Antigenotoxische Wirkung von Extrakten aus Trametes spp. gegen DNA-Schäden an peripheren weißen Blutkörperchen des Menschen

Abstract

Trametes-Arten werden seit Jahrtausenden in der traditionellen und konventionellen Medizin zur Behandlung verschiedener Arten von Krankheiten eingesetzt. Ziel war es, mögliche antigenotoxische Wirkungen von Myzel- und Basidiokarp-Extrakten ausgewählter Trametes-Arten zu untersuchen und die Abhängigkeit von ihrem antioxidativen Potenzial zu bewerten. Trametes versicolor, T. hirsuta und T. gibbosa waren die untersuchten Arten. Das antigenotoxische Potenzial der Extrakte wurde an menschlichen peripheren weißen Blutkörperchen mit Basidiokarp- und Myzel-Extrakten der Arten untersucht. Der alkalische Komet-Test wurde zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen und alkalilabilen Stellen sowie zum Ausmaß der DNA-Migration verwendet. Der DPPH-Test diente zur Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften der Extrakte. Die Fruchtkörperextrakte von T. versicolor und T. gibbosa sowie die Extrakte von T. hirsuta waren mit Ausnahme von 20,0 mg/mL nicht genotoxisch. Der Extrakt von T. versicolor hatte bei 5,0 mg/mL die größte antigenotoxische Wirkung sowohl bei der Vor- als auch bei der Nachbehandlung von Leukozyten. Die Myzelextrakte der drei Arten hatten keine genotoxische Aktivität und eine signifikante antigenotoxische Wirkung gegen H2O2-induzierte DNA-Schäden, sowohl bei der Vor- als auch bei der Nachbehandlung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Extrakte dieser drei Arten als starke antigenotoxische Mittel betrachtet werden könnten, die in der Lage sind, eine genoprotektive Reaktion der Zellen zu stimulieren.

1. Einleitung

Pilze werden seit langem als Nahrungsmittel, aber auch in der traditionellen Medizin sowohl der westlichen als auch der östlichen Welt verwendet. Obwohl zahlreiche Pilze als gesunde Nahrungsmittel anerkannt sind, wird ihr großes pharmakologisches Potenzial noch immer nicht ausreichend genutzt. Weltweit sind fast 60 Trametes-Arten bekannt, aber nur wenige von ihnen sind auf ihre medizinischen Eigenschaften hin untersucht worden. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd ist die bekannteste medizinische Art der Gattung. Diese Art, deren volkstümliche Namen Truthahnschwanz in westlichen Kulturen, Yun-Zhi (wolkenartiger Pilz) in China oder Kawaratake (Pilz am Flussufer) in Japan lauten, wird seit Tausenden von Jahren in der traditionellen Medizin verwendet, insbesondere in Asien. Laut dem Compendium of Chinese Materia Medica, das während der Ming-Dynastie verfasst wurde, wurden mehr als 120 Sorten von T. versicolor aufgezeichnet. In der traditionellen chinesischen Medizin wird dieser Pilz als nützlich für die Beseitigung von Giftstoffen, die Stärkung, die Erhöhung der Energie, die Verbesserung der Leber- und Milzfunktion und die Stärkung der Immunantwort angesehen, insbesondere wenn er getrocknet, gemahlen und zu Tee zubereitet wird. All diese Eigenschaften wurden in der Volksmedizin als sehr nützlich für die chronische Anwendung von Zubereitungen aus Trametes spp. angesehen. In der Schulmedizin wird die Art vor allem zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt, aber auch bei chronischer Hepatitis, rheumatischer Arthritis und Infektionen der Atemwege, der Harnwege und des Verdauungstraktes, was durch zahlreiche Studien bestätigt wurde. Darüber hinaus wurden starke antivirale Wirkungen einiger aus T. versicolor isolierter Polysaccharopeptide und eine signifikante antioxidative Aktivität von Extrakten aus Fruchtkörpern von Trametes spp. nachgewiesen. Diese Wirkungen beruhen hauptsächlich auf der Produktion des Polysaccharids Krestin (PSK) und verschiedener Polysaccharid-Peptid-Komplexe, Verbindungen, die Krebsmetastasen reduzieren und die Produktion von Interleukin-1 in menschlichen Zellen stimulieren.

Das reichliche Vorhandensein von freien Radikalen in der Umwelt wird mit dem Auftreten von oxidativem Stress in Verbindung gebracht, der eine Grundlage des Alterns und der Entstehung und des Fortschreitens verschiedener Krankheiten und Störungen ist, an denen ein großer Teil der Weltbevölkerung leidet und stirbt. Die DNA ist empfindlicher gegenüber oxidativen Schäden als andere Makromoleküle. DNA-Schäden, wie z. B. Strangbrüche, können durch verschiedene Agenzien ausgelöst werden, von denen H2O2 eine genotoxische Wirkung hat. Es ist bekannt, dass diese Schäden die Immunreaktion nicht nur bei Entzündungskrankheiten, sondern auch bei Krebserkrankungen beeinträchtigen können. Der Comet-Test ist ein gut etablierter und wirksamer Test mit hoher Empfindlichkeit, der zur Untersuchung von DNA-Schäden verwendet wird und zur Bewertung des genotoxischen und schützenden Potenzials verschiedener Naturprodukte eingesetzt werden kann.

Eine genoprotektive Aktivität von Pilzextrakten, die auf der Verringerung oxidativer DNA-Schäden beruht, kann auch eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung und Behandlung mehrerer der genannten Krankheiten und Störungen spielen, wurde aber bisher nur in sehr wenigen Studien als mögliches Aktionsinstrument in verschiedenen Therapien berücksichtigt. Ziel der Studie war es daher, die antigenotoxische Wirkung von Myzel- und Basidiokarpextrakten ausgewählter Trametes-Arten auf periphere weiße Blutkörperchen des Menschen zu untersuchen und die Abhängigkeit von ihrem antioxidativen Potential zu bewerten.

2. Materialien und Methoden

2.1. Organismen und Kultivierungsbedingungen

Kulturen von Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 und T. gibbosa BEOFB 310 wurden aus in Serbien gesammelten Fruchtkörpern isoliert und auf Malzagarmedium in der Kultursammlung des Instituts für Botanik, Fakultät für Biologie, Universität Belgrad (BEOFB) aufbewahrt.

Das Inokulum wurde durch Inokulation von 100,0 ml synthetischem Medium (Glucose, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2.0 g L-1; K2HPO4, 1.0 g L-1; , 0.4 g L-1; , 0.5 g L-1; Hefeextrakt, 2.0 g L-1; pH 6.5) mit 25 Myzelscheiben (Ø 0.5 cm, aus einer 7 Tage alten Kultur auf Malzagar) in 250-mL-Kolben und Bebrütung auf einem Rotationsschüttler bei 100 rpm, bei Raumtemperatur (°C) für 7 d. Die entstandene Biomasse wurde gewaschen und mit 100,0 mL sterilem destilliertem Wasser (dH2O) in einem Labormixer homogenisiert. Die homogenisierte Biomasse (30,0 mL) wurde zur Beimpfung von 500,0 mL modifiziertem synthetischem Medium (mit 65,0 g L-1 Glukose) verwendet. Die Submerskultivierung erfolgte in 1000-mL-Flaschen bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler für 21 Tage. Die erhaltene Biomasse wurde filtriert, dreimal mit dH2O auf einem Magnetrührer gewaschen und bei 50°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

2.2. Herstellung der Pilzextrakte

Getrocknete Fruchtkörper und Myzel (3,0 g) wurden durch Rühren mit 90,0 mL 96%igem Ethanol bei 30°C für 72 h extrahiert. Die resultierenden Extrakte wurden zentrifugiert (20°C, 3000 U/min, 15 min) und der Überstand wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 4 filtriert, unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer (BÜCHI R-114, Schweiz) bei 40°C bis zur Trockene konzentriert und in 96%igem Ethanol für die antioxidative Untersuchung oder in Wasser für die antigenotoxische Untersuchung bis zu einer Anfangskonzentration von 20,0 mg mL-1 wieder aufgelöst. Die Extraktionsausbeute wurde als Prozentsatz auf Basis des Trockengewichts ausgedrückt.

2.3. Genoprotektive Aktivität

2.3.1. Probanden

Heparinisierte Vollblutproben wurden durch Venenpunktion von drei gesunden Spendern unter 25 Jahren gewonnen. Die Studienteilnehmer waren Nichtraucher und Nichtalkoholiker, erhielten keine Therapie oder Medikamente und nahmen keine Nahrungsergänzungsmittel ein.

2.3.2. Studiendesign

Die Gentoxizität aller Extrakte und Konzentrationen (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 und 0,312 mg mL-1) wurde durch Behandlung von menschlichen peripheren weißen Blutzellen bei 37°C für 30 Minuten untersucht, um die DNA-Schäden zu bewerten. Normalerweise werden weiße Blutkörperchen verwendet, da sie auf relativ nichtinvasive Weise gewonnen werden, keine Gewebeaufspaltung erfordern und sich im Comet-Assay gut verhalten. Die Behandlung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37°C für 30 Minuten wurde als Positivkontrolle und die Behandlung mit 25,0 μM H2O2 auf Eis für 15 Minuten als Negativkontrolle verwendet.

Zwei unabhängige Protokolle wurden zur Bewertung des antigenotoxischen Potenzials der Extrakte verwendet, wobei eine Vorbehandlung und eine Nachbehandlung mit den Extrakten erfolgte. Bei der Vorbehandlung wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 37°C mit den Extrakten inkubiert, dann mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang mit H2O2 behandelt. Bei der Nachbehandlung wurden die Zellen 15 Minuten lang auf Eis mit H2O2 behandelt, mit PBS gespült und anschließend 30 Minuten lang bei 37 °C mit den sieben Extraktkonzentrationen behandelt. Nach jeder Behandlung wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Die Inkubation mit PBS bei 37°C für 30 min war die Negativkontrolle und die Behandlung mit 25,0 μM H2O2 auf Eis für 15 min stellte die Positivkontrolle dar.

Drei Wiederholungen wurden für jedes Experiment durchgeführt und 100 Zellkerne wurden für jedes analysiert.

2.3.3. Der Einzelzell-Gelelektrophorese-Assay

Der Comet-Assay wurde wie von Singh et al. beschrieben durchgeführt. Der alkalische Comet-Test ist in der Lage, DNA-Strangbrüche und alkalilabile Stellen nachzuweisen, und das Ausmaß der DNA-Migration zeigt den Grad der DNA-Schädigung in den Zellen an.

Ganzblutproben (6,0 μL) wurden in 0,67 % niedrigschmelzender Agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suspendiert und auf aufgetaute Glas-Objektträger pipettiert, die mit einer Schicht aus 1 % normalschmelzender Agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) beschichtet waren, mit einem Deckglas ausgebreitet und 5 Minuten lang auf Eis gehalten, um zu erstarren. Nach vorsichtigem Entfernen der Deckgläser wurden die Zellsuspensionen auf den Objektträgern wie oben beschrieben mit den Extrakten und H2O2 behandelt. Nach den Behandlungen wurden alle Objektträger mit der dritten Schicht 0,5 %iger LMP-Agarose bedeckt, die wiederum 5 Minuten lang auf Eis erstarrte. Nach dem Entfernen der Deckgläser wurden die Objektträger über Nacht bei 4 °C in kalte Lyselösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton X100 und 10 % Dimethylsulfoxid, pH 10,0 mit NaOH eingestellt) gelegt und anschließend einer Elektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid unterzogen. Die Kometen wurden mit einem Olympus ×50 Mikroskop (Olympus Optical Co., GmbH Hamburg, Deutschland) beobachtet und analysiert, das mit einem Gerät zur Aufzeichnung der Fluoreszenz bei 100facher Vergrößerung ausgestattet war. Die Bewertung der DNA-Schäden erfolgte wie von Anderson et al. beschrieben. Die Zellen wurden von Auge in fünf Kategorien eingeteilt, die den folgenden Mengen an DNA im Schwanz entsprechen: (A) kein Schaden, <5%; (B) geringer Schaden, 5-20%; (C) mittlerer Schaden, 20-40%; (D) hoher Schaden, 40-95%; (E) Gesamtschaden, >95% (Abbildung 1). Die Analyse wurde an 100 zufällig ausgewählten Zellen pro Versuchsperson durchgeführt (50 Zellen von jedem der 2 Wiederholungsobjektträger). Um eine semiquantitative Analyse der Daten zu erhalten, wurde die DNA-Schädigung als DNA-Migration über 5% (B + C + D + E Comet-Klassen) charakterisiert.

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Abbildung 1

Kategorisierung der DNA-Schäden entsprechend der Menge der DNA im Schwanz.

2.4. Antioxidative Aktivität

2.4.1. DPPH- Assay

Die antioxidative Aktivität wurde durch Messung der Bleiche der violett gefärbten Methanollösung des stabilen 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Radikals () bestimmt. Die Fängereffekte wurden spektrophotometrisch (CECIL CE 2501) bei 517 nm gemessen und mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet: wobei die Absorption der Negativkontrolle (Reaktionsgemisch ohne Extrakt) und die Absorption des Reaktionsgemischs ist.

Die Extraktkonzentration (mg Extrakt/mL), die eine 50%ige Reduktion (EC50) bewirkt, wurde durch Interpolation aus einer linearen Regressionsanalyse ermittelt. Alle Messungen wurden für die statistische Analyse in dreifacher Ausführung durchgeführt. Das handelsübliche Antioxidans Butylhydroxyanisol (BHA) in einem Konzentrationsbereich von 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1 wurde als Positivkontrolle verwendet.

2.4.2. Bestimmung des Gesamtphenolgehalts

Die Gesamtphenolverbindungen in den Myzelextrakten wurden mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz nach der Methode von Singleton und Rossi unter Verwendung von Gallussäure als Standard bestimmt. Die Konzentration wurde als μg Gallussäureäquivalente (GAE) pro mg Trockenextrakt bestimmt, wobei eine Gleichung verwendet wurde, die aus einer Gallussäure-Standardkurve als

2.4.3. Bestimmung des Gesamtflavonoidgehalts

Der Gesamtflavonoidgehalt wurde nach den Methoden von Park et al. unter Verwendung von Quercetin als Standard bestimmt. Die Menge wurde als μg Quercetin-Äquivalente (QE) pro mg Trockenextrakt ausgedrückt, wobei eine Gleichung verwendet wurde, die aus einem Standard-Quercetinhydrat-Diagramm als

2,5 erhalten wurde. Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler der aus drei parallelen Messungen erhaltenen Daten ausgedrückt. Zur Prüfung signifikanter Unterschiede wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit der Software STATISTIKA, Version 5.0 (StatSoft Inc.), durchgeführt. Werte unter 0,01 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Analyse der Daten aus dem Comet-Assay wurde mittels χ2-Test unter Verwendung der Software Statgraph 4.2 durchgeführt. Zur Durchführung des χ2-Tests wurden die Ergebnisse aus den drei Experimenten gepoolt und die Gesamtzahl der Zellen mit DNA-Schäden ausgewertet. Ein Unterschied bei wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Extraktionsausbeute

Die Extraktionsausbeute der Biomasse des Myzels war bei allen drei Arten signifikant höher als die des Fruchtkörpers (). T. gibbosa hatte die höchste Extraktionsausbeute aus getrockneter Myzel-Biomasse (34,6 %) und die niedrigste aus getrockneten Fruchtkörpern (2,2 %). Die höchste Ausbeute an Fruchtkörperextraktion wurde mit 6,67 % bei T. versicolor festgestellt, die Ausbeute an Mycel-Extraktion betrug 8,0 %. Bei T. hirsuta lag die Ausbeute bei 12,0 % (für das Myzel) und 2,85 % (für den Fruchtkörper). Die Unterschiede in der Extraktionseffizienz zwischen den Arten, sowohl für das Myzel als auch für den Fruchtkörper, waren statistisch signifikant ().

Vorangegangene Berichte zeigten die Abhängigkeit der Extraktionsfähigkeit der Biomasse von der Art, dem Stamm und dem Lösungsmittel. So fanden Ren et al. heraus, dass die Extraktionsausbeute des Basidiokarps von T. gibbosa 1,22 % für Petroletherextrakte, 6,44 % für Ethylacetat- und 9,2 % für Methanolextrakte betrug. Methanol war auch ein gutes Lösungsmittel für das Basidiokarp von T. versicolor, dessen Ausbeute zwischen 4,1 % und 9,16 % lag. Aus unseren Ergebnissen lässt sich schließen, dass Alkohole die besten Lösungsmittel sind, aber Ethanol ist schwächer als Methanol.

3.2. Genoprotektive Aktivität

Da alle Blutspender bei guter Gesundheit und ähnlichem Alter waren und keine Medikamente einnahmen, zeigte die statistische Analyse keine deutlichen Unterschiede in ihren Reaktionen auf die Extrakte. Daher wurden die Ergebnisse aus den drei Experimenten zusammengeführt. Die Behandlung von peripheren Blutleukozyten mit H2O2 führte zu einer schnellen und starken Induktion von Einzelstrangbrüchen in der Kern-DNA, was im Comet-Assay als DNA-Migration sichtbar war.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass T. versicolor-Fruchtkörper-Extrakte von 0,312 bis 20.0 mg mL-1 verursachte keinen signifikanten Anstieg der Gesamtzahl der DNA-geschädigten Zellen im Vergleich zur Positivkontrolle, was eindeutig zeigt, dass der getestete Extrakt kein genotoxisches Mittel war (Abbildung 2(a) (A)). Die Verteilung (Wert) der gesamten DNA-Schäden war ebenfalls die gleiche wie bei der Positivkontrolle. Andererseits zeigten diese Extrakte sowohl bei der Vor- als auch bei der Nachbehandlung von Leukozyten eine schützende Wirkung gegen H2O2 (Abbildung 2(a) (B, C)). Der Extrakt mit 5,0 mg mL-1 hatte die größte Wirkung und mit 20,0 mg mL-1 die geringste Wirkung in beiden Behandlungen. Der Wert der Gesamt-DNA-Schäden nahm im Vergleich zur Positivkontrolle in allen Konzentrationen statistisch ab ().

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T. hirsuta Fruchtkörperextrakt zeigte bei allen Konzentrationen außer 20,0 mg mL-1 keine genotoxische Aktivität, da das Niveau der gesamten DNA-Schäden statistisch nicht höher war als bei der Positivkontrolle (Abbildung 2(b) (A)). Bei einer Konzentration von 20,0 mg mL-1 waren jedoch die genotoxische Wirkung und die Gesamt-DNA-Schäden in den Zellen im Vergleich zur Positivkontrolle statistisch unterschiedlich. Bei der Vor- und Nachbehandlung von Leukozyten zeigte der Extrakt in allen Konzentrationen, mit Ausnahme der höchsten, eine schützende Wirkung gegen H2O2-induzierte DNA-Schäden und eine signifikante Verringerung der Gesamt-DNA-Schäden im Vergleich zur Positivkontrolle (Abbildung 2(b) (B, C)). Diese Behandlungen zeigten eine dosisabhängige Korrelation, wobei die größte Schutzwirkung bei einer Extraktkonzentration von 0,312 mg mL-1 auftrat, während die Konzentration von 20 mg mL-1 keinen Schutz gegen die durch H2O2 induzierten Kometen zeigte.

Das Fehlen einer genotoxischen sowie einer signifikanten antigenotoxischen Wirkung, d.h. einer Verringerung der durch H2O2 induzierten DNA-Schäden, sowohl bei der Vor- als auch bei der Nachbehandlung, wurde auch für den Extrakt aus dem Fruchtkörper von T. gibbosa in den sieben Konzentrationen festgestellt (Abbildung 2(c)). Im Gegensatz zu den T. hirsuta-Extrakten wurde jedoch bei den Extrakten aus dem Basidiokarp von T. gibbosa keine dosisabhängige Reaktion beobachtet, d. h. eine allmähliche Verringerung der Extraktkonzentration ging nicht mit einer proportionalen Verringerung der H2O2-induzierten Genotoxizität einher.

Die Myzel-Extrakte von T. versicolor, T. hirsuta und T. gibbosa hatten in allen analysierten Konzentrationen keine genotoxische Aktivität (Abbildungen 3(a) (A), 3(b) (A) und 3(c) (A)). Alle Myzelextrakte und Konzentrationen zeigten eine signifikante antigenotoxische Wirkung gegen die H2O2-induzierten DNA-Schäden, sowohl bei der Vor- als auch bei der Nachbehandlung, und diese Aktivitäten unterschieden sich nicht wesentlich. Bei T. versicolor wurde eine etwas geringere Aktivität bei der niedrigsten Extraktkonzentration festgestellt. Bei T. hirsuta waren Konzentrationen von 5,0, 2,5 und 20,0 mg mL-1 wirksamer, während bei T. gibbosa die größte Schutzwirkung bei einer Konzentration von 2,5 mg mL-1 und die geringste bei 20,0 mg mL-1 beobachtet wurde (Abbildungen 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) und 3(c) (B, C)).

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Abbildung 3

Wirkung von Mycel-Extrakten von (a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, und (c) T. gibbosa: (A) genotoxisch, (B) antigenotoxisch, Vorbehandlung, und (C) antigenotoxisch, Nachbehandlung. Es wurden drei unabhängige Experimente mit drei Wiederholungen pro Experiment durchgeführt und mittels Comet-Assay ausgewertet. Pro Replikat wurden 100 Zellkerne analysiert. Die Daten stellen die Gesamtzahl der Zellen mit DNA-Schäden dar.

Zahlreiche mutagene und krebserregende Verbindungen sind in verschiedenen natürlichen Quellen vorhanden. Andererseits können einige natürliche Verbindungen entweder Prooxidantien sein, die genotoxische und/oder zytotoxische Wirkungen verursachen, oder Antioxidantien, abhängig von der Konzentration und der Dauer der Exposition. Nährstoffreiche und medizinisch wertvolle Pilzarten können unterschiedliche In-vitro- und In-vivo-Wirkungen haben, weil sie entweder unter Verdauungsbedingungen instabil sind oder vom Magen-Darm-Trakt nicht aufgenommen werden können. So entsprechen die in vitro erzielten Wirkungen nicht unbedingt denen, die in vivo festgestellt wurden. Es ist auch wichtig zu betonen, dass die genotoxischen und antigenotoxischen Wirkungen von Pilzextrakten von der Spezies, der Konzentration und dem für ihre Bewertung verwendeten Test abhängen. So zeigten unsere Ergebnisse, dass die drei Trametes-Arten unterschiedlich gut in der Lage sind, H2O2-induzierte DNA-Schäden zu verringern; die geringste Aktivität wurde beispielsweise im Fruchtkörperextrakt von T. hirsuta festgestellt. Eine eindeutige umgekehrte Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen dem Ausmaß der DNA-Schäden und der Extraktkonzentration wurde nur für den Extrakt aus dem Basidiokarp von T. hirsuta festgestellt. Bei T. versicolor und T. gibbosa führte eine Erhöhung der Extraktkonzentration über die optimale Dosis hinaus jedoch nicht zu einer Verbesserung der Comet-Ergebnisse, was die Ergebnisse von Miyaji et al. bestätigt. Diese Autoren zeigten, dass es keine Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen den Konzentrationen von Lentinus edodes-Extrakten und ihrer antigenotoxischen Wirkung gibt. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Kombination von phenolischen, flavonoiden und anderen Inhaltsstoffen in den Extrakten ein größeres Potenzial haben sollte als die einzelnen Bestandteile der Extrakte, was auf die Bedeutung des Zusammenwirkens aller Inhaltsstoffe hinweist. Dieser Befund könnte zu einem anderen Trend der antigenotoxischen Aktivität von Trametes spp. führen. Die Abhängigkeit der genotoxischen Aktivität des Extrakts von der Art des Tests wurde von Morales et al. nachgewiesen, d. h. sie berichteten über die Abwesenheit einer mutagenen Wirkung der Basidiokarp-Extrakte von Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus und Pleurotus ostreatus auf Säugetierzellen unter Verwendung des Ames-Salmonella/Mikrosomen-Tests. Eine schwache Aktivität des P. ostreatus-Extrakts wurde jedoch mit dem CHO/HPRT-Assay erzielt.

Die zugrundeliegenden Mechanismen der antigenotoxischen Wirkung von Pilzextrakten sind noch nicht vollständig bekannt. Die schützende Wirkung der Extrakte scheint auf mehr als einem Wirkmechanismus zu beruhen, was laut Gebhart für Pilze nicht ungewöhnlich ist. Die Mechanismen der Antigenotoxizität konnten durch die Anwendung von Vor- und Nachbehandlungen, d.h. durch verschiedene Kombinationen von Extrakten und H2O2, evaluiert werden. Unsere positiven Ergebnisse bei beiden Behandlungen deuten darauf hin, dass die Extrakte sowohl auf der Präventions- als auch auf der Interventionsebene eine schützende Wirkung haben und möglicherweise als Desmutagene und Bioantimutagene wirken, was auch in früheren Studien nachgewiesen wurde. Die in der vorliegenden Studie festgestellte Wirksamkeit der Vorbehandlung könnte durch die Erhöhung der antioxidativen Kapazität der Zellen erklärt werden, d. h. durch die Stimulierung der Synthese und der Aktivität der antioxidativen Enzyme während der Induktion von oxidativem Stress. Der positive Effekt der Nachbehandlung könnte das Ergebnis einer synergistischen Wirkung der Interventionsmaßnahmen durch den Abbau von freien Radikalen und die Stimulierung antioxidativer Enzyme sowie die Anregung der DNA-Reparatur sein, wie von Chiaramonte et al. vorgeschlagen. Da diese Autoren über eine signifikante Reparatur von DNA-Schäden nach 30-60 Minuten Exposition gegenüber einem Oxidationsmittel berichteten, könnte man zu dem Schluss kommen, dass die DNA-Reparatur beim Schutz gegen H2O2 eine weniger bedeutende Rolle spielte, da die Nachbehandlungsbedingungen bis zu 30 Minuten Inkubation berücksichtigten. Daher beruht die genoprotektive Aktivität der Extrakte von Trametes spp. wahrscheinlich auf antioxidativen Wirkungen. Andererseits ist bekannt, dass eukaryotische Organismen einen Signalweg, die so genannte DNA-Schadensreaktion, entwickelt haben, um sich gegen genomische Beeinträchtigungen zu schützen. Gasser und Raulet wiesen nach, dass die DNA-Schadensreaktion das Immunsystem alarmiert, indem sie die Expression von Zelloberflächenliganden für den aktivierenden Immunrezeptor NKG2D auslöst, der von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und einigen T-Zellen exprimiert wird. Daher könnte die genoprotektive Aktivität von Trametes spp. in Zellen, die genotoxischen Agenzien ausgesetzt sind, die DNA-Schadensreaktion modulieren und als Barriere bei der frühen Tumorigenese fungieren. Weitere Untersuchungen sollten die Analyse der Superoxid-Dismutase- und Katalase-Werte in Lymphozyten umfassen, die mit Trametes spp.-Extrakten behandelt wurden, und zwar sowohl vor als auch nach der Behandlung mit H2O2, um die Annahme zu bestätigen, dass die Steigerung der antioxidativen Kapazität in den Zellen durch diese Extrakte induziert wird.

3.3. Antioxidative Aktivität

Die getesteten Ethanolextrakte waren gute Antioxidantien, aber ihre Aktivität hing von der Art ab. Fruchtkörperextrakte zeigten signifikant höhere Fängereffekte als Myzel-Extrakte (). Die höchste DPPH-Radikalfängeraktivität wurde in den Extrakten von T. versicolor, sowohl im Fruchtkörper als auch im Myzel, festgestellt (63,5% bzw. 59,4%), was durch die EC50-Werte (15,22 mg mL-1 bzw. 16,18 mg mL-1) bestätigt wurde. Ein etwas geringeres Aktivitätsniveau wurde für die Extrakte von T. hirsuta festgestellt (59,0 % für die Basidiocarpen und 46,8 % für das Myzel), deren Konzentrationen von 17,06 mg mL-1 bzw. 21,81 mg mL-1 eine 50%ige Reduktion der Radikale bewirkten. T. gibbosa war die Spezies mit dem geringsten Radikalfängerpotenzial, insbesondere bei den Myzel-Extrakten (39,7%) mit einem EC50-Wert von 26,15 mg mL-1. Das Radikalfängervermögen des Fruchtkörperextrakts war jedoch im Vergleich zu den beiden anderen Arten nicht signifikant niedriger (53,7% und EC50 von 18,13 mg mL-1). Die Radikalfängeraktivität des synthetischen Antioxidans BHA betrug 94,28 %, und eine Konzentration von 0,10 mg mL-1 führte zu einer Reduktion von 50 %.

Die Gesamtphenolgehalte in den Fruchtkörper- und Myzelextrakten der Trametes-Arten waren signifikant unterschiedlich () (Tabelle 1). Im Allgemeinen waren die Phenolgehalte in Fruchtkörperextrakten höher als in Myzelextrakten.

Die Extrakte aus dem Basidiokarp von T. versicolor und dem Myzel von T. versicolor waren am reichsten an Phenolen und Flavonoiden, während die niedrigsten Konzentrationen in Extrakten aus T. gibbosa gemessen wurden. Hinsichtlich der Phenol- und Flavonoidkonzentrationen lagen die Extrakte von T. hirsuta zwischen den Extrakten der anderen beiden Arten (Tabelle 1). Der Korrelationsgrad zwischen der Fängeraktivität der Extrakte und dem Phenol- und Flavonoidgehalt war mit 0,98 bzw. 0,99 für Fruchtkörper und 0,97 bzw. 0,99 für Myzel hoch.

Vorangegangene Studien haben ebenfalls auf das antioxidative Potenzial von Trametes-Arten hingewiesen. So wiesen Kamiyama et al. nach, dass bereits eine Extraktkonzentration von 0,5 mg mL-1 fast 50 % der vom Lösungsmittel abhängigen Radikale abfängt, während Johnsy und Kaviyarasana sogar eine Reduktion von 91,5 % der Radikale durch einen Methanolextrakt aus T. gibbosa basidiocarps in einer Konzentration von 1,0 mg mL-1 feststellten. Die in unserer Studie getesteten Ethanolextrakte wiesen eine etwas geringere Kapazität auf, waren aber höher als die von Sheikh et al. analysierten Ethanolextrakte des Fruchtkörpers von T. hirsuta.

Nach Mau et al. und Palacios et al. spielen phenolische Verbindungen eine Schlüsselrolle bei der antioxidativen Aktivität. Diese Verbindungen sind sehr reichlich vorhanden und wichtige Bestandteile von Pilzfruchtkörpern und Myzelien. Ihre Fähigkeit beruht auf dem Vorhandensein von Hydroxylgruppen, die als Reduktionsmittel, Metallchelatoren, Singulett-Sauerstoff-Löscher und Wasserstoffdonatoren wirken. In einigen Fällen konnte ihre Aktivität jedoch nicht auf den Gesamtphenolgehalt der Extrakte zurückgeführt werden, was durch den Vergleich unserer Ergebnisse mit denen von Johnsy und Kaviyarasana bestätigt wird. So wurden 91,5 % der Radikale durch einen Extrakt aus dem Basidiokarp von T. gibbosa mit 23,8 μg GAE mg-1 Extrakt reduziert, während ein Extrakt aus dem Stamm BEOFB 310 mit einer Phenolkonzentration von 20,07 μg GAE mg-1 Extrakt nur 63,5 % der Radikale abfing. Die Flavonoidkonzentration des serbischen T. gibbosa-Stammes war jedoch deutlich höher als die des von Johnsy und Kaviyarasana getesteten Stammes (7,63 μg QE mg-1 des Extraktes bzw. 0,59 μg QE mg-1 des Extraktes), was durch die unterschiedlichen Polaritäten der Lösungsmittel sowie die unterschiedliche Kapazität des Stammes zur Flavonoidsynthese erklärt werden könnte.

4. Schlussfolgerung

Die Studie war der erste Versuch, die DNA-Schutzaktivität der Extrakte von T. versicolor, T. hirsuta und T. gibbosa zu bewerten und festzustellen, ob diese auf ihrem antioxidativen Potenzial beruht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Extrakte dieser drei Arten als starke antigenotoxische Wirkstoffe betrachtet werden könnten, die in der Lage sind, eine genoprotektive Reaktion der Zellen zu stimulieren, die zu einer verbesserten Immunfunktion, zur Beseitigung von Toxinen und zur Stärkung des Immunsystems beiträgt, was auf die traditionelle Verwendung verweist. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die spezifischen Träger der antigenotoxischen Aktivität und die Art des DNA-Schutzes vor oxidativen Schäden aufzudecken.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Professor Dr. Steve Quarrie, Gastprofessor an der Universität von Newcastle, UK, für die Überarbeitung und Verbesserung des Englischen. Diese Studie wurde mit finanzieller Unterstützung des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung der Republik Serbien durchgeführt, Projekt Nr. 173032 und Projekt Nr. 173034.