkstoffgehalts

Von jeder Art von Formulierung wurden 2 × 2 Stückchen abgeschnitten und in 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 gegeben. Die Lösung wurde dann durch Whatman-Filterpapier (0,45 μ) filtriert und in geeigneter Weise mit Phosphatpuffersalzlösung pH 7,4 verdünnt. Die Lösung wurde dann auf ihre Absorption bei 289 nm analysiert, wobei ein Placebo-Pflaster als Leerwert verwendet wurde. Aus den Absorptionswerten wurde der Wirkstoffgehalt bestimmt.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Franz-Diffusionszelle wurde für die In-vitro-Charakterisierung von transdermalen Formulierungen verwendet. Dies ist eine zuverlässige Methode für die Vorhersage des Wirkstofftransports durch die Haut aus topischen Formulierungen. Das Rezeptorkompartiment der Diffusionszelle wurde mit 30,0 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gefüllt, und es wurden In-vitro-Wirkstofffreisetzungsstudien mit einer synthetischen Zellophanmembran durchgeführt. Die vorbereiteten Formulierungen wurden auf die Membran im Donor-Kompartiment aufgetragen und gleichmäßig auf der Zellophanmembran verteilt. Die Anordnung wurde konstant bei 37,0 ± 2,0 °C und 50 U/min gehalten. In geeigneten Zeitabständen (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 und 24 Stunden) wurden Proben (1,0 ml Aliquots) entnommen und mit einer Menge an Medium aufgefüllt, die das Volumen der Rezeptorphase auf 30 ml hielt. Die Proben wurden spektrophotometrisch bei 289 nm analysiert.

Arzneimittelpermeation/ex vivo-Studien

Die Permeationsstudien wurden an der Haut von männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Die Ratten wurden durch Verrenkung der Wirbelsäule getötet. Die Hautproben wurden geschnitten, entfernt und mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Das anhaftende Fett- und Bindegewebe wurde mit einer stumpfen Pinzette entfernt. Die Haut wurde 6 Stunden lang in normaler Kochsalzlösung aufbewahrt. Die Haare auf der Haut der Ratte wurden vorsichtig rasiert, um periphere Schäden zu vermeiden. Das Rezeptorkompartiment der Franz-Diffusionszelle wurde mit 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gefüllt. Die vorbereiteten Formulierungen wurden auf die Haut der Ratte im Spenderkompartiment aufgetragen. Die Temperatur der Anordnung wurde konstant auf 37 ± 2 °C gehalten, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 50 U/min. geregelt. In geeigneten Zeitabständen (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 24 Stunden) wurden Proben (5 ml Aliquots) entnommen und durch die gleiche Menge an Medium ersetzt, um das Volumen der Rezeptorphase auf 30 ml zu halten. Die Proben wurden spektrophotometrisch bei einem λ max von 289 nm analysiert.

Studien zur Hautreizung

Die ethische Genehmigung für den Umgang mit Versuchstieren wurde vom Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Panjab University, Chandigarh, eingeholt, und die Studien wurden gemäß dem genehmigten Protokoll durchgeführt.

Die Albino-Wistar-Ratten wurden in Käfigen untergebracht, mit freiem Zugang zu Standard-Labordiät und Wasser. Die dorsale Bauchhaut der Ratten wurde sorgfältig rasiert, um periphere Schäden zu vermeiden, bevor die Studie 24 Stunden lang durchgeführt wurde. Das transdermale Pflaster wurde auf die nackte Haut geklebt und mit einem nicht sensibilisierenden mikroporösen Klebeband abgedeckt. Als Standard-Hautreizmittel wurde eine 0,8%ige wässrige Formalinlösung aufgetragen. Den Tieren wurde jeden Tag bis zu 7 Tage lang ein neues Pflaster aufgeklebt. Die Formulierung wurde nach 7 Tagen entfernt; der Erythemwert wurde aufgezeichnet und mit dem Standardwert verglichen. Der Erythem-Score wurde nach der Draize-Scoring-Methode (Draize et al. 1944) abgelesen und aufgezeichnet: Score 0 für kein Erythem, Score 1 für ein sehr leichtes Erythem (hellrosa), Score 2 für ein gut ausgeprägtes Erythem (dunkelrosa), Score 3 für ein mäßiges bis schweres Erythem (hellrot) und Score 4 für ein schweres Erythem (dunkelrot).

Datenanalyse

Für die n-te Probe ist V s das Volumen der entnommenen Probe, V t das Gesamtvolumen des Empfängermediums, C c die korrigierte Konzentration, C u die unkorrigierte Konzentration der n-ten Probe und C i die unkorrigierte Konzentration. Ferner wurde die korrigierte Konzentration verwendet, um die Werte der freigesetzten Arzneimittelmenge und des prozentualen Anteils des freigesetzten Arzneimittels zu jedem Zeitpunkt der Probenahme zusammen mit der Rate der Arzneimittelfreisetzung zu berechnen.

Der Permeabilitätskoeffizient ist die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel die Membran/Haut durchdringt, in μg/cm2/h. Der Permeabilitätskoeffizient wurde aus der Steigung des Graphen des prozentualen Wirkstofftransports gegen die Zeit berechnet als P = Steigung × V d/S

Hierbei ist V d das Volumen der Spenderlösung in Milliliter und S die Oberfläche des Gewebes in Quadratzentimeter.

Der Fluss (J-Wert) ist definiert als die Menge des Materials, die durch eine Einheitsquerschnittsbarriere in Einheitszeit fließt. Sie wird berechnet durch: