Rezultate și discuții

Structura generală a domeniului TE. Deși structura domeniului TE izolat care a fost rezolvată reprezintă două molecule independente (1 și 2) în unitatea asimetrică (tabelul 1), domeniul a fost purificat și complet activ ca monomer (Z.G. și B.C., date nepublicate). FAS uman nativ este dispus sub forma unui homodimer antiparalel (1) cap-coadă, așa cum a fost vizualizat recent în hărțile de crio-microscopie electronică (crio-EM) (31). Această dispunere ar plasa cele două domenii TE ale monomerilor FAS la capete opuse unul față de celălalt, neavând nicio relevanță funcțională pentru formarea unui dimer. Din aceste motive, dimerul este un artefact al cristalizării. Structura moleculei 1 este considerată în continuare ca fiind reprezentativă pentru structură.

Domeniul TE al FAS uman cuprinde două subdomenii (A și B) (Fig. 1). Subdomeniul mai mare A (≈23 kDa) este alcătuit din două segmente necontinue de la capetele terminale amino- (sau N-) și carboxil- (sau C-) (Fig. 1, 2, 3). Segmentul care intervine este atribuit subdomeniului B mai mic (≈9 kDa). Subdomeniul A are un pliu general α/β, în timp ce subdomeniul B are un motiv α-helicoidal complet. Întreaga structură este alcătuită din nouă α-helice și opt fire β (figurile 1 și 2). Cea mai mare parte a întregii structuri a domeniului TE a putut fi încadrată în densitatea electronică, cu excepția celor trei segmente și a unui reziduu de glicină prezentate în figurile 1, 2, 3, cu densitate lipsă sau slabă, ceea ce indică mobilitatea lor ridicată. Toate segmentele dezordonate se află în regiuni expuse la solvenți și nu sunt nici pe departe implicate în contactele cristaline.

Cele trei reziduuri catalitice ale TE FAS uman (Ser-2308, His-2481 și Asp-2338) sunt legate între ele și de reziduurile învecinate printr-o rețea extinsă de legături de hidrogen (Fig. 4). Grupul hidroxil al Ser-2308 este implicat într-o legătură de hidrogen cooperantă, acceptând de la coloana vertebrală amidică adiacentă a Tyr-2309 și donând la Nε2 a His-2481. Acest lucru, la rândul său, ar facilita activarea Ser-2308 ca nucleofil și ar ajuta la stabilizarea intermediarului tetraedric oxi-anionic care se așteaptă să se formeze în timpul reacției catalitice TE, așa cum se observă în cazul serin-hidrolazelor. Reziduul His-2481 (Nε2) este, la rândul său, legat la hidrogen de Asp-2338 (Oδ2). Asp-2338 (atomul Oδ1) realizează legături de hidrogen suplimentare atât cu amida din coloana vertebrală a lui Ala-2448, cât și cu grupul hidroxil al lui Tyr-2462. Tyr-2462 este complet invariabil, în timp ce Ala-2448 este parțial conservat de la insecte la mamifere (Fig. 3). Prin urmare, interacțiunea dintre aceste reziduuri și reziduul aspartat catalitic pare a fi importantă pentru a menține Asp-2338 fixat în poziția sa particulară, ceea ce semnifică și mai mult rolul important jucat de acest reziduu. Rețeaua extinsă de legături de hidrogen de la nivelul situsului catalitic menține enzima pregătită pentru acțiune prin orientarea și plasarea reziduurilor catalitice în pozițiile necesare, la fel ca în cazul serin-hidrolazelor (40).

Specificitatea situsului de legare a lanțului de palmitoil și a lungimii lanțului. Pentru a obține o înțelegere a mecanismului prin care domeniul TE al FAS reglează specificitatea lungimii lanțului, am analizat structura TE pentru prezența unui șanț în apropierea centrului catalitic care ar putea găzdui substraturi cu lanțuri lungi de acili grași. Este evidentă prezența unei singure caneluri, care este situată la interfața dintre subdomeniile A și B (Fig. 5). Analiza cu ajutorul proshape (a se vedea Materiale și metode) a confirmat prezența șanțului cu un volum de 186,9 Å3 și o suprafață de 140 Å2, al cărui capăt distal formează un buzunar (Fig. 5). Canelura este aproape de terminația amino-terminală a domeniului TE, care este legată de domeniul ACP al FAS care reține lanțurile acililor în creștere pentru scanare și eliberare de către domeniul TE după atingerea lungimii optime a lanțului de acizi grași cu 16 atomi de carbon. Majoritatea reziduurilor care căptușesc șanțul provin din helixul amfifilic α8 al subdomeniului B. Alte reziduuri care contribuie la acesta provin din helixul α5 al subdomeniului B, din helixul N-terminal α1 al subdomeniului A și din bucla dintre β2 și α2 a subdomeniului A. Reziduurile care căptușesc șanțul, care sunt în cea mai mare parte de natură hidrofobă, constau din Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 și Lys-2426 din helixul α8, Phe-2370 și Phe-2371 din helixul α5, Leu-2222, Leu-2223 și Val-2224 din helixul α1 și Ile-2250 și Glu-2251 din bucla dintre β2 și α2 (Fig. 5A ). Dintre aceste reziduuri, Ile-2250, Glu-2251 și Lys-2426 sunt invariante între specii, în timp ce Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 și Phe-2423 sunt în mare parte conservate (Fig. 3). Restul reziduurilor sunt complet conservate la mamifere (Fig. 3). Toate observațiile de mai sus, luate împreună, sugerează că interfața dintre cele două subdomenii este o excelentă regiune de legare a lanțului de acizi grași. S-au întreprins două experimente pentru a oferi credibilitate sugestiei și pentru a obține o perspectivă asupra selectivității lanțului acil gras.

Fig. 5.

Site de legare a lipidelor. (A) Stereoviziune a canelurii de legare a palmitoilului candidat pentru primii 11-12 carboni și a buzunarului pentru ultimii 5-4 carboni. Inhibitorul hexadecil sulfonil este reprezentat ca un model de umplere a spațiului Corey-Pauling-Koltun (C, galben; O, roșu; S, verde). Lanțurile laterale care căptușesc canelura sunt reprezentate ca figuri cu bile și bețe (C, galben; O, roșu; N, albastru). Lanțurile laterale care alcătuiesc situsul activ sunt, de asemenea, reprezentate sub formă de figuri cu bile și bastoane, schema de culori fiind similară cu cea a reziduurilor. Harta suprafeței canelurilor este reprezentată în plasă de sârmă verde. Reziduurile care alcătuiesc șanțul sunt etichetate, cu excepția lui Ile-2250, care nu poate fi văzut deoarece cade sub inhibitor. Cei 11-12 atomi de carbon inițiali din grupul sulfonil sunt expuși la solvent, cu al 11-lea și al 12-lea atom de carbon la gura buzunarului. (B) O vedere diferită a șanțului și a buzunarului. Săgețile denotă rotațiile în trecerea de la orientarea vederii din A la B. Această vedere arată că cea mai mare parte a lanțului acil gras al inhibitorului hexadecil este expusă la solvent.

În primul rând, am demonstrat prin mutageneză dirijată pe site că înlocuirile mai multor reziduuri care căptușesc canelura și buzunarul domeniului TE reduc activitatea TE, deși în proporții diferite (tabelul 2).

Vezi acest tabel:

  • Vezi în linie
  • Vezi popup

Tabelul 2. Mutațiile în canelura de legare candidată scad activitatea TE

În al doilea rând, am reușit să modelăm legarea în canelură a unui inhibitor care conține un lanț palmitoil C16, hexadecyl sulfonyl f luoride (HDSF). Modelarea a fost ghidată de datele din structura cristalină a proteinei palmitoil TE 1 (PPT1) cu hexadecyl sulfonat (HDS) legat covalent (cod ID PDB 1exw; ref. 41) și augmentată prin minimizarea energiei în cns. La fel ca TE, situsul catalitic al PPT1 conține o triadă catalitică conservată de serină, histidină și aspartat. Structura complexului PPT1-HDS a evidențiat formarea legăturii covalente între atomul de sulf al HDS și atomul de oxigen al serinei catalitice și prezența lanțului acilic gras într-un lung șanț de suprafață preponderent hidrofob al proteinei (41). HDS legată covalent modelată în structura TE (prezentată în Fig. 5) a evidențiat mai multe caracteristici ale legării ligandului cu implicații funcționale și biochimice importante. Ajustarea HDS nu a provocat nicio rearanjare majoră a reziduurilor din situsul de legare. Lanțul palmitoil face o curbură ascuțită în raport cu grupul sulfonat într-un mod similar cu cel observat în structura PPT1 legată. Lanțul palmitoil cu 16 atomi de carbon se potrivește bine în șanț, cu primii ≈12 atomi de carbon expuși la solvent și restul de ≈4 atomi de carbon introduși și menținuți în buzunarul distal. Această potrivire este în deplină concordanță cu observația conform căreia FAS TE de mamifere catalizează formarea acidului palmitic ca produs major (20). Prezența ultimilor atomi de carbon ≈4 în buzunar ajută la fixarea lanțului de acizi grași pentru hidroliza substratului palmitoil aciil. Natura situsului de legare, care combină o canelură expusă cu un buzunar închis, este unică și concepută pentru specificitatea acestui TE. Constatarea că domeniul TE al FAS-urilor de mamifere nu prezintă o activitate semnificativă față de lungimi de lanț acil gras mai mici de 14 atomi de carbon (20) poate fi explicată prin legarea neproductivă datorată lipsei de legare și mobilității mai mari a lanțurilor mai scurte expuse. Ultimii ≈4 atomi de carbon ai lanțului palmitoil ocupă parțial buzunarul distal, lăsând suficient spațiu pentru a găzdui doar 2 atomi de carbon suplimentari. Acest rezultat este în concordanță cu pierderea dramatică de activitate observată în cazul substraturilor model mai lungi de 18 atomi de carbon (20). Nu este clar dacă ultimii atomi de carbon ≈4 și ≈6 ai lanțurilor de acizi grași C16 și, respectiv, C18 vor fi introduși într-un buzunar preformat între cele două subdomenii, așa cum se observă în structura formei nelegate, sau vor fi legați inițial de o formă deschisă a domeniului care, ulterior, suferă o mișcare de îndoire a balamalei între subdomenii pentru a cuprinde atomii de carbon terminali ai lanțurilor de acizi grași și pentru a crea configurația productivă a regiunii situsului activ.

S-au făcut eforturi considerabile pentru a cristaliza TE cu diverși analogi ai acizilor grași cu lanț lung (de ex, palmitoil-CoA, myristoil-CoA, stearoil-CoA, acid palmitic, fluorură de hexadecil sulfonil și acid palmitic), dar nu au fost găsite structuri complexe stabile de lungă durată. Majoritatea complecșilor, așa cum s-a demonstrat prin activitate enzimatică independentă sau prin teste de legare radioactivă în soluție, s-au disociat în decurs de 5 minute până la 1 oră, ceea ce îi face nepotriviți pentru cristalizare sau încercări de înmuiere a cristalelor.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Deși a fost descrisă structura de reconstrucție crio-EM de 20 Å a dimerului FAS uman (31), nu a existat nicio indicație privind polaritatea N- la C-terminală a subunității FAS, cu excepția unei indicații anterioare din marcarea cu anticorpi, conform căreia domeniul FAS TE era situat la unul dintre capetele întregii structuri (42). Am încercat o evaluare preliminară a polarității prin andocarea manuală a structurii mai mici (32 kDa) a domeniului FAS TE uman FAS, care ocupă capătul C-terminal al subunității FAS, și a structurii mai mari (42 kDa) E. coli β-cetoacil sintetază I (sau KSI) (cod PDB ID 1ek4) (43), care este un omolog apropiat al domeniului KS N-terminal al FAS de mamifere, în fiecare capăt al unității monomerice desemnate cap și picior din densitatea de masă crio-EM (Fig. 6). Structura TE se potrivește bine în vârful sub-structurii desemnate picior, în timp ce KSI se potrivește cel mai bine în vârful sub-structurii desemnate cap (Fig. 6). În dimerul FAS, domeniul ACP interacționează atât cu domeniul TE al aceluiași monomer, cât și cu domeniul cetoacil-sintetazei din monomerul opus, ceea ce duce la formarea a doi centri activi la cele două capete ale dimerului. Orientarea domeniului TE și a omologului domeniului KS pentru cea mai bună potrivire la picior și, respectiv, la cap, a acomodat atât spațiul, cât și interacțiunea funcțională a moleculei ACP cu ambele proteine. Când structurile au fost schimbate, ajustarea a fost mult mai slabă, cu unele părți ale KSI căzând în afara densității și un volum mai mare de densitate neacoperită în ajustarea TE (Fig. 6).

Fig. 6.

Acordare preliminară a TE (traseu verde al coloanei vertebrale) și KSI (traseu maro) în densitatea de masă crio-EM cu rezoluție de 20Å. Substructurile observate din densitate sunt denumite Head, Torso și Foot. Urma TE se potrivește cel mai bine în substructura desemnată Foot, în timp ce urma KSI se potrivește cel mai bine în substructura desemnată Head. Cea mai bună potrivire atât pentru KSI, cât și pentru TE este încercuită cu roșu. Urmele de coloană vertebrală ale TE și KSI din partea inferioară a densității de masă prezintă ajustări mai puțin satisfăcătoare în cap și, respectiv, în picior. Pe baza experimentelor anterioare de digestie proteolitică a FAS intact, au fost identificate trei domenii: domeniul I, care cuprinde centrele enzimatice KS-AT/MT-DH și regiunea de legătură; domeniul II, care cuprinde regiunea ER-KR-ACP; și domeniul III, care este atribuit TE (1, 2). Substructurile Head și Torso, care sunt în esență coalizate, ar putea corespunde domeniului I și unor părți din domeniul II, iar Foot ar putea reprezenta restul domeniului II și al domeniului III.

Concluzii. Principalele concluzii care pot fi trase din structura cristalină a domeniului TE al FAS uman sunt următoarele. (i) TE este compus din două subdomenii care diferă în ceea ce privește dimensiunea și motivele de pliere. (ii) Subdomeniul A, mai mare, prezintă un motiv α/β, în timp ce subdomeniul B, mai mic, este în întregime elicoidal. (iii) Subdomeniul A contribuie la triada catalitică de reziduuri Ser, Asp și His. (iv) Canelura lungă cu un buzunar distal între subdomeniul B și părți din subdomeniul A constituie locul de legare a lanțului acil gras. Geometria și natura acestui situs sunt în concordanță cu specificitatea ridicată a TE față de substraturile de acili grași C16 până la C18. Canelura acționează ca o riglă care măsoară lungimea corectă a substratului. (v) Ajustarea preliminară a TE în structura crio-EM a FAS uman intact sugerează o polaritate plauzibilă a terminației N spre C a subunităților. Cu toate acestea, este necesară o hartă crio-EM de rezoluție mai mare pentru o verificare suplimentară a potrivirii și o analiză aprofundată a funcției FAS.

.