Abstract

Trametes soorten worden al duizenden jaren gebruikt in de traditionele en conventionele geneeskunde voor de behandeling van verschillende soorten ziekten. Het doel was om mogelijke antigenotoxische effecten van mycelium- en basidiocarpusextracten van geselecteerde Trametes-soorten te evalueren en de afhankelijkheid van hun antioxidantpotentieel te beoordelen. Trametes versicolor, T. hirsuta, en T. gibbosa waren de bestudeerde soorten. De antigenotoxische potentiëlen van de extracten werden beoordeeld op menselijke perifere witte bloedcellen met basidiocarp- en myceliumextracten van de soorten. De alkalische komeettest werd gebruikt voor de detectie van DNA-strengbreuken en alkali-labiele plaatsen, evenals de mate van DNA-migratie. DPPH-assay werd gebruikt om de antioxidatieve eigenschappen van de extracten te bepalen. Vruchtlichaamextracten van T. versicolor en T. gibbosa en extracten van T. hirsuta waren, behalve bij 20,0 mg/ml, niet genotoxisch. Het extract van T. versicolor had bij 5,0 mg/mL het grootste antigenotoxische effect, zowel bij de voor- als bij de nabehandeling van leukocyten. De myceliumextracten van de drie soorten hadden geen genotoxische activiteit en een significant antigenotoxisch effect tegen H2O2-geïnduceerde DNA-beschadiging, zowel bij de voor- als bij de nabehandeling. De resultaten suggereren dat extracten van deze drie soorten kunnen worden beschouwd als sterke antigenotoxische stoffen die in staat zijn de genoprotectieve respons van cellen te stimuleren.

1.

Paddestoelen worden al lang gebruikt als voedingsmiddel, maar ook in de traditionele geneeskunde van zowel de westerse als de oosterse wereld. Hoewel veel paddestoelen als gezond voedsel worden erkend, wordt hun grote farmacologische potentieel nog steeds onvoldoende benut. Bijna 60 Trametes soorten zijn bekend over de hele wereld, maar slechts een paar daarvan zijn gescreend op hun medicinale eigenschappen. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd is de meest bekende medicinale soort uit het geslacht. Deze soort, waarvan de volksnamen Kalkoenstaart in de westerse culturen, Yun-Zhi (wolkachtige paddenstoel) in China, of Kawaratake (paddenstoel bij de rivieroever) in Japan zijn, wordt al duizenden jaren in de traditionele geneeskunde gebruikt, met name in Azië . Volgens het Compendium van de Chinese Materia Medica, geschreven tijdens de Ming Dynastie, zijn er meer dan 120 stammen van T. versicolor geregistreerd en in de traditionele Chinese geneeskundige praktijk wordt deze paddenstoel beschouwd als nuttig voor het verwijderen van gifstoffen, versterking, energieverhoging, verbetering van de lever- en miltfunctie, en verbetering van de immuunrespons, vooral wanneer hij gedroogd, gemalen en tot thee bereid wordt . Al deze eigenschappen werden in de volksgeneeskunde als zeer nuttig beschouwd voor het chronisch gebruik van Trametes spp. preparaten . In de conventionele geneeskunde wordt de soort voornamelijk gebruikt voor de behandeling van verschillende soorten kanker, maar ook voor chronische hepatitis, reumatoïde artritis, en infecties van de luchtwegen, urinewegen, en spijsverteringskanalen, wat werd bevestigd door tal van studies . Bovendien zijn sterke antivirale effecten van sommige polysaccharopeptiden geïsoleerd uit T. versicolor en significante antioxidant activiteit van Trametes spp. vruchtlichaamextracten gerapporteerd. Deze effecten zijn voornamelijk gebaseerd op de productie van het polysaccharide krestin (PSK) en diverse polysaccharide-peptidecomplexen, verbindingen die kankermetastasen verminderen en de productie van interleukine-1 in menselijke cellen stimuleren.

De overvloedige aanwezigheid van vrije radicalen in het milieu wordt in verband gebracht met het ontstaan van oxidatieve stress die aan de basis ligt van veroudering en het ontstaan en de voortgang van diverse ziekten en aandoeningen waaraan een groot deel van de wereldbevolking lijdt en sterft. DNA is gevoeliger voor oxidatieve schade dan andere macromoleculen. DNA-beschadigingen, zoals strengbreuken, kunnen worden geïnduceerd door verschillende agentia waaronder H2O2 een genotoxisch effect heeft. Het is bekend dat deze beschadigingen de immuunrespons kunnen beïnvloeden, niet alleen bij ontstekingsziekten maar ook bij kankers. De komeettest is een beproefde en effectieve test met een hoge gevoeligheid die wordt gebruikt voor het onderzoeken van DNA-schade en kan worden toegepast om het genotoxische en beschermende potentieel van verschillende natuurlijke producten te beoordelen. Een genoprotectieve activiteit van paddestoel-extracten gebaseerd op de vermindering van oxidatieve schade aan DNA kan ook een belangrijke rol spelen bij de preventie en behandeling van verschillende genoemde ziekten en aandoeningen, maar tot op heden zijn er nog maar weinig studies die dit beschouwen als een mogelijk actiemiddel bij verschillende therapieën. Daarom was het doel van de studie om antigenotoxische effecten van mycelium en basidiocarp extracten van geselecteerde Trametes soorten op menselijke perifere witte bloedcellen te evalueren en om de afhankelijkheid van hun antioxidant potentieel te beoordelen.

2. Materialen en Methoden

2.1. Organismen en kweekomstandigheden

Culturen van Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301, en T. gibbosa BEOFB 310 werden geïsoleerd uit vruchtlichamen verzameld in Servië en bewaard op Malt agar medium in de kweekcollectie van het Instituut voor Plantkunde, Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (BEOFB).

Het inoculum werd bereid door inoculatie van 100,0 mL synthetisch medium (glucose, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; gistextract, 2,0 g L-1; pH 6,5) met 25 myceliumschijfjes (Ø 0.5 cm, van 7 dagen oude cultuur van moutagar) in kolven van 250 ml en incubatie op een roterend schudapparaat bij 100 rpm, bij kamertemperatuur (°C) gedurende 7 d. De resulterende biomassa werd gewassen en gehomogeniseerd met 100,0 ml steriel gedestilleerd water (dH2O) in een laboratoriummixer. Gehomogeniseerde biomassa (30,0 mL) werd gebruikt voor inoculatie van 500,0 mL gemodificeerd synthetisch medium (met glucose aanwezig op 65,0 g L-1). Ondergedompelde kweek werd uitgevoerd in 1000 mL kolven bij kamertemperatuur op een roterend schudapparaat gedurende 21 d. De verkregen biomassa werd gefilterd, 3 keer gewassen met dH2O op een magneetroerder, en gedroogd bij 50°C tot constant gewicht.

2.2.

2.2. Bereiding van de schimmelextracten

Gedroogd vruchtlichaam en mycelium (3,0 g) werden geëxtraheerd door te roeren met 90,0 mL 96% ethanol bij 30°C gedurende 72 h. De resulterende extracten werden gecentrifugeerd (20°C, 3000 rpm, 15 min) en de supernatanten werden gefiltreerd door Whatman nummer 4 filterpapier, geconcentreerd onder verminderde druk in een rotatieverdamper (BÜCHI R-114, Zwitserland) bij 40°C tot droogheid, en opnieuw opgelost in 96% ethanol voor antioxidant assay of water voor antigenotoxische assay tot een initiële concentratie van 20,0 mg mL-1. Het extractierendement werd uitgedrukt als percentage op basis van het drooggewicht.

2.3. Genoprotectieve activiteit
2.3.1. Proefpersonen

Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen door venapunctie van drie gezonde donoren jonger dan 25 jaar. De deelnemers aan de studie waren niet-rokers en niet-alcoholici, die geen therapie of medicatie kregen en geen voedingssupplementen innamen.

2.3.2. Studieopzet

Genotoxiciteit van alle extracten en concentraties (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625, en 0,312 mg ml-1) werd bestudeerd door behandeling van menselijke perifere witte bloedcellen bij 37°C gedurende 30 min met als doel het evalueren van DNA-beschadiging. Normaal gesproken worden witte bloedcellen gebruikt, omdat ze op een relatief niet-invasieve manier worden verkregen, geen weefseldesgregatie vereisen en zich goed gedragen in de comet-test. Behandeling met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C gedurende 30 min werd gebruikt als een positieve controle en behandeling met 25,0 uM H2O2 op ijs gedurende 15 min als een negatieve controle.

Twee onafhankelijke protocollen werden gebruikt om het antigenotoxisch potentieel van extracten te beoordelen, met behulp van voorbehandeling en nabehandeling met de extracten. Bij de voorbehandeling werden de cellen gedurende 30 min bij 37°C met de extracten geïncubeerd, vervolgens met PBS gewassen en gedurende 15 min aan H2O2 blootgesteld. Bij de nabehandeling werden de cellen gedurende 15 min. op ijs met H2O2 behandeld, met PBS gespoeld en vervolgens bij 37°C gedurende 30 min. met de zeven extractconcentraties behandeld. Na elke behandeling werden de cellen gewassen met PBS. Incubatie met PBS bij 37 ° C gedurende 30 min was de negatieve controle en behandeling met 25,0 uM H 2 O 2 op ijs gedurende 15 min vertegenwoordigde de positieve controle.

Drie herhalingen werden uitgevoerd voor elk experiment en 100 kernen werden geanalyseerd voor elk.

2.3.3. De Single Cell Gel Electrophoresis Assay

De comet assay werd uitgevoerd zoals beschreven door Singh et al. De alkalische komeettest is in staat om DNA-strengbreuken en alkali-labiele plaatsen te detecteren, en de mate van DNA-migratie geeft de mate van DNA-beschadiging in cellen aan.

Geheel bloedmonsters (6,0 μL) werden gesuspendeerd in 0,67% laag-smeltpunt (LMP) agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en gepipetteerd op superfrosted glazen microscoopglaasjes voorbedekt met een laag van 1% normaal-smeltende-punt agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), verspreid met behulp van een dekglaasje, en gedurende 5 minuten op ijs om te stollen. Na voorzichtig verwijderen van de dekglaasjes, werden de celsuspensies op dia’s behandeld met de extracten en H 2 O 2, zoals hierboven beschreven. Na de behandelingen werden alle objectglaasjes bedekt met de derde laag LMP-agarose van 0,5% en opnieuw gedurende 5 minuten op ijs bewaard om te stollen. Na verwijdering van de dekglaasjes werden de objectglaasjes in een koude lyseringsoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100, en 10% dimethylsulfoxide, pH 10,0 aangepast met NaOH) bij 4°C overnacht en daarna onderworpen aan elektroforese en kleuring met ethidiumbromide. De kometen werden geobserveerd en geanalyseerd met een Olympus ×50 microscoop (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Duitsland), uitgerust met een apparaat voor het registreren van fluorescentie bij 100x vergroting. Evaluatie van DNA-schade werd uitgevoerd zoals beschreven door Anderson et al. De cellen werden namelijk op het oog ingedeeld in vijf categorieën die overeenkwamen met de volgende hoeveelheden DNA in de staart: (A) geen schade, <5%; (B) laag niveau schade, 5-20%; (C) gemiddeld niveau schade, 20-40%; (D) hoog niveau schade, 40-95%; (E) totale schade, >95% (figuur 1). De analyse werd uitgevoerd op 100 willekeurig geselecteerde cellen per proefpersoon (50 cellen van elk van 2 replicaatglaasjes). Om een semikwantitatieve analyse van de gegevens te verkrijgen, werd DNA-schade gekarakteriseerd als DNA-migratie van meer dan 5% (B + C + D + E komeetklassen).

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)(d)
(d)(e)
(e)

Figuur 1
Categorisering van DNA-beschadigingen naar gelang van de hoeveelheid DNA in de staart.
2.4. Antioxidant Activiteit
2.4.1. DPPH- Assay

Antioxidant activiteit werd bepaald door het meten van het bleken van de paars gekleurde methanoloplossing van stabiele 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl radicaal () . Scavenging effecten werden spectrofotometrisch gemeten (CECIL CE 2501) bij 517 nm en berekend met de vergelijking: waar absorptie is van de negatieve controle (reactiemengsel zonder extract) en absorptie is van reactiemengsel.

Extractconcentratie (mg extract/mL) die 50% reductie geeft (EC50) werd verkregen door interpolatie van lineaire regressieanalyse. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd voor statistische analyse. Als positieve controle werd de in de handel verkrijgbare antioxidant butylhydroxyanisol (BHA) gebruikt, in een concentratiebereik van 20,0 mg ml-1-0,02 mg ml-1.

2.4.2. Bepaling van het totale fenolgehalte

Totale fenolverbindingen in de myceliumextracten werden geschat met Folin-Ciocalteu-reagens volgens de methode van Singleton en Rossi , met galluszuur als standaard. De concentratie werd bepaald als μg galluszuurequivalenten (GAE) per mg droog extract, met behulp van een vergelijking die werd verkregen uit een standaard galluszuurgrafiek als

2.4.3. Bepaling van het totale flavonoïdengehalte

Het totale flavonoïdengehalte werd bepaald volgens de methoden van Park et al. met quercetine als standaard. De hoeveelheid werd uitgedrukt als μg quercetine-equivalenten (QE) per mg droog extract, met gebruikmaking van een vergelijking verkregen uit een standaard quercetinehydraatgrafiek als

2.5. Statistische Analyse

De resultaten werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardfout van gegevens verkregen uit drie parallelle metingen. Een-weg variantieanalyse (ANOVA) werd uitgevoerd met behulp van STATISTIKA software, versie 5.0 (StatSoft Inc.) om significante verschillen te testen. waarden lager dan 0,01 werden als statistisch significant beschouwd. De statistische analyse van de gegevens van de comet assay werd uitgevoerd door middel van de χ2 test met behulp van Statgraph 4.2 software. Om de χ2-toets uit te voeren, werden de resultaten van de drie experimenten samengevoegd en werd het totale aantal cellen met DNA-beschadigingen geëvalueerd. Een verschil bij werd beschouwd als statistisch significant.

3. Resultaten en Discussie

3.1. Extractie-opbrengst

De extractie-opbrengst van myceliumbiomassa was voor alle drie de soorten significant hoger in vergelijking met het vruchtlichaam (). T. gibbosa had de hoogste extractieopbrengst van gedroogde myceliumbiomassa (34,6%) en de laagste opbrengst van gedroogde vruchtlichamen (2,2%). De hoogste extractieopbrengst uit vruchtlichamen (6,67%) werd gevonden bij T. versicolor, terwijl de extractieopbrengst uit mycelium 8,0% bedroeg. De opbrengsten bij T. hirsuta bedroegen 12,0% (voor mycelium) en 2,85% (voor vruchtlichamen). De verschillen in extractie-efficiëntie tussen de soorten, voor zowel mycelium als vruchtlichamen, waren statistisch significant ().

Vorige rapporten toonden de afhankelijkheid aan van de extraheerbaarheid van de biomassa van de soort, de stam en het oplosmiddel. Zo vonden Ren et al. dat de extractieopbrengst van T. gibbosa basidiocarp 1,22% was voor petroleumether extract, 6,44% voor ethylacetaat, en 9,2% voor methanol extracten. Methanol was ook een goed oplosmiddel voor T. versicolor basidiocarp, waarvan de opbrengst varieerde tussen 4,1% en 9,16%. Op basis van onze resultaten kan worden geconcludeerd dat alcoholen de beste oplosmiddelen zijn, maar dat ethanol zwakker is dan methanol.

3.2. Aangezien alle bloeddonors gezond en van vergelijkbare leeftijd waren en geen medicatie gebruikten, toonde de statistische analyse geen duidelijke verschillen in hun reacties op de extracten. Daarom werden de resultaten van de drie experimenten samengevoegd. Behandeling van perifere bloedleukocyten met H2O2 veroorzaakte een snelle en krachtige inductie van enkelstrengsbreuken in het kern-DNA, die in de comet-assay zichtbaar werd als DNA-migratie.

Onze resultaten toonden aan dat T. versicolor vruchtlichaadextracten van 0,312 tot 20..0 mg ml-1 veroorzaakte geen significante toename van het totale aantal cellen met DNA-beschadiging in vergelijking met de positieve controle, waaruit duidelijk blijkt dat het geteste extract geen genotoxische stof was (figuur 2(a) (A)). De verdeling (waarde) van de totale DNA-beschadiging was ook dezelfde als bij de positieve controle. Anderzijds vertoonden deze extracten beschermende effecten tegen H2O2, zowel bij de voor- als bij de nabehandeling van leukocyten (figuur 2(a) (B, C)). Het extract met 5,0 mg ml-1 had het grootste effect en met 20,0 mg ml-1 het laagste effect in beide behandelingen. De waarde van de totale DNA-beschadiging daalde statistisch in vergelijking met de positieve controle in alle concentraties ().

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)

(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)

Figuur 2
Effect van vruchtlichaamextracten van a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, en (c) T. gibbosa: (A) genotoxisch, (B) antigenotoxisch, voorbehandeling, en (C) antigenotoxisch, nabehandeling. Drie onafhankelijke experimenten met drie herhalingen per experiment werden uitgevoerd en geëvalueerd met de komeetproef. Per replicaat werden 100 kernen geanalyseerd. De gegevens staan voor het totale aantal cellen met DNA-beschadiging.

T. hirsuta vruchtlichaamextract vertoonde bij alle concentraties behalve 20,0 mg ml-1 geen genotoxische activiteit, aangezien het niveau van de totale DNA-beschadiging statistisch niet hoger was dan dat bij de positieve controle (figuur 2(b) (A)). Bij een concentratie van 20,0 mg ml-1 waren het genotoxische effect en de totale DNA-beschadiging in de cellen echter statistisch verschillend van die bij de positieve controle. Bij de voor- en nabehandeling van leukocyten vertoonde het extract bij alle concentraties behalve de hoogste een beschermend effect tegen door H2O2 veroorzaakte DNA-beschadiging, waarbij een significante afname van de totale DNA-beschadiging werd aangetoond in vergelijking met de positieve controle (figuur 2(b) (B, C)). Deze behandelingen vertoonden een dosisafhankelijke correlatie, met het grootste beschermende effect bij een extractconcentratie van 0,312 mg ml-1, terwijl de concentratie van 20 mg ml-1 geen bescherming vertoonde tegen door H2O2 geïnduceerde comets.

De afwezigheid van zowel een genotoxisch als een significant antigenotoxisch effect, d.w.z. vermindering van door H2O2 geïnduceerde DNA-beschadiging, zowel bij de voor- als bij de nabehandeling, werd ook geconstateerd voor het vruchtlichaadextract van T. gibbosa bij de zeven concentraties (figuur 2(c)). In tegenstelling tot de extracten van T. hirsuta werd bij de basidiocarp extracten van T. gibbosa echter geen dosisafhankelijke respons waargenomen; een geleidelijke daling van de extractconcentratie kwam namelijk niet overeen met een evenredige vermindering van de door H2O2 geïnduceerde genotoxiciteit.

De myceliumextracten van T. versicolor, T. hirsuta en T. gibbosa hadden bij alle geanalyseerde concentraties geen genotoxische activiteit (figuren 3(a)(A), 3(b)(A), en 3(c)(A)). Alle myceliumextracten en -concentraties vertoonden een significant antigenotoxisch effect tegen de door H2O2 veroorzaakte DNA-beschadiging, zowel bij de voor- als bij de nabehandeling, en deze activiteiten verschilden niet duidelijk van elkaar. Bij T. versicolor werd een iets lagere activiteit waargenomen bij de laagste extractconcentratie. Bij T. hirsuta waren concentraties van 5,0, 2,5 en 20,0 mg ml-1 effectiever, terwijl bij T. gibbosa het grootste beschermende effect werd waargenomen bij een concentratie van 2,5 mg ml-1 en het laagste bij 20,0 mg ml-1 (figuren 3(a) (B, C), 3(b) (B, C), en 3(c) (B, C)).

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)

(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)

Figuur 3
Effect van myceliumextracten van a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, en (c) T. gibbosa: (A) genotoxisch, (B) antigenotoxisch, voorbehandeling, en (C) antigenotoxisch, nabehandeling. Drie onafhankelijke experimenten met drie herhalingen per experiment werden uitgevoerd en geëvalueerd met de komeetproef. Per replicaat werden 100 kernen geanalyseerd. De gegevens vertegenwoordigen het totale aantal cellen met DNA-beschadiging.

Er zijn talrijke mutagene en carcinogene verbindingen aanwezig in verschillende natuurlijke bronnen. Anderzijds kunnen sommige natuurlijke verbindingen ofwel prooxidanten zijn die genotoxische en/of cytotoxische effecten veroorzaken, ofwel antioxidanten, afhankelijk van de concentratie en de duur van de blootstelling. Paddenstoelensoorten met een hoge voedingswaarde en medicinale waarde kunnen verschillende in vitro en in vivo effecten hebben als gevolg van hun instabiliteit onder verteringsomstandigheden of hun onvermogen tot absorptie door het maagdarmkanaal . In vitro verkregen activiteiten komen dus niet noodzakelijk overeen met die welke in vivo worden aangetroffen. Het is ook belangrijk te benadrukken dat genotoxische en antigenotoxische effecten van paddenstoelenextracten afhankelijk zijn van de soort, de concentratie en de test die voor de beoordeling ervan wordt gebruikt. Zo toonden onze resultaten verschillende capaciteiten aan van de drie Trametes-soorten voor het verminderen van H2O2-geïnduceerde DNA-beschadiging; de laagste activiteit werd bijvoorbeeld waargenomen in het vruchtlichaamextract van T. hirsuta. Een duidelijke omgekeerde dosis-respons relatie tussen het niveau van DNA-beschadiging en de extractconcentratie werd alleen waargenomen in het T. hirsuta basidiocarp extract. Bij T. versicolor en T. gibbosa leidde een verhoging van de extractconcentratie boven de optimale dosis echter niet tot een verbetering van de cometresultaten, wat de resultaten van Miyaji et al. bevestigt. Deze auteurs toonden de afwezigheid aan van een dosis-respons relatie tussen Lentinus edodes extractconcentraties en hun antigenotoxische werking. Het is belangrijk te vermelden dat gecombineerde fenol-, flavonoïde- en andere bestanddelen in extracten een groter potentieel zouden moeten hebben dan afzonderlijke bestanddelen van extracten, wat wijst op het belang van coacties van alle bestanddelen. Deze bevinding zou kunnen resulteren in een andere trend van Trametes spp. antigenotoxische activiteit. Morales et al. toonden aan dat de genotoxische activiteit van het extract afhangt van het type test; zij meldden namelijk dat de basidiocarp extracten van Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus en Pleurotus ostreatus geen mutageen effect hadden op zoogdiercellen met behulp van de Ames Salmonella-microsoomtest. Een zwakke activiteit van P. ostreatus extract werd echter verkregen met de CHO/HPRT assay.

De onderliggende mechanismen van de antigenotoxische werking van paddenstoelenextracten zijn nog steeds niet volledig bekend. De beschermende effecten van de extracten lijken gebaseerd te zijn op meer dan één werkingsmechanisme, wat volgens Gebhart niet ongebruikelijk is voor paddenstoelen. De antigenotoxiciteitsmechanismen konden worden geëvalueerd door toepassing van voor- en nabehandelingen, dat wil zeggen, diverse combinaties van extracten en H2O2. Onze positieve resultaten in beide behandelingen wijzen erop dat extracten beschermende effecten hebben op zowel het preventie- als het interventieniveau en kunnen fungeren als desmutagenen en bioantimutagenen, zoals ook aangetoond in eerdere studies . De efficiëntie van de voorbehandeling, vastgesteld in de huidige studie, zou verklaard kunnen worden door het verhogen van de antioxidant capaciteit van de cellen, dat wil zeggen, het stimuleren van de synthese en de activiteit van antioxidant enzymen tijdens de inductie van oxidatieve stress . Het positieve effect van de nabehandeling zou het resultaat kunnen zijn van een synergetische werking van interventieactiviteiten via het wegvangen van vrije radicalen en het stimuleren van antioxidant-enzymen, alsmede het stimuleren van DNA-herstel, zoals gesuggereerd door Chiaramonte e.a. . Aangezien deze auteurs significant herstel van DNA-schade rapporteerden na 30-60 min blootstelling aan een oxidatief agens, zou men kunnen concluderen dat DNA-herstel een minder belangrijke rol speelde bij de bescherming tegen H2O2, aangezien de nabehandeling tot 30 min incubatie in aanmerking werd genomen. Daarom is de genoprotectieve activiteit van de Trametes spp. extracten waarschijnlijk gebaseerd op antioxidantwerking. Anderzijds is het bekend dat eukaryote organismen een signaaltransductieroute hebben ontwikkeld, de DNA-schaderespons genoemd, om zich tegen genoombeschadiging te beschermen. Gasser en Raulet hebben aangetoond dat de DNA-schaderespons het immuunsysteem waarschuwt door expressie te induceren van celoppervlak-liganden voor de activerende immuunreceptor NKG2D, die tot expressie wordt gebracht door natuurlijke killercellen (NK-cellen) en sommige T-cellen. Daarom zou de genoprotectieve activiteit van Trametes spp. in aan genotoxische stoffen blootgestelde cellen de DNA-schaderespons kunnen moduleren en als barrière kunnen fungeren bij vroege tumorigenese. Verder onderzoek zou de analyse van superoxide dismutase en catalase niveaus moeten omvatten in lymfocyten behandeld met Trametes spp. extracten, zowel in pre- als post-behandeling met H2O2, om de veronderstelling te bevestigen dat verbetering van de antioxidant capaciteit in cellen wordt geïnduceerd door deze extracten.

3.3. Antioxidant Activiteit

De geteste ethanolextracten waren goede antioxidanten, maar hun activiteit was afhankelijk van de soort. Vruchtlichaamextracten vertoonden significant hogere zuiveringseffecten dan myceliumextracten (). De hoogste DPPH radical scavenging activiteit werd waargenomen in T. versicolor extracten, zowel vruchtlichaam als mycelium (63.5% en 59.4%, resp.), hetgeen werd bevestigd door EC50 waarden (15.22 mg ml-1 en 16.18 mg ml-1, resp.). De activiteit van de extracten van T. hirsuta was iets lager (59,0% voor basidiocarps en 46,8% voor mycelium); de concentraties van 17,06 mg mL-1 en 21,81 mg mL-1 zorgden respectievelijk voor een reductie van 50% van de radicalen. T. gibbosa was de soort met het laagste wegvangvermogen, vooral van de myceliumextracten (39,7%) met een EC50-waarde van 26,15 mg mL-1. Het radicaal-wegvangend vermogen van het vruchtlichaamextract was echter niet significant lager in vergelijking met de andere twee soorten (53,7% en EC50 van 18,13 mg ml-1). De zuiverende werking van de synthetische antioxidant BHA was 94,28%, en een concentratie van 0,10 mg mL-1 gaf een reductie van 50%.

Totale fenolgehalten in vruchtlichaam- en myceliumextracten van Trametes-soorten waren significant verschillend () (Tabel 1). Over het algemeen waren de fenolgehalten in de extracten van het vruchtlichaam hoger dan in de extracten van het mycelium.

Geteste soorten Extract Totaal fenolgehalte Totaal flavonoïdengehalte
(µg GAE/mg gedroogd extract) (µg QE/mg gedroogd extract)
Trametes gibbosa Basidiocarp 20.07 ± 1.24 7.63 ± 0.08
Mycelium 12.08 ± 0.87 1.76 ± 0.03
Trametes hirsuta Basidiocarp 21.53 ± 2.36 8.28 ± 0.05
Mycelium 14.27 ± 0.92 2.21 ± 0.02
Trametes versicolor Basidiocarp 24.27 ± 0.92 2.21 ± 0.02
Trametes versicolor Basidiocarp 24.80 ± 0,42 10,79 ± 0,09
Mycelium 18,06 ± 0,33 4,16 ± 0.02
Tabel 1
Totaal fenol- en flavonoïdengehalte in ethanolische extracten van geselecteerde Trametes-soorten.

Zowel T. versicolor basidiocarp als T. versicolor mycelium extracten waren het rijkst aan fenolen en flavonoïden, terwijl de laagste concentraties werden gemeten in T. gibbosa extracten. Volgens de fenol- en flavonoïdenconcentraties lagen de extracten van T. hirsuta tussen de extracten van de andere twee soorten (tabel 1). De mate van correlatie tussen de zuiverende activiteit van de extracten en het fenol- en flavonoïdegehalte was hoog, voor vruchtlichamen respectievelijk 0,98 en 0,99, en voor mycelium respectievelijk 0,97 en 0,99.

Eerdere studies hebben ook gewezen op het antioxidantpotentieel van Trametes-soorten. Zo toonden Kamiyama et al. aan dat een extractconcentratie van zelfs 0,5 mg mL-1 bijna 50% van de radicalen wegvaagde, afhankelijk van het oplosmiddel, terwijl Johnsy en Kaviyarasana een reductie van zelfs 91,5% van de radicalen constateerden door een methanolextract van T. gibbosa basidiocarps bij een concentratie van 1,0 mg mL-1. De in onze studie geteste ethanolextracten hadden een iets lagere capaciteit, maar een hogere dan de ethanolextracten van T. hirsuta vruchtlichamen die door Sheikh et al. werden geanalyseerd.

Volgens Mau et al. en Palacios et al. spelen fenolverbindingen een sleutelrol in de antioxidatieve activiteit. Deze verbindingen zijn zeer overvloedig aanwezig en belangrijke bestanddelen van paddenstoelen vruchtlichamen en mycelia. Hun vermogen is gebaseerd op de aanwezigheid van hydroxylgroepen die fungeren als reductiemiddel, metaalchelator, singletzuurstof-doder en waterstofdonor. In sommige gevallen kon hun activiteit echter niet worden toegeschreven aan het totale fenolgehalte in de extracten, hetgeen wordt bevestigd door een vergelijking van onze resultaten met die van Johnsy en Kaviyarasana . Zo werd 91,5% van de radicalen gereduceerd door T. gibbosa basidiocarp extract met 23,8 μg GAE mg-1 extract, terwijl een extract van stam BEOFB 310 met een fenolconcentratie van 20,07 μg GAE mg-1 extract slechts 63,5% van de radicalen wegvaagde. De concentratie flavonoïden in de Servische T. gibbosa-stam was echter aanzienlijk hoger in vergelijking met de door Johnsy en Kaviyarasana geteste stam (respectievelijk 7,63 μg QE mg-1 extract en 0,59 μg QE mg-1 extract), en dit zou kunnen worden verklaard door de verschillende polariteiten van de oplosmiddelen en de verschillende stamcapaciteit voor de synthese van flavonoïden.

4. Conclusie

De studie was de eerste poging om de DNA-beschermende activiteit van T. versicolor, T. hirsuta, en T. gibbosa extracten te beoordelen en te bepalen of dit gebaseerd was op hun antioxidant potentieel. De resultaten suggereren dat extracten van deze drie soorten kunnen worden beschouwd als sterke antigenotoxische stoffen die in staat zijn de genoprotectieve respons van cellen te stimuleren, wat bijdraagt aan een verbeterde immuunfunctie, toxineverwijdering en versterking, wat verwijst naar het traditionele gebruik. Verdere onderzoeken zijn echter nodig om specifieke dragers van de antigenotoxische activiteit en de wijze van DNA-bescherming tegen oxidatieve schade te onthullen.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

De auteurs danken Professor Dr. Steve Quarrie, Visiting Professor aan de Universiteit van Newcastle, UK, voor het reviseren en verbeteren van het Engels. Deze studie werd uitgevoerd met financiële steun van het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologische Ontwikkeling van de Republiek Servië, Project nr. 173032 en Project nr. 173034.