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DIAGNOSE DES ALPHA-1-ANTITRYPSIN-MANGELS DURCH DNA-ANALYSE BEI KINDERN MIT LEBERKRANKHEIT*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 und Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Hintergrund – Der Alpha-1-Antitrypsin-Mangel ist eine genetische Störung, die in einer ko-dominanten, autosomalen Form übertragen wird. Der Alpha-1-Antitrypsin-Mangel betrifft vor allem die Lunge und die Leber und führt im letzteren Fall zu neonataler Cholestase, chronischer Hepatitis oder Zirrhose. Eine genaue Diagnose des Alpha-1-Antitrypsinmangels kann durch eine biochemische oder molekulare Analyse gestellt werden. Zielsetzung – Ziel dieser Studie war es, mittels DNA-Analyse das Vorhandensein eines Alpha-1-Antitrypsin-Mangels bei 12 Kindern zu untersuchen, bei denen dieser Mangel vermutet wurde und die Labor- und klinische Merkmale der Krankheit aufwiesen. Patienten und Methoden – Es wurden zwölf Patienten im Alter von 3 Monaten bis 19 Jahren untersucht, deren Alpha-1-Antitrypsin-Serumspiegel unter dem Normalwert lag und/oder die eine Lebererkrankung unklarer Ätiologie aufwiesen. Bei den 12 Kindern wurden die mutierten Allele S und Z des Alpha-1-Antitrypsin-Gens untersucht. Die Organisation des Alpha-1-Antitrypsin-Gens wurde durch Amplifikation des Genoms mit der Polymerase-Kettenreaktion und Verdauung mit den Restriktionsenzymen Xmnl (S-Allel) und Taq 1 (Z-Allel) analysiert. Ergebnisse – Sieben der 12 Patienten hatten eine chronische Lebererkrankung unklarer Ätiologie und die anderen fünf Patienten hatten niedrige Serumspiegel von Alpha-1-Antitrypsin sowie die Diagnose einer neonatalen Cholestase und/oder chronischen Lebererkrankung unklarer Ätiologie. Fünf der 12 Patienten waren homozygot für das Z-Allel (ZZ) und zwei hatten das S-Allel mit einem anderen Allel (*S), das sich von Z unterschied. Schlussfolgerung – Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Alpha-1-Antitrypsin-Mangel bei Kindern mit chronischen Lebererkrankungen unklarer Ätiologie und/oder niedrigen Alpha-1-Antitrypsin-Werten relativ häufig ist (41,6 %). Eine korrekte Diagnose ist wichtig für eine effektive klinische Nachsorge und für die genetische Beratung.

KRÄFTE ¾ Alpha-1-Antitrypsin-Mangel. Molekulare Diagnose. Leberbiopsie.

EINFÜHRUNG

Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) ist ein 52 kDa-Glykoprotein, das hauptsächlich von Hepatozyten produziert wird, die täglich 2 g dieses Proteins in den Blutkreislauf abgeben(36). Die Hauptfunktion von A1AT besteht darin, die Wirkung der neutrophilen Elastase, einer Serinprotease, die Elastinfasern in der Lunge hydrolysiert, zu hemmen(38). Mutationen im Gen, das für A1AT kodiert, erzeugen ein Protein ohne Hemmwirkung und können zu einer Anhäufung von A1AT in Einschlusskörperchen in Hepatozyten führen, wodurch die normalen Serumspiegel dieses Proteins verringert werden(4). Dieser Mangel äußert sich als Lungenemphysem, chronische Bronchitis oder Bronchiektasie(9). Die Akkumulation von mutiertem A1AT in Hepatozyten kann auch zu neonataler Cholestase, chronischer Hepatopathie oder Zirrhose führen(33, 34).

Das A1AT-Gen ist hoch polymorph, kodominant und befindet sich auf dem längeren Arm von Chromosom 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Für dieses Gen wurden fünfundsiebzig Allele (bezeichnet als A-Z entsprechend ihren isoelektrischen Punkten) beschrieben, die auf der isoelektrischen Fokussierung von Serum zwischen pH 4 (Anode) und pH 5 (Kathode) in Polyacrylamidgelen basieren. Die gängigen Varianten wandern in die Mitte des Gels und gehören daher zur M-Familie („middle“). Eine defiziente Variante, die ursprünglich 1963 von LAURELL und ERIKSSON beschrieben wurde(21), wandert zur Kathode und wird als Z bezeichnet. Eine weitere Variante, die sich im Gel langsam bewegt, wird als S(5) bezeichnet. Dieser polymorphe „Locus“ ist allgemein als das Pi-System (Protease-Inhibitor) bekannt. Die meisten Varianten produzieren A1AT in normaler Menge und Qualität(7, 8, 25). Einige Allele, wie z. B. die Varianten S und Z, sind jedoch mit einem Mangel assoziiert, der polymorphe Häufigkeiten in kaukasischen Populationen erreicht, und es wurden Fälle eines Null-Allels berichtet, bei dem die Proteinproduktion völlig fehlt(10).

Das S-Allel resultiert aus der Substitution von Adenin durch Thiamin im Exon III des Gens, was dazu führt, dass die Glutaminsäure an Position 264 gegen Valin ausgetauscht wird und sich infolgedessen eine instabile Proteinstruktur bildet(10, 11, 19). Das Z-Allel resultiert aus der Substitution von Guanin an Position 342 durch Adenin im Exon V des Gens und führt zur Bildung eines Proteins, das sich an der inneren rauen Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums der Hepatozyten ansammelt(6). Die Diagnose eines Mangels wird in der Regel durch die Quantifizierung der Serumspiegel des Proteins zusammen mit dem elektrophoretischen Profil nach isoelektrischer Fokussierung gestellt(23, 37). Eine genauere Diagnose erfordert eine Genanalyse mit Hilfe von DNA-basierten Techniken(12, 14, 26).

Das Ziel dieser Studie war es, Träger des S- und Z-Allels bei Patienten zu identifizieren, bei denen der Verdacht auf diesen Mangel bestand und die Labor- und klinische Merkmale dieser Krankheit aufwiesen.

PATIENTEN UND METHODEN

Patienten

Im Zeitraum von Februar 1988 bis August 1997 wurde eine große Anzahl von Patienten an den pädiatrischen gastroenterologischen Dienst der Staatlichen Universität von Campinas, Campinas, SP, Brasilien, überwiesen, um Lebererkrankungen zu untersuchen. Von dieser Zahl zeigten nur 12 Patienten keine eindeutige Diagnose (negative Ergebnisse bei Virushepatitis, Autoimmunhepatitis und Morbus Wilson). Diese Patienten wurden einer molekularen Analyse von A1AT unterzogen.

Methoden

1 ¾ Studienprotokoll

2 – Leberbiopsie

Percutane Leberbiopsien wurden wie von MOWAT(24) beschrieben unter lokaler Anästhesie bei Patienten, die mindestens 4 Stunden gefastet hatten, mit Venoklysis und normaler Prothrombinaktivität durchgeführt. Das gewonnene Fragment wurde sofort in 10 %iges Formalin eingelegt und anschließend bearbeitet und mit Hämatoxylin-Eosin, Masson’s Trichromie, Preußischblau und Silberimprägnierung der Retikulumfasern gefärbt. Eine spezielle Färbung wurde mit PAS (Periodic Acid-Schiff) und anschließender Behandlung mit Diastase durchgeführt. Das Fortbestehen von eosinophil aussehenden zytoplasmatischen Granula auch nach Anwendung von Diastase wurde als positiv für A1AT-Mangel angesehen.

3 – Molekulare Analyse

Um die mutierten Allele S und Z des A1AT zu untersuchen, wurde eine DNA-Extraktion aus peripheren Blutleukozyten durchgeführt, wie sie in der von WOODHEAD et al.(39) beschriebenen Methode verwendet wird.

ERGEBNISSE

Fünf der 12 untersuchten Kinder waren Z-Homozygote (ZZ), während zwei der Kinder das S-Allel zusammen mit einem anderen Allel, das nicht Z war, hatten (*S). Tabelle 1 zeigt das Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme und die Indikation, die für die Entscheidung über die weitere Analyse herangezogen wurde. Drei der Patienten wiesen eine neonatale Cholestase als Erstmanifestation einer chronischen Hepatopathie auf.

Tabelle 2 zeigt die Serumwerte von ALT, AP, gGT, A1AT sowie die Ergebnisse der molekularen Untersuchung und der Leberbiopsie.

Die fünf Patienten mit dem ZZ-Genotyp hatten verringerte Serum-A1AT-Werte, und die Leberbiopsie ergab eine Zirrhose (einer), eine neonatale Hepatitis (zwei), eine Paucity der interlobulären Gallengänge (einer) und eine chronische Hepatitis (einer). In diesem letzten Fall (FSP) wurden in den periportalen Hepatozyten nach Färbung mit HE eosinophil anmutende zytoplasmatische Granula gesehen, die im Nachhinein durch PAS-Positivität und Diastase-Resistenz bestätigt wurden (Abbildung 1). Die beiden Patienten mit neonataler Cholestase (EKBA und RHBP) wurden im Alter von 10 bzw. 13 Wochen einer Leberbiopsie unterzogen und wiesen eosinophile PAS-positive, diastase-resistente Globuli auf.

Abbildungen 2 und 3 zeigen die Ergebnisse der Amplifikation und des Verdaus der S- bzw. Z-Allele.

DISKUSSION

Alpha-1-Antitrypsin-Mangel ist eine der häufigsten genetischen Störungen, die bei Kindern zu Lebererkrankungen führen, und die häufigste genetische Erkrankung, die eine Lebertransplantation erfordert (17, 28). A1AT-Mangel betrifft eines von 1600-2000 Neugeborenen in Nordamerika und Nordeuropa(28, 31), aber nur 10-15 % der Bevölkerung mit diesem Mangel entwickeln Lebererkrankungen(32, 33). Nach einer 1988 von SVEGER veröffentlichten Studie(33) entwickeln 11 % der Patienten mit dem PIZZ-Phänotyp während der Neugeborenenperiode eine ikterische Hepatitis. In dieser Studie wiesen drei Patienten, bei denen ein A1AT-Mangel diagnostiziert wurde, eine neonatale Cholestase auf, und bei zwei von ihnen wurde die Cholestase als idiopathisch angesehen, bevor eine eindeutige Diagnose des Mangels gestellt wurde. Fünf bis 10 Prozent der in der Literatur berichteten Fälle von idiopathischer neonataler Hepatitis werden durch einen A1AT-Mangel verursacht(3).

Bei fünf untersuchten Patienten mit diesem Mangel lagen die Serumspiegel von A1AT unter der normalen Untergrenze. Dieser Test bestätigte die Diagnose der Krankheit jedoch nicht eindeutig. Da es sich bei A1AT um ein Protein der akuten Entzündungsphase handelt, steigt seine Synthese bei entzündlichen/infektiösen Zuständen, bei Neoplasien, in der Schwangerschaft und während der Therapie mit Östrogenen und Kortikosteroiden an(16, 22). Eine Verringerung des A1AT-Serumspiegels tritt beim Atemnotsyndrom von Neugeborenen, in der Endphase des Leberversagens, bei zystischer Fibrose und in Situationen auf, in denen ein großer Proteinverlust vorliegt(15). Die Serumspiegel bei SZ-Genotypen, die theoretisch zu Lebererkrankungen führen könnten, sind in der Regel normal.

Wenn eine neonatale Cholestase vorliegt, ist grundsätzlich eine Differentialdiagnose mit einer extrahepatischen biliären Atresie erforderlich. Die klinische Anamnese erlaubt in 83 % der Fälle eine adäquate Diagnose(1), und es sind spezifische Untersuchungen erforderlich, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern. Unter diesen Untersuchungen ist die Leberbiopsie von großer Bedeutung. Die histopathologischen Veränderungen, die in der Leberbiopsie von Patienten mit A1AT-Mangel zu sehen sind, können dieselben sein, die bei idiopathischer neonataler Hepatitis oder bei extrahepatischer biliärer Atresie beobachtet werden(24). Das Vorhandensein von vorwiegend periportalen, intrahepatozystischen Globuli, die nach Diastaseverdauung stark PAS-positiv sind, ist ein hilfreicher Hinweis auf A1AT-Mangel(13, 18, 27). Es ist jedoch schwierig, diese Kügelchen vor der 12. Woche nach der Geburt zu identifizieren(35). In dieser Studie wies der Patient EKBA im Alter von 10 Wochen Globuli mit den oben genannten Merkmalen im Lebergewebe auf. Bei Patient JCI (13 Wochen alt) wurden keine solchen Kügelchen gefunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Vorhandensein von Kügelchen mit Hilfe einer speziellen Färbung in Leberfragmenten, die vor dem Alter von 12 Wochen gewonnen wurden, untersucht werden sollte, obwohl ein negatives Ergebnis die Möglichkeit eines A1AT-Mangels nicht ausschließt. Die biochemische Analyse wurde in dieser Studie nicht verwendet, da eine DNA-Analyse, die präziser ist, möglich war.

Ein A1AT-Mangel kommt relativ häufig bei Kindern vor, die eine Lebererkrankung unklarer Ätiologie haben. Diese Diagnose wird unterschätzt, wahrscheinlich weil ungenaue Diagnosemethoden verwendet werden. Die molekulare Analyse ermöglicht eine genauere Diagnose und kann auch für die genetische Beratung von Patienten mit Lebererkrankungen unbekannter Ätiologie nützlich sein.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. Zu den wichtigsten klinischen Symptomen gehören Lungen- und Leberkrebs. Die letzte Erscheinungsform ist die neonatale Kolestase, die Hepatitis crônica oder die Zirrhose. Die endgültige Diagnose wird durch eine biochemische Analyse von Alpha-1-Antitrypsin oder eine Molekularanalyse gestellt. Objetivo – In einer Gruppe von 12 Kindern mit Verdacht auf Alpha-1-Antitripsin-Defizienz das Vorhandensein einer efetiven Alpha-1-Antitripsin-Defizienz mittels DNA-Analyse zu untersuchen, um eine endgültige Diagnose zu stellen, sowie die Assoziation zwischen Alpha-1-Antitripsin-Defiziten und den festgestellten klinischen und labortechnischen Merkmalen zu untersuchen. Kasuistik und Methoden – Die mutierten Allele S und Z des Alpha-1-Antitrypsin-Gens wurden bei 12 Patienten im Alter von 3 Monaten bis 19 Jahren untersucht, die von der Ambulanz für pädiatrische Gastroenterologie der Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasilien, überwiesen wurden, weil ihre Alpha-1-Antitrypsinwerte unter dem Normalwert lagen und/oder eine Lebererkrankung ohne definierte Ätiologie vorlag. Die DNA-Analyse wurde mit der modifizierten Genamplifikationsmethode der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt, die Restriktionsstellen für die Enzyme Xmnl (S-Allel) und Taq l (Z-Allel) schafft. Ergebnisse – Von den 12 überwiesenen Patienten hatten 7 eine chronische Lebererkrankung ohne definierte Ätiologie und die anderen 5 eine niedrige Alpha-1-Antitrypsin-Serumkonzentration, die mit der Diagnose einer neonatalen Cholestase und/oder einer chronischen Lebererkrankung unbekannter Ätiologie einherging. In dieser Gruppe von 12 Patienten wurden fünf homozygote Z-Patienten (ZZ) beobachtet und zwei trugen das S-Allel zusammen mit einem anderen Allel, das sich von Z unterscheidet (*S). Schlussfolgerung – Diese Ergebnisse zeigen, dass A1AT-Mangel eine relativ häufige Ätiologie bei Kindern ist, die eine chronische Lebererkrankung ohne definierte Ätiologie und/oder eine niedrige A1AT-Dosis im Serum aufweisen (41,6 %). Die Bedeutung einer sicheren Diagnose des Mangels ist nicht nur für die klinische Nachsorge des Patienten, sondern auch für die genetische Beratung gerechtfertigt.

DESKRITOREN ¾ Alpha-1-Antitrypsin-Mangel. Molekulare Diagnose. Leberbiopsie.

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Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studie durchgeführt von den Abteilungen für Pädiatrie, medizinische Genetik, anatomische Pathologie und klinische Pathologie der Fakultät für medizinische Wissenschaften (FCM), Staatliche Universität von Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasilien.

1 Postgraduierter Student. Abteilung für Pädiatrie, FCM/UNICAMP.

2 Assistenzprofessor. Abteilung für klinische Pathologie, FCM/UNICAMP.

3 Assistenzprofessor. Abteilung für anatomische Pathologie, FCM/UNICAMP.

4 PhD in Genetik (Institut für Biologie), UNICAMP.

5 Assistenzprofessor. Abteilung für medizinische Genetik, FCM/UNICAMP.

6 Assistenzprofessor. Abteilung für Pädiatrie, FCM/UNICAMP.