Teste radiometrice de legare a liganzilor | Application Support Knowledgebase | Produse și servicii de laborator | PerkinElmer

top

Overview

Liganzii radioactivi sunt utilizați în mod obișnuit pentru a măsura legarea liganzilor la receptori. În acest test, veți măsura legarea unui ligand radiomarcat la celulele sau membranele celulare care conțin un receptor de interes. Pentru acest test se pot utiliza atât celule întregi, cât și membrane celulare. Radioliganzii pot fi utilizați pentru a realiza curbe de saturație, experimente de competiție și cinetice.

Ligand-receptor binding

Când selectați un radioligand, există câțiva factori de care trebuie să țineți cont:

• Activitate specifică ridicată: Radioliganzii cu o activitate specifică ridicată sunt bine adaptați pentru testele de legare a ligandului. Activitatea specifică indică câtă radioactivitate există per moleculă de ligand și este dată de obicei în unități de Curies pe milimole de ligand. Mai mulți dintre liganzii noștri marcați cu 125I sunt oferiți la o activitate specifică maximă (2200 Ci/mmol dacă este disponibil un situs de marcare cu 125I, 4400 Ci/mmol dacă sunt disponibile două situsuri de marcare cu 125I etc.). Acest lucru indică faptul că practic fiecare moleculă de ligand furnizată în flaconul stoc este radiomarcată. Pentru liganzii tritipați (liganzi 3H), ar trebui să alegeți în mod ideal un ligand care are o activitate specifică de peste 20 Ci/mmol. Activitatea specifică teoretică maximă pe tritiu este de 29 Ci/mmol (Curies per milimole de tritiu). Activitățile specifice peste această valoare indică faptul că, în medie, fiecare moleculă de ligand are cel puțin un tritiu.
• Legătură nespecifică scăzută: Liganzii hidrofobi vor prezenta, în general, o legare nespecifică mai mare. Acest lucru poate fi uneori compensat prin acoperirea filtrelor cu BSA pentru a reduce legarea nespecifică. Includerea de BSA, săruri sau detergenți în tamponul de spălare sau de legare poate contribui, de asemenea, la reducerea legăturii nespecifice. Dacă stocul radiochimic este ambalat într-un flacon silanizat (consultați fișa tehnică), acest lucru poate indica faptul că ligandul este oarecum hidrofob
• Puritate ridicată: În mod ideal, ligandul ar trebui să aibă o puritate radiochimică de peste 90%. Puritatea radiochimică scade în timp, iar rata reală a acestei degradări se accelerează în timp. Puritatea radiochimică și ratele de degradare pentru diversele noastre substanțe radiochimice pot fi găsite în fișele tehnice specifice loturilor.
• Selectivitate ridicată: Cu cât ligandul este mai selectiv pentru receptorul dumneavoastră, cu atât mai bune vor fi datele dumneavoastră. Selectivitatea ridicată indică faptul că ligandul va fi recunoscut în cea mai mare parte de un singur receptor de interes, în detrimentul altor receptori care pot fi prezenți într-o membrană celulară. De asemenea, utilizarea membranelor care supraexprimă receptorul de interes poate ajuta la reducerea oricărei contribuții potențiale din partea receptorilor exprimați în mod endogen în membrană.
• Stabilitate: Dacă va trebui să utilizați radioligandul dumneavoastră pe o perioadă de timp îndelungată, stabilitatea poate fi un factor pentru dumneavoastră. Liganzii marcați cu 125I ar trebui, în general, să fie utilizați în termen de una până la două luni de la data fabricării. Liganzii tritipați ar trebui să fie utilizați, de obicei, în termen de 3-6 luni de la data fabricației; cu toate acestea, există excepții. Ratele de degradare și datele de fabricație pot fi găsite pe fișele noastre de date tehnice specifice loturilor. De asemenea, puteți contacta serviciul de asistență tehnică pentru a discuta timpul de utilizare recomandat pentru fiecare produs radiochimic PerkinElmer – informațiile noastre de contact se află în colțul din dreapta sus al acestei pagini.
• Energie: 3H eliberează energie beta, care poate fi măsurată pe un contor de scintilații după adăugarea de scintilant (sub forma unui cocktail de scintilații, a unui scintilant solid Meltilex®, a unei bile SPA etc.). Energia beta interacționează cu scintilantul pentru a produce fotoni, care sunt măsurați de detector. 125I eliberează atât energie de tip beta, cât și energie gamma. Dacă aveți acces doar la un contor gamma, ar trebui să folosiți un radioligand marcat cu 125I. Un factor suplimentar este formatul de testare. 125I eliberează mai multă energie de tip beta decât 3H. Pentru testele SPA, se pot folosi în mod eficient fie liganzi marcați cu 3H, fie cu 125I.

Sesizările de legare a ligandului radioactiv pot fi efectuate în mai multe formate diferite. În mod obișnuit, noi efectuăm acest test în format de filtrare, dar testul poate fi efectuat și în format SPA. Formatul SPA este un format omogen, ceea ce înseamnă că nu sunt necesare etape de spălare. În testul de filtrare, veți spăla ligandul nelegat cu ajutorul unui colector de vid sau al unui colector de celule.

Top

Forme de testare

Filtration Ligand Binding Assays

Vezi mai multe informații despre materialele de care ai nevoie, optimizările pe care este posibil să trebuiască să le faci și referințe pentru testele de legare a liganzilor radioactivi pe plăci de filtrare. În formatul de filtrare, testul de legare se efectuează mai întâi într-o placă de testare, apoi se filtrează printr-o placă de filtrare sau o placă UniFilter® cu ajutorul unui colector de celule (colector de vid). Filtrele sunt spălate pentru a elimina orice radioligand nelegat. Placa Filtermat sau UniFilter se usucă apoi și se adaugă cocktailul de scintilații (sau Meltilex®) înainte de citirea într-un detector adecvat.

SPA ligand binding assays

Vezi mai multe informații despre materialele de care ai nevoie, despre optimizările pe care este posibil să trebuiască să le efectuezi și despre referințele pentru SPA radioligand binding assays. În formatul SPA, membranele celulare sunt capturate pe margele SPA. Atunci când radioligandul se leagă de receptor/membrană, acest lucru pune substanța radiochimică în proximitatea bilei SPA. Energia beta de la radioligand poate interacționa cu scintilantul din perlă, producând un semnal care poate fi măsurat. Radioligandul care nu este legat de membrana celulară nu va fi suficient de aproape de bila SPA pentru a interacționa puternic cu scintilantul.

Overview of ligand binding

Definitions

• Affinity (potency): strânsoarea cu care ligandul se leagă de receptor. Aceasta este de obicei exprimată ca o constantă de echilibru, Kd. Cu cât valoarea Kd este mai mică, cu atât afinitatea este mai mare.
• Specificitate: descrie cât de selectiv este un ligand pentru un receptor față de alți receptori similari
• Kd: Concentrația la care 50% din receptori sunt ocupați de radioligand

Clasificări farmacologice pentru liganzi

Ligani

• Agonist complet: un ligand care se leagă și activează un receptor și declanșează un răspuns maxim
• Agonist parțial: un ligand care se leagă de un receptor și produce un răspuns submaximal
• Antagonist: un ligand care se leagă de un receptor care nu activează receptorul. Antagoniștii nu declanșează niciun răspuns atunci când sunt aplicați singuri. Ei vor bloca efectele unui ligand agonist concurent.
• Agonist invers: un ligand care se leagă de un receptor și scade răspunsul sub nivelul bazal

Agoniști

I. Experiment de saturație: Măsoară echilibrul de legare prin efectuarea unei titrări de radioligand, menținând constantă cantitatea de receptor.

Puteți utiliza curbele de saturație pentru a determina Bmax (nivelul de expresie al receptorului) și Kd (afinitatea de legare a ligandului).

Experiment de saturație

• Legare totală: Creșterea concentrației de radioligand în absența ligandului rece. Măsoară atât legarea specifică la receptor, cât și legarea nespecifică.
• Legare nespecifică: Creșterea concentrației de radioligand în prezența ligandului rece. Măsoară legarea radioligandului la componentele nereceptorului.
• Legare specifică: Legătura totală minus legătura nespecifică. Măsoară legarea la receptor, în mod specific.

II. Experiment de concurență: Măsoară legarea în echilibru a unei singure concentrații de radioligand în prezența diferitelor concentrații de concurent nelansat.

Puteți utiliza curbele de competiție pentru a determina afinitatea unui număr mare de compuși nelansați pentru un receptor în screening. IC50 și Ki pot fi derivate din datele de competiție.

• IC50: Concentrația unui ligand concurent care deplasează jumătate din ligandul radioactiv
• Ki: afinitatea unui ligand rece pentru receptor

Nota: Când se modifică concentrația de radioligand, se poate observa o deplasare a IC50 a unui compus de referință; cu toate acestea, Ki rămâne același.

III. Experimente cinetice: Măsurați nivelul de legare la diferite momente pentru a determina constantele de viteză pentru asocierea și disocierea radioligandului.

• Concentrație saturată de ligand adăugat o cantitate legată în timp pentru a determina Kon
• Concentrație ridicată de concurent nemarcat adăugat. și scăderea cantității de legare în timp măsurată pentru a determina Koff

Top

Consiliere și întrebări frecvente

Ideal, veți dori să selectați un radioligand care să aibă următoarele proprietăți:

• Activitate specifică ridicată (> 20 Ci/mmol pentru un ligand tritiat)
• Legătură nespecifică scăzută (liganzii hidrofobi vor prezenta, în general, o legatură nespecifică mai mare)
• Purătate ridicată (de obicei > 90% puritate)
• Selectivitate ridicată
• Stabilitate (dacă va trebui să utilizați radioligandul dvs. pe o perioadă lungă de timp, stabilitatea poate fi un factor important. Liganzii marcați cu 125I ar trebui, în general, să fie utilizați în termen de una până la două luni de la data fabricației. Liganzii tritipați ar trebui să fie utilizați, de obicei, în termen de 3-6 luni de la data fabricației (cu toate acestea, există și excepții).

Când reprezentați grafic datele, vă recomandăm să utilizați concentrația determinată experimental a soluțiilor de lucru ale radioligandului dumneavoastră, mai degrabă decât o concentrație calculată. Unii radioligani se vor lipi de pereții tuburilor dvs. de diluție. Este important să determinați concentrația reală a radioligandului pe care l-ați pipetat. Pentru a determina experimental concentrația unei diluții de radioligand, pipetați câțiva microlitri din tubul de diluție și puneți-i pe un filtru. Este posibil să doriți, de asemenea, să efectuați o diluție de 1/10 din această probă, astfel încât să vă puteți verifica rezultatele. Determinați dpms (dezintegrări pe minut). Convertiți din dpms în Curies folosind următoarea ecuație:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Apoi folosiți activitatea specifică a lotului dumneavoastră de radioligand pentru a converti din Curies în moli. Pentru a determina concentrația radioactivă în acest moment, împărțiți numărul de moli la volumul pe care l-ați reperat pe filtermat.

FAQ-uri

Q. Ce concentrație de radioligand ar trebui să folosesc pentru curba mea de saturație?
A. În general, vă recomandăm să alegeți 3-5 concentrații sub Kd și 3-5 concentrații peste Kd. Cea mai mare concentrație ar trebui să fie de zece ori mai mare decât Kd.

Q.Ce concentrație de radioligand ar trebui să fie selectată pentru legarea competitivă?
A. Radioligandul se utilizează la o concentrație scăzută, de obicei la valoarea Kd sau sub valoarea sa. Dacă activitatea specifică este scăzută, se poate folosi o concentrație peste valoarea Kd, dar aceasta nu trebuie să fie niciodată la sau mai mare decât concentrația de saturație.

Q. Ce tip de ligand ar trebui să folosesc pentru a determina legarea nespecifică în curbele mele de saturație?
A. De obicei, doriți să alegeți un ligand care este diferit de radioligandul dumneavoastră. Doriți să deplasați doar legarea specifică a radioligandului la receptor. Ar trebui să alegeți un ligand care are o afinitate ridicată pentru situsul de legare a receptorului și o afinitate scăzută pentru situsurile de legare nespecifice.

Top

Alte tehnologii PerkinElmer de legare a receptorilor-liganzi

• DELFIA fluorescent receptor-ligand binding assays

Top

Custom Radiochemicals, Cell Lines, Membrane, celule congelate și receptori

PerkinElmer oferă produse radiochimice personalizate, linii celulare și membrane personalizate, microplăci personalizate, microsfere SPA și FlashPlates, precum și dezvoltarea de teste personalizate. Dacă sunteți interesat de servicii personalizate, vă rugăm să contactați echipele noastre personalizate:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top

.