Doxycyclin ist entzündungshemmend und hemmt Staphylokokken-Exotoxin-Induzierte Zytokine und Chemokine

Staphylococcal toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1) und die strukturell verwandten Exotoxine sind bakterielle Exotoxine, die direkt an Klasse-II-Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes auf Antigen-präsentierenden Zellen binden (1, 5, 8, 18, 23) und T-Zellen aktivieren, die spezifische Vβ-Elemente exprimieren (7). Diese Toxine werden aufgrund ihrer Fähigkeit, große Populationen von T-Zellen polyklonal zu stimulieren, als Superantigene bezeichnet (1, 4, 7, 14). So sind Staphylokokken-Exotoxine (SE) potente Aktivatoren des Immunsystems und verursachen beim Menschen eine Vielzahl von Krankheiten, darunter Lebensmittelvergiftungen, toxische Schocks und Autoimmunerkrankungen (1, 2, 6, 12, 14, 22). Ihre Interaktionen mit Zellen des Immunsystems führen zu einer massiven Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (1, 4, 15, 17). Die Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1) und Gamma-Interferon (IFN-γ) sind die wichtigsten Mediatoren des Superantigen-induzierten toxischen Schocks (1, 21). Sowohl TNF-α als auch IL-1 haben eine starke immunstimulierende Wirkung und wirken synergistisch mit IFN-γ, um Immunreaktionen zu verstärken und Gewebeschäden zu fördern (16). Folglich sind diese Zytokine in hohen Konzentrationen in vivo pathogen und verantwortlich für Fieber und toxischen Schock, die durch SE ausgelöst werden (13, 14, 18, 19).

Doxycyclin ist ein Breitspektrum-Antibiotikum, das häufig bei Infektionen eingesetzt wird, die sowohl durch gramnegative als auch durch grampositive Mikroorganismen verursacht werden. Es wirkt als Bakteriostatikum und ist hochwirksam gegen viele Mikroorganismen, einschließlich Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis und Yersinia pestis. Doxycyclin gehört zur Familie der Tetracyclin-Antibiotika, deren Mitglieder nachweislich neben ihrer antimikrobiellen Wirkung auch andere biologische Wirkungen haben (10). Doxycyclin hemmt die Phorbol-12-Myristat-13-Acetat-vermittelte Matrix-Metalloproteinase 8 (MMP-8) und MMP-9 in menschlichen Endothelzellen (11). Doxycyclin verringert auch den Elastinabbau und reduziert die MMP-Aktivität in einem Modell der Aneurisma-Erkrankung (3). Kürzlich wurde gezeigt, dass Doxycyclin die Produktion von IL-1β in Lipopolysaccharid-behandelten Hornhautepithelkulturen in einem Ausmaß hemmt, das mit dem durch Kortikosteroide erreichten vergleichbar ist (25). In vivo schützte Doxycyclin Mäuse vor tödlicher Endotoxämie, indem es die Zytokin- und Nitratsekretion im Blut herunterregulierte (20). In dieser Studie wurde die modulierende Wirkung von Doxycyclin auf die durch Staphylokokken-Superantigene induzierte T-Zell-Aktivierung und Zytokinproduktion aus menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) untersucht.

Humane PBMC wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation von heparinisiertem Blut normaler menschlicher Spender isoliert. PBMC (106/ml) wurden bei 37°C in 24-Well-Platten kultiviert, die RPMI 1640-Medium und 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielten. Die Zellen wurden entweder mit SEB (200 ng/ml) oder TSST-1 (200 ng/ml) 16 Stunden lang inkubiert, und die Überstände wurden geerntet und auf IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β analysiert. Zytokine und Chemokine wurden mit einem Enzymimmunoassay mit Zytokin- oder Chemokin-spezifischen Antikörpern gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen (15, 17). Humane rekombinante Zytokine und Chemokine (20 bis 1.000 pg/ml) wurden als Standards zur Kalibrierung auf jeder Platte verwendet. Die Nachweisgrenze jedes Assays lag bei 20 pg/ml. Die Zytokin- und Chemokin-Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von Doppelproben angegeben. Doxycyclin wurde, sofern vorhanden, gleichzeitig mit dem stimulierenden Mittel zugegeben. Die Zytotoxizität wurde anhand der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) aus dem Zytosol in den Kulturüberstand gemessen. Die LDH wurde mit einem kolorimetrischen Zytotoxizitätstest-Kit (Boehringer Mannheim) nach den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die maximale Menge an freisetzbarer LDH (100 %) wurde durch Lysieren der Zellen mit 1 % Triton X-100 erzielt. Die Proliferation von T-Zellen wurde mit PBMC (105/Vertiefung) untersucht, die in dreifacher Ausführung mit SEB oder TSST-1 (200 ng/ml), mit oder ohne Doxycyclin, für 48 Stunden bei 37°C in 96-Well-Mikrotiterplatten plattiert wurden. Die Zellen wurden mit 1 μCi Thymidin (New England Nuclear, Boston, Mass.) pro Vertiefung während der letzten 5 Stunden der Kultur gepulst, wie zuvor beschrieben (15). Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter geerntet, und das inkorporierte Thymidin wurde mittels Flüssigszintillation gemessen. Alle Daten wurden mittels Student’s t-Test mit Stata (Stata Corp., College Station, Tex.) auf signifikante Unterschiede untersucht. Unterschiede zwischen Doxycyclin-behandelten und unbehandelten Kontrollgruppen wurden als signifikant angesehen, wenn P <0,05 war.

Auf der Grundlage des Berichts, dass Doxycyclin Lipopolysaccharid-induziertes IL-1 in Epithelzellen blockiert und tödliche Endotoxämie in vivo verhindert (20, 25), testeten wir die Hypothese, dass dieses Antibiotikum direkte Auswirkungen auf SE-induzierte Zytokine haben könnte. Wie in Abb. 1 gezeigt, hemmte Doxycyclin dosisabhängig die Produktion der Zytokine IL-1β, IL-6, TNF-α und IFN-γ sowie der Chemokine MCP-1, MIP-1α und MIP-1β durch mit SEB inkubierte PBMC. Eine ähnliche dosisabhängige Reduktion der Zytokine und Chemokine durch Doxycyclin wurde auch bei TSST-1-stimulierten PBMC beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die hemmende Wirkung von Doxycyclin auf SEB- oder TSST-1-vermittelte Zytokine und Chemokine, die mit PBMC von sieben normalen Spendern erhalten wurden, ist in Abb. 2 zusammengefasst. Die Produktion von MCP-1 und IFN-γ wurde durch 50 μM Doxycyclin vollständig blockiert. Diese Doxycyclin-Konzentration reduzierte IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α und MIP-1β auf 15 bis 22 %, 37 bis 41 %, 21 bis 25 %, 10 bis 15 % bzw. 59 bis 61 % der Werte von unbehandelten, SEB- oder TSST-stimulierten Zellen. TNF-β, sofern vorhanden, wurde ebenfalls auf 25 % der unbehandelten, SEB-stimulierten Zellen gehemmt. Doxycyclin war bei dieser Konzentration nicht zytotoxisch für PBMC, wie durch den Ausschluss von Trypanblau und das Fehlen der Laktatdehydrogenase-Freisetzung aus behandelten Zellen gemessen wurde. Eine vollständige Hemmung dieser Zytokine und Chemokine wurde bei hohen Doxycyclin-Dosen (>0,1 mM) beobachtet. Eine ähnliche Dosis-Wirkungs-Hemmung durch Doxycyclin wurde bei niedrigeren Konzentrationen von SEB (1 und 10 ng/ml) beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Da Superantigene auch eine T-Zell-Proliferation verursachen, wurde die Wirkung von Doxycyclin auf die SE-induzierte T-Zell-Proliferation untersucht. Abbildung 3 zeigt, dass Doxycyclin die SEB- und TSST-1-stimulierte T-Zellproliferation dosisabhängig hemmte, wobei bei 0,05 mM eine 98%ige Hemmung erreicht wurde.

Diese Studie zeigte, dass Doxycyclin die durch Superantigene vermittelte Produktion von Zytokinen und Chemokinen durch menschliche PBMC in vitro wirksam hemmte. Die durch Staphylokokken-Superantigene induzierte T-Zell-Proliferation wurde ebenfalls vollständig unterdrückt. Die Herabregulierung von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen durch Doxycyclin in SEB- und TSST-1-stimulierten PBMC deutet darauf hin, dass Doxycyclin die Pathophysiologie des toxischen Schocks beeinflussen könnte. Diese Ergebnisse erweitern die Beobachtungen anderer Forscher über die immunmodulatorischen Wirkungen von Doxycyclin zusätzlich zu seinen antimikrobiellen Aktivitäten.

Mehrere molekulare Mechanismen, sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell, könnten an den entzündungshemmenden Wirkungen von Doxycyclin beteiligt sein (11, 26). Die Unterdrückung proinflammatorischer Zytokine könnte mit der Herunterregulierung des PKC-Signalwegs durch Doxycyclin zusammenhängen, wie eine Studie über seine Auswirkungen auf die Granulombildung nahelegt (26). Die berichtete hemmende Dosis von Doxycyclin (10 bis 15 μM), die Kollagenase, Gelatinase und andere Metalloproteinasen in vitro reduziert (10, 11), ist mit der in dieser Studie verwendeten Dosis vergleichbar und liegt um ein Vielfaches höher als die im menschlichen Serum nach oraler Verabreichung von 200 mg täglich beobachtete Dosis (10, 24). Klinische Studien deuten jedoch darauf hin, dass diese Dosis ausreicht, um die Kollagenase- und Gelatinase-Aktivitäten in Extrakten aus menschlichem osteoarthritischem Knorpel ex vivo zu verringern (24). Eine subantimikrobielle Dosis von Doxycyclin (20 mg zweimal täglich) hemmt nachweislich die Kollagenaseaktivität der Zahnfleischflüssigkeit (9). Darüber hinaus wurde in In-vivo-Studien zur experimentellen Endotoxämie festgestellt, dass Doxycyclin und andere Tetrazykline entzündungsfördernde Zytokine herunterregulieren und einen Schock verhindern (20).

Zusammenfassend deuten die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass Doxycyclin proinflammatorische Zytokine und Chemokine herunterreguliert und damit seinen potenziellen Nutzen für die Behandlung des durch Superantigene ausgelösten toxischen Schocks nahelegt. In einem klinischen Umfeld, in dem der Wirt mehreren biologischen Agenzien ausgesetzt ist, darunter sowohl Bakterien als auch bakterielle Exotoxine, bietet die Verwendung von Doxycyclin den zusätzlichen Vorteil, dass es sowohl antimikrobielle als auch entzündungshemmende Wirkungen hat.