Ein Vergleich von Immunhistochemie und Western Blot

Von Sarah Moore, M.Sc.Überprüft von Michael Greenwood, M.Sc.

Immunhistochemie und Western Blot funktionieren beide, indem sie sich das Prinzip zunutze machen, wie Antikörper spezifisch an die im biologischen Gewebe vorhandenen Antigene binden.

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Die Immunhistochemie ist die am weitesten verbreitete Technik der Immunfärbung. Sie macht das Vorhandensein bestimmter Antigene in einer Gewebeprobe sichtbar, indem sie Antikörper verwendet, die sich an die Antigene anlagern, eine katalytische Wirkung haben und das Molekül in identifizierbare Verbindungen aufspalten. Die Visualisierung dieser Interaktion kann durch die Verwendung eines Enzyms (das ein chromogenes Signal erzeugt) oder eines Fluorophors (der ein fluoreszierendes Signal erzeugt) erreicht werden.

Der Western Blot funktioniert nach demselben Prinzip. Er wurde erstmals in den 1970er Jahren beschrieben, als Wissenschaftler ihn erfolgreich zur Klassifizierung verschiedener Proteine in biologischem Gewebe einsetzten. Seitdem wurden bedeutende Fortschritte in der Technologie gemacht, die zur Einführung der modernen fluoreszierenden, kolorimetrischen und chemilumineszierenden Western-Blot-Technik führten.

Alle Versionen der Western-Blot-Methode stützen sich auf die Funktionsweise des Antigen-Antikörper-Komplexes, um spezifische Proteine in einer Probe zu identifizieren, die entweder durch die Enzym-Substrat-Reaktionen von kolorimetrischen, chemilumineszierenden oder fluoreszierenden Molekülen angezeigt werden. Das von diesen Quellen erzeugte Licht kann verwendet werden, um Rückschlüsse auf das Vorhandensein und die Konzentration der Proteine in einer Probe zu ziehen.

Vergleich der Techniken

Obwohl beide Methoden auf dem Prinzip der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beruhen, gibt es einige wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Techniken. Im Folgenden werden diese Schritt für Schritt erläutert.

Zunächst muss die Probe für beide Techniken korrekt vorbereitet werden. Die Vorbereitung unterscheidet sich bei beiden Verfahren ganz erheblich. Für die Immunhistochemie werden die Gewebeproben je nach Größe in Scheiben geschnitten oder ganz belassen.

Die Grenze für die Größe der Proben liegt im Allgemeinen zwischen 3 µm und 5 µm. Anschließend werden die Proben in ein Medium, meist Paraffin oder Kryomedium, eingebettet. Anschließend werden die Schnitte auf Objektträger gelegt und mit immer stärkeren Alkoholwäschen dehydriert, bis schließlich ein Detergens hinzugefügt wird, um die Probe zu klären und sie für die Betrachtung unter dem Mikroskop vorzubereiten.

Beim Western Blot hingegen müssen die Proben zunächst durch Elektrophorese getrennt und dann in einer Blotting-Membran immobilisiert werden.

Auch die Methode der Probenfärbung unterscheidet sich geringfügig zwischen den beiden Techniken. Bei der Immunhistochemie werden entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper eingesetzt. Diese Antikörper werden entweder als primäre oder sekundäre Reagenzien eingestuft, wobei erstere gegen ein Zielantigen gerichtet und in der Regel unkonjugiert sind, während letztere mit einem Linkermolekül konjugiert sind, das dann Reportermoleküle rekrutiert.

Die konjugierte Version wird in einer direkten Färbemethode verwendet, bei der der Antikörper direkt mit dem Antigen in der Probe reagiert, die unkonjugierte Version wird in einer indirekten Färbemethode verwendet, bei der der unmarkierte Antikörper an das Zielantigen im Gewebe bindet, wodurch ein sekundärer Antikörper mit dem primären Antikörper reagiert.

Im Vergleich dazu wird bei der Western-Blot-Methode der Probe ein fluoreszierender Farbstoff zugesetzt, der dann einer Lichtquelle mit der entsprechenden Wellenlänge ausgesetzt wird, um die Moleküle der Fluorophore anzuregen.

Nach einiger Zeit geben die angeregten Fluorophore schließlich die Energie ab, die sie von der Lichtquelle erhalten haben, und kehren in ihren Grundzustand zurück. Durch diese Freisetzung von Energie fluoreszieren die Fluorophore und strahlen eine Lichtquelle aus, die von einem digitalen Bildverarbeitungsgerät erfasst werden kann.

Vergleich der Vor- und Nachteile

Der Hauptvorteil der Immunhistochemie besteht darin, dass die Methode es den Forschern ermöglicht, die genaue Position eines Zielproteins in einer Gewebeprobe zu ermitteln. Dieser Hauptvorteil hat dazu geführt, dass sie sich im Bereich der Neurowissenschaften als robuste Methode zur Untersuchung der Proteinexpression an den Zielorten im Gehirn etabliert hat.

Andererseits hat die Methode im Vergleich zum Western-Blot-Verfahren einen großen Nachteil. Dies ist die Tatsache, dass die Färbungen nicht wie beim Western Blot anhand einer Molekulargewichtsleiter überprüft werden, was bedeutet, dass es keine Möglichkeit gibt, zu beweisen, dass die in der Immunhistochemie gezeigten Färbungen eindeutig einem bestimmten Protein zuzuordnen sind.

Die indirekte Methode der Immunhistochemie gilt als hochempfindlich, während die direkte Methode für das Gegenteil bekannt ist und im Allgemeinen nicht in der Lage ist, kleine Konzentrationen von Zielantigenen nachzuweisen.

Die Western-Blot-Methode hat den Vorteil, dass sie sich als zuverlässige Technik zur Erfassung quantitativer Daten etabliert hat. Ihr wichtigster Vorteil ist jedoch, dass sie nachweislich ein Signal erzeugt, das proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen Proteins ist.

Außerdem wird der Western Blot häufig wegen seiner Fähigkeit gewählt, zahlreiche Zielproteine gleichzeitig nachzuweisen, was eine erhebliche Verkürzung der Testzeit und eine Verringerung der erforderlichen Ressourcen zur Folge hat.

Ein Unterschied bei den Anwendungen

Es gibt viele Überschneidungen bei den Anwendungen der beiden Techniken, da sie so ähnlich sind. Insgesamt wird die Immunhistochemie jedoch hauptsächlich als Diagnoseinstrument für zahlreiche Krebsarten eingesetzt.

Die Methode wird verwendet, um abnorme Zellen zu identifizieren, die für bestimmte Tumore charakteristisch sind. Die Methode wird auch häufig eingesetzt, um Proteine und Biomarker zu identifizieren und zu lokalisieren, die sowohl in normalem als auch in krankem Gewebe vorkommen. Schließlich wird sie auch häufig zum Nachweis zahlreicher infektiöser Organismen in Geweben verwendet.

Im Vergleich dazu wird der Western Blot hauptsächlich zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Infektionskrankheiten verwendet. Er ist in den Bereichen Molekularbiologie, Biochemie und Zellbiologie weit verbreitet, wobei seine bemerkenswertesten Anwendungen als Diagnoseinstrument für HIV und BSE eingesetzt werden.

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Geschrieben von

Sarah Moore

Nach ihrem Studium der Psychologie und dann der Neurowissenschaften entdeckte Sarah schnell ihre Freude an der Forschung und am Verfassen von Forschungsarbeiten und entwickelte eine Leidenschaft dafür, Ideen durch das Schreiben mit Menschen zu verbinden.

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