A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistochemie en Western blotting werken beide door gebruik te maken van het principe hoe antilichamen zich specifiek binden aan de antigenen die in biologisch weefsel aanwezig zijn.

Imunohistochemie is de meest voorkomende immunokleuringstechniek. Zij visualiseert de aanwezigheid van gerichte antigenen in een weefselmonster door antilichamen te gebruiken die zich aan de antigenen hechten, een katalytisch effect hebben en de molecule in identificeerbare verbindingen splitsen. Het zichtbaar maken van deze interactie kan worden bereikt door gebruik te maken van een enzym (dat een chromogeen signaal produceert) of een fluorofoor (die een fluorescerend signaal produceert).

Western blot werkt volgens hetzelfde principe. Deze techniek werd voor het eerst toegepast in de jaren zeventig van de vorige eeuw, toen wetenschappers er met succes verschillende eiwitten die in biologisch weefsel voorkomen mee konden classificeren. Sindsdien is de technologie aanzienlijk verbeterd, wat heeft geleid tot de totstandkoming van de moderne fluorescerende, colorimetrische en chemiluminescente Western blot-techniek.

Alle versies van de Western blot-methode berusten op de werking van het antigeen-antilichaamcomplex om specifieke eiwitten in een monster te identificeren, die worden aangegeven door hetzij de enzym-substraatreacties van colorimetrische, chemiluminescente of fluorescerende moleculen. Het door deze bronnen geproduceerde licht kan worden gebruikt om de aanwezigheid en concentratie van de eiwitten in een monster af te leiden.

Vergelijking van de technieken

Hoewel de twee methoden berusten op het principe van de antilichaam-antigeen interactie, zijn er enkele belangrijke verschillen tussen de twee technieken. Hieronder wordt een en ander stap voor stap uit de doeken gedaan.

Ten eerste moet voor beide technieken het monster correct worden geprepareerd. De voorbereiding verschilt aanzienlijk tussen de twee technieken. Voor immunohistochemie worden de weefselmonsters in plakjes gesneden of in hun geheel gelaten, afhankelijk van hun grootte.

De grens voor de grootte van de monsters ligt over het algemeen tussen 3 µm en 5 µm. Vervolgens worden de monsters ingebed in een medium, gewoonlijk paraffinewas of cryomedia. Daarna worden de plakjes op objectglaasjes gelegd en gedehydrateerd met behulp van steeds sterkere alcoholwasbeurten, waarbij uiteindelijk een detergens wordt toegevoegd om het monster te klaren, zodat het klaar is om onder een microscoop te worden bekeken.

Bij Western blot daarentegen worden de monsters eerst gescheiden door elektroforese en vervolgens geïmmobiliseerd in een blotting membraan.

De methode om de monsters te kleuren verschilt ook enigszins tussen de twee technieken. Immunohistochemie voegt hetzij polyklonale hetzij monoklonale antilichamen toe. Deze antilichamen worden geclassificeerd als primaire of secundaire reagentia, waarbij de eerste zijn gekweekt tegen een doelantigeen en gewoonlijk niet-geconjugeerd zijn; de laatste zijn geconjugeerd aan een linkermolecuul dat vervolgens reportermoleculen rekruteert.

De geconjugeerde versie wordt gebruikt in een directe kleuring methode, waar het antilichaam direct reageert met het antigeen in het monster, de ongeconjugeerde versie wordt gebruikt in een indirecte kleuring methode, waar de niet-geëtiketteerde antilichaam bindt aan het doel antigeen in het weefsel, waardoor een secundair antilichaam om te reageren met het primaire antilichaam.

In vergelijking daarmee wordt bij de Western blot-methode een fluorescerende kleurstof aan het monster toegevoegd, gevolgd door blootstelling aan een lichtbron met de juiste golflengte om de moleculen van de fluoroforen te exciteren.

Na enige tijd geven de geëxciteerde fluoroforen uiteindelijk de energie af die zij van de lichtbron hebben gekregen om naar hun grondtoestand terug te keren. Dit vrijkomen van energie doet de fluoroforen fluoresceren, waarbij een lichtbron wordt uitgezonden die door een digitale beeldvormer kan worden vastgelegd.

Vergelijking van de voor- en nadelen

Het belangrijkste voordeel van immunohistochemie is dat de methode onderzoekers in staat stelt de exacte locatie van een doeleiwit binnen een weefselmonster te detecteren. Dit grote voordeel heeft ertoe geleid dat immunohistochemie binnen de neurowetenschappen een gevestigde waarde is geworden als robuuste methode om de expressie van eiwitten op bepaalde plaatsen in de hersenen te onderzoeken.

Aan de andere kant heeft de methode een groot nadeel in vergelijking met de Western blot methode. Dit is het feit dat de vlekken niet worden gecontroleerd aan de hand van een ladder van moleculaire gewichten, zoals bij Western blot, wat betekent dat er geen manier is om te bewijzen dat de kleuring die bij immunohistochemie wordt getoond, onomstotelijk verband houdt met een specifiek eiwit.

De indirecte methode van immunohistochemie staat bekend als zeer gevoelig, maar de directe methode staat bekend als het tegenovergestelde, en is in het algemeen niet in staat om kleine concentraties van doelantigenen te detecteren.

De Western blot methode heeft het voordeel dat het zich heeft gevestigd als een betrouwbare techniek voor het verzamelen van kwantitatieve gegevens. Het belangrijkste voordeel van de Western blot-methode is echter dat deze doeltreffend is gebleken bij het genereren van een signaal dat evenredig is met de hoeveelheid eiwit in het monster.

Daarnaast wordt de Western blot-methode vaak gekozen vanwege zijn vermogen om een groot aantal doeleiwitten tegelijk te detecteren, waardoor de testtijd aanzienlijk wordt verkort en er minder middelen nodig zijn.

Een verschil in toepassingen

Er is een grote overlapping in de toepassingen van de twee technieken, omdat ze zo op elkaar lijken. In het algemeen echter wordt immunohistochemie het meest gebruikt als diagnostisch hulpmiddel voor talrijke vormen van kanker.

De methode wordt gebruikt om abnormale cellen te identificeren die kenmerkend zijn voor bepaalde tumoren. De methode wordt ook veel gebruikt voor het identificeren en lokaliseren van eiwitten en biomarkers die zowel in normaal als in ziek weefsel worden aangetroffen. Tenslotte wordt het ook vaak gebruikt om talrijke besmettelijke organismen in weefsels op te sporen.

In vergelijking daarmee wordt de Western blot meestal gebruikt voor de opsporing van auto-immuunziekten, allergieën en besmettelijke ziekten. Het wordt veel gebruikt op het gebied van moleculaire biologie, biochemie en celbiologie, waarbij de meest opvallende toepassingen worden gebruikt als diagnostisch hulpmiddel voor HIV en BSE.

Verder lezen

• Alle Immunohistochemie-inhoud
• Immunohistochemie (IHC) Beeldvormingstechnieken
• Enzymatische Immunohistochemie (IHC)
• Multikleur Immunohistochemie (IHC)
• Hoe werkt Immunochemie?

Geschreven door

Sarah Moore

Na haar studie Psychologie en vervolgens Neurowetenschappen vond Sarah al snel haar plezier in het doen van onderzoek en het schrijven van research papers; dit veranderde in een passie om ideeën met mensen te verbinden door middel van schrijven.

Last bijgewerkt 3 feb 2020

Citations

Gebruik een van de volgende formats om dit artikel in uw essay, paper of verslag te citeren:

• APA

  Moore, Sarah. (2020, februari 03). Een vergelijking van Immunohistochemie en Western Blot. Nieuws-Medisch. Retrieved on March 26, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx.

• MLA

  Moore, Sarah. “Een vergelijking van Immunohistochemie en Western Blot”. Nieuws-Medisch. 26 maart 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx>.

• Chicago

  Moore, Sarah. “Een vergelijking van Immunohistochemie en Western Blot”. Nieuws-Medisch. https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx. (accessed March 26, 2021).

• Harvard

  Moore, Sarah. 2020. A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot. Nieuws-Medisch, bekeken 26 maart 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx.